第3章细菌感染的病原学诊断.docx
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第3章细菌感染的病原学诊断
第3章细菌感染的病原学诊断
第一节标本的收集和处置原则
一、标本收集的一般原则
①初期收集：
最好是病程初期、急性期或症状典型时进行收集，必需在利用抗生素或其他抗菌药物之前。
②无菌收集：
收集的标本应无外源性污染。
收集的标本均应盛于无菌容器内，盛标本的容器须经高压灭菌、煮沸、干热等物理方式灭菌，或用一次性无菌容器，不能用消毒剂或酸类处置。
③按照目的菌的特性用不同的方式收集。
④收集适量标本：
收集量不该过少，而且要有代表性，同时要注意在不同时刻收集不同部位的标本。
如肠热症病人，发病的第1周应收集血液，第2周应收集粪便和尿液，不然会影响检出率。
⑤安全收集：
收集时要避免皮肤和黏膜正常菌群的污染，也要注意安全，避免传播和自身感染。
二、标本的处置
对环境敏感的细菌如流感嗜血杆菌、淋病奈瑟菌和脑膜炎奈瑟菌等应保温并当即送检，其他标本收集后最好在2h之内送到实验室。
若不能及时送检，标本应置于必然环境中保留，如痰、尿、尸检组织、支气管洗液、心包液等标本应保留在4℃环境中，滑膜液、脑脊液等则要在25℃中保留。
一般情形下，用于细菌培育的标本保留时刻不该超过24h。
病人标本中可能含有大量致病菌，必需注意安全防护。
标本切勿污染容器的瓶口和外壁，必需包装好，避免送检进程中倒翻或碰破流出。
对于烈性传染病标本输送时要特别严格，按规定包装，专人输送。
厌氧性标本可放在专门的输送瓶或试管内输送，也可直接用抽取标本的注射器输送。
三、微生物学检查
1．直接镜检标本经涂片染色或制备湿片镜检，有些标本如尿液、脑脊液等通过离心浓缩后镜检，其初步结果有些有诊断参考价值。
直接镜检对于肯定进一步查验步骤及鉴定方式也很有帮忙，还可评价标本是不是符合查验要求。
2．快速诊断微生物学的快速诊断包括：
①特异性抗原检测，用已知抗体检查标本中的未知抗原，包括免疫荧光技术、胶乳凝集实验、酶免疫技术、对流免疫电泳、化学发光免疫测定法等；②核酸检测，用核酸探针杂交和PCR技术快速检出病原微生物；③其他，气-液相色谱法、化学发光法和生物发光测定法。
3．直接药敏实验在分离培育病原体同时，直接将临床标本接种于平板，用抗生素纸片做药物敏感性实验，在18～24h内可取得结果。
该法的长处为快速，接种标本后第二天即可发出报告；不足的地方在于实验时接种量难以标准化，且对混有杂菌和混合感染的标本不易明确其结果，故分离出纯培育物后应再做体外药物敏感实验。
对正常无菌部位收集的血液、尿液、脓液等标本，其直接药敏实验的靠得住性较好；在有正常菌群部位收集的标本，除非显微镜检查提示为单一病原菌感染外，一般不做直接药敏实验。
如在混合培育中有一种以上菌株在直接药敏实验呈不同程度抑菌环或无抑菌环，评定结果时必需谨慎，一般在直接药敏实验后，待分离出纯培育，再用纯培育物做药敏实验。
4．常规查验
（1）分离培育通常在正常无菌部位采取的标本接种血平板中，置于空气或含5%～10%CO2的环境中培育，大部份细菌可于24～48h生长良好。
对于存在正常菌群部位收集的标本，分离时应采用选择培育基以利于病原菌生长，也可加某些抗生素抑制污染菌的生长。
（2）鉴定分离出的细菌一般应通过细菌形态、菌落特点、生化反映、血清学实验、动物接种等鉴定。
