生化技术课程实习山茱萸超临界提取.docx

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生化技术课程实习山茱萸超临界提取

实习报告

实习名称

生化技术课程实习

系别

生物与化学工程系

年级专业

学生姓名

指导老师

邵阳学院

2011年12月15日

一、实习时间、地点和实习单位

1、实习时间：

2011年11月30日——2011年12月10日

2、实习地点和单位：

3栋109室

二、实习过程概述

11月30日课程实习动员大会

12月1日准备实验材料（挑选山茱萸、干燥、粉碎待用）

12月2日加携带剂超临界萃取（老师指导、实验）

12月5日查询相关资料、并提及有机溶剂萃取的方案

12月6日无携带剂超临界萃取、有机溶剂萃取准备

12月7日有机溶剂萃取液分离

12月8日学习使用高效液相色谱

12月9日高效液相色谱处理样品液

12月10日整理材料及结果处理

三、实习内容

<一>、超临界CO2萃取山茱萸中有效成分熊果酸

1、材料与仪器

1）材料：

山茱萸、乙醇、CO2气体

2）仪器：

超临界CO2萃取装置、恒温箱、植物样本粉碎机

2、原理

超临界CO2萃取是利用欲分离物质与杂质在超临界CO2中溶解度不同而达到分离的一种萃取技术。

超临界流体兼有气、液两者的特点，密度接近于液体，粘度和扩散系数接近于气体，它不仅具有与液体溶剂相当的溶解能力，而且具有优良的传质性质。

超临界流体CO2萃取技术就是利用这种超临界流体的特殊性质，在高压条件下与待分离的固体或液体混合物接触，有效成分能溶解在超临界流体CO2，通过调节系统的操作压力和温度，可萃取所需要的物质。

随后通过降压或升温的方法，降低超临界流体CO2的密度，使萃取物溶解度降低，使目的物与超临界流体分离，萃取得到有效成分即目的物。

3、实验操作

1）、材料准备

选择优质的山茱萸材料，去除其中的杂质，称取1公斤山茱萸在70—100°C烤箱中烘烤3—4个小时至完全干燥为止。

用粉碎机粉碎（过40目筛），粗粉要再次粉碎，直到能过40目筛。

2）、萃取

称取100g粉碎的山茱萸装入萃取缸并把萃取缸安装好，在压力为20MPa、温度为40°C下萃取3—4小时。

并按CO₂超临界萃取装置使用说明书（见附页）开机进行萃取操作：

（注意：

一定要在熟练掌握原理和操作规则情况下才正式开机操作。

）

无携带剂超临

界萃取方案：

100g山茱萸粉末萃取2h压力：

18.5Pa

萃取温度：

40.6℃分离温度

（一）45℃

（二）50℃

3）、收集萃取物

在收集萃取物之前，应准备2个洗干净并烘干的250ml锥形瓶。

待萃取了2小时候再用锥形瓶分别装取第一次萃取分离和第二次萃取分离的萃取物。

具体操作按说明书。

最后收集完后，用封口膜封好锥形瓶，贴好标签并标好组号，时间等。

保存好以备后面实验。

4）、记录

应认真记好实验数据，包括实验的条件（如萃取温度、压力、萃取时间等），实验结果和实验现象等。

5）、仪器清理

做完实验后，应依次用自来水，蒸馏水和无水乙醇侵袭萃取缸和分离缸。

清理打扫实验现场，包括试验台卫生，实验室卫生。

注意关掉萃取装置总电源。

<二>、加携带剂超临界CO2萃取山茱萸有效成分熊果酸

1、材料、仪器与设备

材料：

山茱萸

仪器：

超临界CO2萃取装置、植物样本粉碎机

试剂：

乙醇

2、原理

超临界CO2萃取是利用欲分离物质与杂质在超临界CO2中溶解度不同而达到分离的一种萃取技术。

超临界流体兼有气、液两者的特点，密度接近于液体，粘度和扩散系数接近于气体，它不仅具有与液体溶剂相当的溶解能力，而且具有优良的传质性质。

超临界流体CO2萃取技术就是利用这种超临界流体的特殊性质，在高压条件下与待分离的固体或液体混合物接触，有效成分能溶解在超临界流体CO2，通过调节系统的操作压力和温度，可萃取所需要的物质。