（3）体外纯菌药物敏感性实验常常利用方式包括抑菌实验、杀菌实验、联合药敏实验和检测细菌产生的抗生素灭活酶等。
5．报告直接镜检应2h内报告结果，说明标本是不是合格，发觉微生物情形和特点；初步分离鉴定和直接药敏结果于24h或次晨报告可能的病原菌和直接药敏实验结果；除血培育外，所有送检标本必需在24h内预报；对需要进行的补充实验在24h内先做预报；48h内最后报告分离鉴定和抗生素敏感实验结果；厌氧菌于48h预报有关结果，经鉴定和抗生素药敏实验后争取4d内最后报告。
查验报告的评价考虑：
①分离出细菌的质和量；②标本收集的部位；③病人情形。
四、临床微生物实验室安全办法和质量保证
1.临床微生物实验室的安全办法
（1）实验室感染来源①查验操作进程中各个环节都可产生危险的微生物气溶胶。
②接触感染材料；或使之附着于衣服带出室外；和其他偶然事故如菌液滴落于物体表面，注射时不慎刺破皮肤等。
（2）感染性废弃物的处置①去除污染，任何污染材料未经消毒不能拿出实验室；②液体废弃物须搜集在防漏、未破的容器内，用高浓度的化学消毒剂处置；③剩余标本、菌种及接种过的培育基等抛弃前均需消毒；④动物房的废物在处置前及动物笼被清洗前均需消毒，最好经高压蒸汽灭菌；⑤对于有污染的锐器如玻片、注射器、针头等在处置前不要用手接。
2.临床微生物实验室的室内质控
室内质控包括：
①对细菌查验人员的要求；②操作手册；③培育基的质量控制；④试剂、染色液和抗生素的质量控制；⑤仪器设备的功能监测；⑥标本查验的质量控制；⑦标准菌株的来源和保留及室内质量的全面控制。
第二节细菌形态学检查法
一、显微镜检查
1.普通光学显微镜细菌形态学检查中以光学显微镜为常常利用。
普通光学显微镜通常以自然光或灯光为光源，其波长为γm。
在普通光学显微镜下用油镜放大1000倍能够观察到细菌的一般形态和结构。
2.暗视野显微镜用特制的暗视野集光器代替普通光学显微镜上的明视野集光器。
在强光的照射下，能够在黑暗的背景中看到发亮的菌体，明暗反差提高了观察效果，多用于检查不染色的活细菌和螺旋体的形态及运动观察。
3.相差显微镜利用相差板的光栅作用，改变直射光的光相和振幅，将光相的不同转换成光强度的不同，使细菌中部份结构比其他部份深暗。
主要用于检查不染色活细菌的形态及某些内部结构。
4.荧光显微镜以紫外光或蓝紫光为光源，激发荧光物质发光使之成为可见光。
细菌经荧光色素染色后，在荧光显微镜下可激发荧光，在暗色的背景下能够看到发射荧光的细菌。
5.电子显微镜以电子流代替光源，分辨能力大大提高，放大倍数可达数万至数十万倍，能分辨1nm的物体，细菌的表面形态和内部超微结构均能清楚地显现。
但标本需经特殊制片，在干燥真空的状态下检查，不能观察到活的微生物。
有透射电子显微镜和扫描电子显微镜2种,前者适于观察细菌内部的超微结构，后者适于对细菌表面结构及附件的观察。
二、不染色细菌标本的检查
细菌不经染色直接镜检，主要检查生活状态下细菌的动力及运动状况。
常常利用的有压滴法和悬滴法，以普通光学显微镜观察。
如有动力，可看到细菌有明显的方向性位移。
如用暗视野显微镜或相差显微镜观察，则效果更好。
临床上，有时通过不染色标本的动力检查可对某些病原菌作出初步鉴定。
另外螺旋体不易着色并有形态特征，多用不染色标本做暗视野显微镜检查。
三、细菌染色标本检查法
1．常常利用染料多为人工合成的含苯环的有机化合物，在苯环上带有色基与助色基。
按照助色基解离后的带电情形，可将染料分为碱性、酸性与复合染料。
①碱性染料：
电离后显色离子带正电荷，易与带负电荷的被染物结合。
细菌一般情形下都带负电荷，因此，能与细菌结合，细菌学检查中常常利用此类染料。
常常利用的染料有碱性复红、甲紫、美蓝等。
②酸性染料：
电离后显色离子带负电荷，一般细菌带负电荷故不易着色。
酸性染料通常常利用来染细胞浆，常常利用的酸性染料有伊红、刚果红等。
③复合染料（中性染料）：
复合染料是碱性和酸性染料的复合物，如瑞氏染料（伊红美蓝）、姬姆萨染料（伊红天青）等。
2．常常利用的染色方式细菌染色标本在普通光学显微镜下能够观察细菌的形态、大小、排列、染色性、特殊结构（芽胞、荚膜、鞭毛）、异染颗粒等。
细菌染色的大体程序：
涂片（干燥）→固定→染色（初染-媒染-脱色-复染）。
（1）单染色法用1种染料将细菌和周围物体染成同一种颜色，如吕氏美蓝或稀释复红染色法。
可观察其形态、排列、大小及简单结构，不能显示各类细菌染色性的不同。
（2）复染色法用2种或2种以上的染料染色的方式,常常利用的有革兰染色法和抗酸染色。
①革兰染色：
本法是细菌学中最经典、最常常利用的染色方式。
除粪便等极少数标本外，绝大多数标本在分离培育之前都要进行革兰染色镜检。
细菌经涂片干燥固定后先用甲紫初染→水洗后加碘液染色→水洗→95%乙醇脱色→水洗→稀释石炭酸（苯酚）复红染色→水洗→吸干后油镜镜检，结果革兰阳性菌为紫色，革兰阴性菌呈红色。
有时结合细菌特殊形态结构及排列方式，对病原菌可进行初步鉴定，如脑脊髓膜炎病人，取其脑脊液涂片进行革兰染色镜检。
如为革兰阴性、肾形、凹面相对的双球菌，可报告“找到革兰阴性双球菌，形似脑膜炎奈瑟菌”；如为革兰阳性、菌体周围有荚膜的双球菌，可报告“找到革兰阳性双球菌，形似肺炎链球菌”。
革兰染色除用以鉴定细菌外，病原菌革兰染色特性还可为临床选择用药提供参考。
②抗酸染色不作为临床上常规的细菌检查项目，只用于结核病、麻风病等的细菌检查。
疑似结核分枝杆菌感染的标本，经抗酸染色后以油镜检查，即可作出初步鉴定。
将有肺结核症状病人的痰标本，制成涂片后做萋-纳染色镜检，可见（未见）红色抗酸杆菌，即可报告“找到（未找到）抗酸菌”。
（3）荧光染色此法敏感性强，效率高而且容易观察结果。
主要用于结核分枝杆菌、麻风分枝杆菌、白喉棒状杆菌及痢疾志贺菌等的检测。
痰标本涂片、固定，用荧光染料金胺O法（金胺O-罗丹明B法）染色，以荧光显微镜检查，可观察到呈金黄色荧光的菌球。
（4）特殊染色①异染颗粒染色：
观察棒状杆菌属细菌菌体内的异染颗粒。
奈瑟染色菌体呈淡黄褐色，异染颗粒为深蓝色。
阿尔培特染色菌体呈蓝绿色，异染颗粒为蓝黑色。
疑为白喉棒状杆菌感染，除证明为革兰阳性典型棒状杆菌外，还须用异染颗粒染色法镜检异染颗粒，方可初步报告“检出形似白喉棒状杆菌”。
②荚膜染色：
在涂片上加3%沙黄水染液加温染色3min。
菌体呈赤褐色，荚膜呈黄色。
③芽胞染色：
将涂片用孔雀绿水溶液加温染色，再用%沙黄水溶液复染。
菌体呈红色，芽胞呈绿色。
④鞭毛染色：
鞭毛染色后于显微镜可观察到菌体上有无鞭毛、鞭毛的数量及位置，在非发酵菌的鉴定中很重要。
第三节细菌分离培育和鉴定
一、培育基的组成成份
1．营养物质不同的细菌对营养的要求不同，但细菌需要的营养物质应含有氮源、碳源、无机盐类和生长因子等。