随后通过降压或升温的方法，降低超临界流体CO2的密度，使萃取物溶解度降低，使目的物与超临界流体分离，萃取得到有效成分（即目的物）。

携带剂是在超临界萃取过程中为了提高分离效果，在超临界流体中添加少量的另一种溶剂（如水、乙醇、丙醇等）。

使用携带剂对结果有明显的影响。

通常因加入携带剂可显著提高超临界萃取的分离效果。

不同携带剂对有效成分的萃取影响不同。

通过实验可以找出有效成分的最佳携带剂。

3、操作步骤

1）、材料的准备选择好山茱萸材料，把其中的杂质去掉，称取1公斤山茱萸在70℃—100℃烤箱中烘烤3—4小时至完全干燥为止。

用粉碎机粉碎（过40目筛），粗粉要再次粉碎，直到能过40目筛。

2）、加携带剂萃取称取100g粉碎的山茱萸装入萃取缸安装好，在压力为30MPa、温度为40℃下、按说明书操作加入100Ml无水乙醇携带剂。

并按CO2超临界萃取装置使用说明书开机进行萃取操作，萃取3-4小时。

（注意；一定要在熟练掌握原理和操作规则情况下才正式开机操作。

）

无携带剂超临

界萃取方案：

100g山茱萸粉末萃取2h无水乙醇100ml压力：

17.5Pa

萃取温度：

40.6℃分离温度

（一）45℃

（二）50℃

3）、收集萃取物在收集萃取物之前，应准备4个洗干净并烘干的250ml锥形瓶。

每萃取1个小时收集一次，具体操作按说明书。

最后收集完后，用封口膜封好锥形瓶，贴好标签并标好组号，时间等。

要保存好以备后面实验。

4）、记录应认真记号实验数据，包括实验的条件（如萃取温度、压力、萃取时间和加入携带剂的种类和数量等），实验结果和实验现象等。

5）、仪器清洗做完实验后，应依次用自来水，蒸馏水和无水乙醇清洗萃取缸和分离缸。

清理打扫实验现象，包括实验台卫生，实验室卫生。

特别提醒注意关掉萃取装置总电源。

<三>有机溶剂萃取山茱萸有效成分熊果酸

1、材料与仪器

试剂：

熊果酸、乙醇、甲醇

仪器：

500ml的试剂瓶

挑选山茱萸并干燥粉碎待用、用无水乙醇配置80%的乙醇。

称取山茱萸100g，再用配好的乙醇溶液按料液比5:

1的比例浸泡粉碎的山茱萸，倒入500ml的试剂瓶。

浸泡三十个小时后过滤分离（从十一点到第二天十六点）。

量取分离后的滤液体积（共356ml）。

有机溶剂萃取法：

80%的乙醇料液比5:

1浸取时间：

30h

<四>分离液的预处理

1、材料与仪器

仪器：

铁架台、定性滤纸、漏斗、玻璃棒、3个50ml容量瓶

试剂：

甲醇

2、操作步骤

1）、夹带剂萃取分离液的预处理

每次量取5ml甲醇,清洗分离液1，清洗三次并把清洗液倒入50ml的容量瓶A。

每次量取5ml甲醇，清洗分离液2，清洗两次并把清洗液倒入50ml容量瓶A，并定容。

2）、无夹带剂萃取分离液的预处理

用上述同样的方法，制取无夹带剂的萃取分离液，定容到50ml的容量瓶中。

<五>、HPLC法测定萃取物中有效成分熊果酸的含量

1、材料、仪器与设备

仪器：

HPLC装置、电子天平、色谱柱

材料：

熊果酸标准样品

试剂：

无水甲醇

2、原理

高效液相色谱（HPLC）又称高速或高压液相色谱。

该方法是吸收了普通液相层析和气相色谱的优点，经过适当改进发展起来的。

它既有普通液相层析的功能（可在常温下分离制备水溶性物质），又有气相色谱的特点（即高温、高速、高分辨率和高灵敏度）；它不仅适用于很多不易挥发、热分解难的物质（如金属离子、蛋白质、肽类、氨基酸及其衍生物、核苷、核苷酸、核酸、单糖、寡糖和激素等）的定性和定量分析，而且也适用于上述物质的制备和分离。

高效液相色谱按其固定相的性质可分为高效凝胶色谱、疏水性高效液相色谱、反相高效液相色谱、高效离子交换液相色谱、高效亲和液相色谱以及高效聚焦液相色谱等类型。

用不同类型的高效液相色谱分离或分析各种化合物的原理基本上与其相对应的普通液相层析相似。

其不同之处首先是高效液相色谱灵敏度、快速、分辨率高、重复性好，且需在色谱仪中进行；其次是样品液和流动相溶液在进入色谱柱前，必须超滤处理，这样可提高色谱柱的使用寿命。

HPLC的构造如下：

（1）、进样系统

采用隔膜注射进样器或高压进样阀完成进样操作，进样量是恒定的，在分析操作中通常进样量是20μl。

（2）、输液系统

包括高压泵、流动相贮存器和梯度仪三部分。

（3）、分离系统

该系统包括色谱柱、连接管和恒温器等。

色谱柱是核心部分，其大小是根据使用目的、样品数量及其复杂程度决定的。

色谱柱长度一般为5—70cm，直径为1—50mm，通常分析型色谱柱的体积比制备型的小，并偏向细而长，而制备型色谱柱的体积大，直径也比较大。

在HPLC中的色谱柱是优质不锈钢或厚壁玻璃管或钛合金等材料制成，柱内装有直径为5—10μm（分析型）或数十微米（制备型）粒度的固定相。

固定相中的基质是由机械强度高的树脂或硅胶构成，它们都有惰性（如硅胶表面的硅醇基团基本已除去）、多孔性（孔径可达1000Å）和比表面积大的特点，加之其表面经过机械涂渍（与气相色谱中固定相的制备一样），或者用化学法偶联各种基团（如磺酸基、季胺基、羟甲基、苯基、氨基或各种长度碳链的烷基等）或配体的有机化合物。