（1）蛋白胨最常常利用的成份之一，提供细菌生长繁衍所需要的氮源，含胨、多肽和多种氨基酸，为大多数细菌生长所利用。
易溶于水，遇酸不沉淀，不因受高温而凝固，为两性电解质有缓冲作用。
（2）肉浸液用新鲜牛肉浸泡、煮沸而制成的肉汁。
含有可溶性含氮浸出物和非含氮浸出物，还有一些生长因子。
可为细菌提供氮源和碳源，但所含氮物质过少不能知足细菌的需要，因此在制备培育基应加入1%～2%的蛋白胨和%氯化钠。
（3）牛肉膏由肉浸液经长时刻加热浓缩而制成。
糖类在加热进程中被破坏，其营养价值低于肉浸液，可用作肠道杆菌辨别培育基的基础成份。
（4）糖类、醇类为细菌生长提供碳源和能源。
制备培育基所用的糖类、醇类有多种，常常利用的糖类有单糖、双糖和多糖；常常利用的醇类有甘露醇、卫茅醇等。
葡萄糖、蔗糖主要作为碳源和能源的大体成份，其他糖类和醇类主要用于鉴定细菌所做的发酵反映。
（5）血液血液中含有多种营养物质，又能提供辅酶、血红素等特殊生长因子，用于培育营养要求较高的细菌。
还可按照细菌在血液培育基中的溶血现象而进行鉴定。
（6）无机盐类提供细菌生长的各类元素，如钾、钠、铁、镁、钙、磷、硫等。
最常常利用的有氯化钠和磷酸盐，前者维持酶的活性、调节菌体内外的渗透压，后者是细菌良好的磷源，并具有缓冲作用。
（7）鸡蛋和动物血清不是大体成份，是某些细菌生长所必需的营养物质，仅用于制备特殊的培育基。
如培育结核分枝杆菌的鸡蛋培育基和培育白喉杆菌的吕氏血清培育基等。
（8）生长因子为细菌生长所必需的，需要量很小。
常在肝浸液、肉浸液、酵母浸液和含血液培育基中加入维生素、氨基酸、嘌呤、嘧啶等生长因子。
2.凝固物质制备固体培育基时，需在液体中加入凝固物质。
常常利用凝固物质为琼脂，某些情形下也可用明胶、卵白蛋白、血清等。
琼脂是从石花菜中提掏出来的一种半乳糖胶，温度在98℃以上时可溶于水，在45℃以下可凝固成凝胶状态，不被细菌分解利用，无营养作用。
3.抑制剂和指示剂制备培育基时常加入抑制剂和指示剂，不是细菌生长繁衍所必需的物质，而是选择、鉴定及判断结果的需要。
①抑制剂：
具有选择抑制作用，在制备培育基时加入必然种类的抑制剂，可抑制非检出菌（非病原菌）的生长，利于检出菌（病原菌）的生长。
常常利用有胆盐、煌绿、亚硫酸钠、亚硒酸钠及一些染料和某些抗生素等。
②指示剂：
在培育基中加入必然种类的指示剂，观察细菌是不是利用和分解培育基中的糖、醇类。
常常利用的有酚红、甲基红、中性红、溴甲酚紫、溴麝香草酚蓝和中国蓝等酸碱指示剂。
美蓝常常利用作氧化还原指示剂。
二、培育基的种类
1.基础培育基含有细菌基础生长所需的大体营养成份，最常常利用的是肉浸液，俗称肉汤，主要含牛肉浸液和蛋白胨，用于细菌的增菌、查验，也是制备其他培育基的基础成份。
2.营养培育基基础培育基中加入血液、葡萄糖、生长因子等特殊成份，供营养要求高的细菌和需要特殊生长因子的细菌生长，最常常利用的是血琼脂平板和巧克力血平板等。
3.辨别培育基在某些培育基中加入一些特定物质，如糖、苷、醇类、氨基酸、蛋白质等和指示剂，测定细菌的生化反映，以辨别和鉴定细菌用的培育基。
例如糖发酵管、克氏双糖铁琼脂（KIA）、伊红-美蓝琼脂和动力-吲哚-尿素（MIU）培育基等。
4.选择培育基在培育基中加入抑制剂，抑制标本中杂菌生长，有助于所选择的细菌种类的生长。
如培育肠道致病菌的沙门-志贺琼脂（沙门-志贺琼脂）。
5.特殊培育基某些细菌在生长繁衍时需要特殊的条件才能够生长，包括厌氧培育基和细菌L型培育基等。
前者是培育专性厌氧菌的培育基，后者是针对细胞壁缺损的细菌L型。
三、分离培育基的选择
1.血平板适合各类细菌的生长，一般细菌查验标本的分离，都应接种此平板。
2.巧克力血平板含有Ⅴ和Ⅹ因子，适于接种疑有嗜血杆菌、奈瑟菌等的标本。
3.中国蓝平板或伊红美蓝平板抑制革兰阳性细菌，增进革兰阴性细菌生长，是较好的弱选择性培育基。
发酵型革兰阴性杆菌在此平板上菌落颜色不同，便于辨别菌种。
4.麦康凯平板为中等强度选择性，抑菌力略强，少数革兰阴性菌不生长。
在麦康凯平板上可否生长，是非发酵菌鉴定的一个依据。
5.沙门-志贺琼脂有较强的抑菌力，用于志贺菌和沙门菌的分离。
因选择性过强，影响检出率，使历时最好加一种弱选择平板以配对互补。
6.碱性琼脂或TCBS琼脂用于从粪便中分离霍乱弧菌及其他弧菌。
7.血液增菌培育基用于从血液、骨髓中分离常见病原菌。
8.营养肉汤用于标本及各类细菌的增菌。
如痰标本一般选用血平板、中国蓝/麦康凯、巧克力平板做分离。
中国蓝/麦康凯用于挑选革兰阴性杆菌；血平板则用于肺炎链球菌、白喉棒状杆菌等的分离；而含杆菌肽的巧克力平板则用于挑选嗜血杆菌等。
四、分离培育的大体条件
1.细菌实验室①实验室应安装周密的门窗，避免外界污染；室内禁用风扇，避免细菌散播。
②室内应安装紫外灯，置于操作台上面1m处，工作开始前照射20min。
③室内应备有消毒剂，用于菌液洒溅时的消毒处置。
同时还应备有供手部消毒用的盛有消毒剂的水盆、香皂及水源等。
④操作台须每日用消毒剂擦洗，地面每周至少用消毒剂擦洗1次。
⑤对接收的标本、无菌器具、用过的物品等应分开放置在指定位置，对用过的物品及时进行灭菌处置。
⑥细菌室按照本地气温安装空调设备，同时设置消防设备。
2.无菌实验室①完全封锁，人员出入通道设两道门，其间为缓冲区；②利用前以紫外线消毒30min，按期用乳酸或甲醛熏蒸进行完全消毒；③无菌室内一般分装无菌的培育基及接种传染性强的细菌，不进行常见临床标本的分离及其他操作；④操作人员进入无菌室时应着隔离衣和专用鞋，操作时戴口罩；⑤条件有限的实验室可用超净工作台进行相关操作，超净工作台应选择垂直气流通风方式；⑥配备空调设备。
3.大体设备和器具①恒温培育箱、CO2培育箱、厌氧培育设备；②显微镜；③高压蒸汽灭菌器、干烤箱；④冰箱和冷藏柜；⑤接种器具，包括接种环和接种针；⑥pH计；⑦火焰灯或酒精灯；⑧其他各类必用的平皿、试管、吸管等玻璃器皿和离心机、天平等。
五、细菌的接种与分离技术
决定接种方式的因素有标本来源、培育目的及所利用培育基的性状。
1.平板划线分离法使标本中混杂的多种细菌在培育基表面分散生长，形成各自菌落，以便按照菌落的形态及特征，挑选单个菌落进行纯培育。
常常利用的有以下几种。
①持续划线分离法：
用于杂菌不多的标本。
用接种环取少量标本，于平板的1/5处密集涂布，做曲线持续划线接种，线与线间有必然距离，划满为止。
②分区划线分离法：
用于杂菌量较多的标本。
一般分为4个区，将标本均匀涂布于第1区，约占平板1/5面积，再在二、3、……区依次持续划线。
每划完1区，接种环灭菌1次。
每一区的划线均接触上一区的接种线1～2次，使菌量逐渐减少以取得单个菌落。
2.斜面接种法主要用于单个菌落的纯培育、保留菌种或观察细菌的某些特性。