因此，这类固定相对结构不同的物质有良好的选择性。

另外，固定相基质粒度小，柱床极易达到均匀、致密状态，极易降低涡流扩散效应。

这些对缩小谱带宽度、提高分辨率是有益的。

根据柱效理论（即塔板理论数N与理论塔板高度H成反比，而理论塔板高度H与颗粒度的平方成正比）分析，基质粒度越小，塔板理论数N就越大。

这也进一步证明基质粒度小，会提高分辨率的道理。

（4）、检测系统

高效液相色谱常用的检测器有紫外检测器、示差折光检测器、荧光检测器三种。

（5）、数据处理系统

该系统可对测试数据进行采集、贮存、显示、打印和处理等操作，使样品的分离、制备或鉴定工作能正确开展。

3、操作步骤

1）、标准样器的配制

用电子天平精确称取熊果酸标准样品1.5mg置于2mlEP管中，移液器精确量取1ml无水甲醇（色谱纯）加入EP管中，使熊果酸充分溶解于甲醇中，即得1.5g/ml的标准液。

2）、样品的制备

将前面得到的超临界CO2萃取物分别先用色谱纯甲醇充分溶解，再定容至50ml、过滤，取滤液2ml置于2ml离心管中，离心5分钟（10000r/min）,取上清液放于2ml离心管中用于HPLC定性定量分析。

3）、上样层析

色谱条件：

色谱柱YWG-C18（250mmX4.5mm,10μm）流动相：

甲醇，流速：

1.0ml/min；紫外检测器波长215nm；柱压：

0～30Mpa；进样量20μl；柱温，室温。

准备好HPLC装置，分别用标样和样品层析，采集数据，并打印好色谱图。

4）计算

用面积归一法通过标准样品峰面积和含量与样品峰面积与含量的关系算出样品的含量。

四、实验结果与分析

序号保留时间名称浓度峰面积

13.97095.531520434

22.755熊果酸1.90113076990

33.5700.92090

总计98.3514597424

无携带剂超临界萃取的图谱

序号保留时间名称浓度峰面积

13.78395.53514524

22.735熊果酸1.9012149495

33.5700.992090

总计98.352664019

熊果酸标样图谱

序号保留时间名称浓度峰面积

13.93095.530

22.629熊果酸1.90175170682

33.5700.92090

总计98.3575170682

有机溶剂超临界萃取图谱

序号保留时间名称浓度峰面积

13.93095.530

22.850熊果酸1.90118588504

33.7480.920920213384

加携带剂超临界萃取图谱

通过熊果酸标样可以看出，熊果酸标样保留时间2.735左右处洗脱量最大。

可以用峰面积比可以求出标样中的熊果酸含量。

标样浓度为Co。

峰面积为s=2149495

计算公式:

Cx/Co=S/s

（1）、无携带剂超临界萃取中熊果酸的浓度为C1：

无携带剂超临界萃取中，保留时间为2.755时洗脱值最大，去保留时间为2.755时的峰面积S：

13076990

C1=Co*S/s=1.5*13076990/2149495=0.608Cog/ml

100g熊果酸通过无携带剂超临界萃取的量为20.62Cog

（2）、有携带剂超临界萃取中熊果酸的浓度为C2：

无携带剂超临界萃取中，保留时间为2.850时洗脱值最大，去保留时间为2.755时的峰面积S2：

18588504

C2=Co*S2/s=Co*18588504/2149495=0.864Cog/ml

100g熊果酸通过加携带剂超临界萃取出的量为43.2Cog。

（3）、有机溶剂萃取中熊果酸的浓度为C3：

无携带剂超临界萃取中，保留时间为2.629时洗脱值最大。

从高效液相色谱的峰可以看出，熊果酸并没有完全分离开，该峰面积无实际意义。

（4）、实验分析和实验总结

通过实际的对比可知，加携带剂的二氧化碳超临界萃取分离熊果酸的效果明显比没加的好。

熊果酸是极性物质，加入极性物质乙醇分离效果明显、相似相容原理。

有机溶剂的萃取出的产物中含有的杂质较多，很难得到相对纯度效高的熊果酸。

实际生产中为了得到纯度较高的熊果酸应该采取加极性携带剂的二氧化碳超临界萃取。

五、实习收获和重要心得体会

实习中学会了使用二氧化碳超临界萃取仪的原理和操作步骤、高速离心机的原理和操作步骤。

更重要的学会了怎样去解决问题处理问题的方法。

只要扎扎实实去学习任何问题可以比较容易的得以解决。

实习中学到点知识无论对今后的学习研究还是生活都有很大的帮助。

整个实习过程中，感谢有老师的认真指导，让我学到的知识更多。

六、存在不足和建议

实验中由于查询的数据不太准确导致实验中分离的效果不好，希望在今后的实验中对实验数据的安排有更加准确的把握。

七、其他