用灭菌接种环取少量细菌或单个菌落，从斜面底部向上划一条直线，然后从底部向上做持续曲线划线，一直划到顶端。
3.液体接种法多用于液体生化管的接种和增菌培育。
用灭菌接种环取少量菌，在液面试管与内壁交接处的管壁上轻轻研磨，使细菌与培育液混合。
4.穿刺接种法常常利用于半固体培育基、明胶及双糖管的接种。
多用于菌种保留，细菌动力观察和细菌某些特性的观察等。
用灭菌接种针取少量细菌，从半固体培育基中央垂直刺入，接近管底但不可接触管底，然后接种针沿原路退出。
5.倾注平板法常常利用于测定牛乳、饮水和尿液等标本的细菌数。
将标本经适当稀释后，取必然量加入已灭菌平皿内，倾入已溶化并冷却至45℃的培育基，混匀，待凝固后倒置培育，按照培育基内的菌落数和稀释倍数计算出标本的细菌数。
6.涂布接种法常常利用于纸片法药敏测定，也可用于细菌计数。
加必然量的被检菌液于平板表面，然后用灭菌L型玻璃棒反复涂布使被检物均匀散布在琼脂表面。
贴上药敏纸片培育并观察结果。
六、细菌培育的方式
1.需氧培育法适用于需氧和兼性厌氧菌的培育。
将已接种好的平板、斜面、液体培育基，置于35℃温箱中孵育18～24h，一般细菌即可生长，有些难以生长的细菌（如结核分枝杆菌）则需延长培育时刻。
有的细菌最适生长温度是28～30℃，如鼠疫耶尔森菌；有的乃至在4℃也能生长，如李斯特菌。
2.二氧化碳培育法有些细菌在第一次分离培育时，须在5%～10%CO2的环境下才能生长良好，如流感嗜血杆菌、脑膜炎奈瑟菌、淋病奈瑟菌、牛布鲁斯菌等。
二氧化碳培育方式主要有3种。
①二氧化碳培育箱：
适用于大型实验室应用。
②烛缸法：
将已接种好的培育基放入干燥器内，并放入点燃的蜡烛。
干燥器盖的磨口处涂上凡士林，盖上盖子，烛光因缺氧自行熄灭，现在干燥器内CO2含量为5%～10%，然后将干燥器放入35℃温箱内培育18～24h即可，少数菌种需培育3～7d或更长。
③化学法：
按每升容积加入碳酸氢钠0.4g和浓盐酸的比例，别离置于容器内（如平皿内）。
将容器连同已接种的培育基放入干燥器内，盖紧干燥器的盖子，倾斜容器使碳酸氢钠与浓盐酸接触生成CO2。
3.厌氧培育法适用于兼性厌氧菌和专性厌氧菌培育。
常常利用的有：
①厌氧罐法；②气袋法；③厌氧手套箱法；④庖肉培育基法；⑤焦性没食子酸法。
七、细菌的生长现象
1.分离培育基上菌落的生长现象
（1）观察菌落的表面特征包括：
大小、形状、突起、边缘、颜色、表面、透明度和黏度等。
菌落一般分为滑腻型菌落、粗糙型菌落和粘液型菌落。
（2）血琼脂上的溶血：
①α溶血，菌落周围为草绿色溶血环；②β溶血，菌落周围形成清楚透明的溶血环；③γ溶血，菌落周围无溶血环；④双环，在菌落周围完全溶解的晕圈外有一个部份溶血的第二圆圈。
（3）气味：
有些细菌在平板上生长繁衍后可产生特殊气味，如铜绿假单胞菌（生姜气味）、变形杆菌（巧克力烧焦的臭味）、白假丝酵母菌（酵母味）、厌氧梭菌（腐败的恶臭味）、放线菌（泥土味）等。
2.细菌在液体培育基中的生长现象①大多数细菌生长繁衍后呈现均匀浑浊；②少数链状细菌，如炭疽芽胞杆菌、链球菌等则为沉淀生长；③结核分枝杆菌、枯草芽胞杆菌和铜绿假单胞菌等专性需氧菌一般呈表面生长，常形成菌膜。
3.细菌在半固体培育基中的生长现象半固体培育基用于观察细菌的动力，有动力的细菌在穿刺线的双侧都可见有浑浊或小菌落。
八、细菌L型的检查
培育的L型细菌菌落常出现油煎蛋样（荷包蛋样）菌落（典型L型菌落）、丝状菌落（F型）和颗粒型菌落（G型）3种类型。
生物学特性为形态多形性、染色不肯定性、渗透压敏感性，可滤过性、生化反映减弱特性和对β内酰胺类等细胞壁抗生素的抵抗性。
1.标本收集与培育方式血液、胸腹腔积液、尿液标本及其他穿刺液标本，应当即送检。
粪便、阴道分泌物等易污染标本。
用无菌生理盐水稀释后滤膜过滤，取滤液接种。
若标本不能及时接种，应加入20%蔗糖无菌溶液或高渗肉汤增菌培育基。
标本应先接种高渗肉汤增菌，出现浑浊或沉淀后，再转种L型平板和血平板37℃培育2～7d。
L型菌在L型平板的典型菌落为“油煎蛋”样（荷包蛋样），但病人标本中新分离菌落常不典型，多呈颗粒状菌落，染色呈多形性，必要时需传代返祖进一步鉴定。
2.查验报告①血平板无菌落生长，L型平板有菌落生长，可报检出L型菌。
②血平板中菌落细小，不易刮下。
细菌呈多形性，细胞壁有缺损，L型平板中有菌落生长，可报检出L型菌。
③血平板及L型平板均有菌落生长。
细菌有原菌及L型2种形态，可报告细菌型及L型同时存在，并做药敏实验。
九、碳水化合物（糖类）的代谢实验
1.糖（醇、苷）类发酵实验
（1）原理各类细菌含有发酵不同糖（醇、苷）类的酶，分解糖类的能力各不相同，细菌分解糖类后的终末产物亦不一致，可利用此特点以辨别细菌。
（2）培育基培育基中加入%～1%的糖类、醇类、苷类，可分为液体、半固体、固体或微量生化管几种类型。
（3）方式将分离的纯种细菌，以无菌操作接种到糖（醇、苷）类发酵培育基中，于培育箱中培育数小时至２周，观察结果。
（4）结果①若能分解糖（醇、苷）类产酸时，培育基中的指示剂呈酸性反映；②若产气可使液体培育基中倒管内或半固体培育基内出现气泡，固体培育基内有裂隙等现象；③若不分解，培育基中除有细菌生长外，无任何其他转变。
（5）应用鉴定细菌最主要和最大体的实验，特别对肠杆菌科细菌的鉴定尤其重要。
2.氧化-发酵实验（O/F实验）
（1）原理细菌在分解葡萄糖的进程中，必需有分子氧参加的，称为氧化型；能够进行无氧降解的，称为发酵型。
氧化型细菌在无氧环境中不能分解葡萄糖，发酵型细菌在有氧或无氧环境中都能分解葡萄糖。
不分解葡萄糖的细菌称为产碱型。
可区分细菌的代谢类型。
（2）方式待检菌同时穿刺接种2支HL培育基，其中一支滴加无菌的液状石蜡，高度很多于1cm，于35℃培育48h或更长。
（3）结果①均无转变为产碱型或不分解糖型；②均产酸为发酵型；③仅不加石蜡的培育基产酸为氧化型。
（4）应用主要用于肠杆菌科细菌与非发酵菌的辨别，前者均为发酵型，而后者一般为氧化型或产碱型。
也可用于葡萄球菌与微球菌间的辨别。
3.β-半乳糖苷酶实验（ONPG实验）
1.原理有的细菌可产生β-半乳糖苷酶，分解邻-硝基酚-β-D-半乳糖苷（ONPG），而生成黄色的邻-硝基酚，在很低浓度下也可检出。
2.方式克氏双糖铁培育基上取菌，在无菌生理盐水中制成菌悬液，加1滴甲苯并充分振摇，使酶释放。
于37℃中水浴5min，加入ONPG试剂，水浴20min～3h观察结果。
3.结果菌悬液呈现黄色为阳性反映，一般在20～30min内显色。
4.应用迅速及迟缓分解乳糖的细菌为阳性，不发酵乳糖的细菌为阴性。
主要用于迟缓发酵乳糖菌株的快速鉴定。
4.七叶苷水解实验
（1）原理某些细菌可将七叶苷分解成葡萄糖
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