pcr扩增实验报告.docx

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pcr扩增实验报告

pcr扩增实验报告

　　篇一：

DNA提取及PCR扩增实验报告

　　PCR扩增及DNA琼脂糖凝胶电泳

　　刘琳1131428环境科学

　　一、实验目的

　　1．学习并掌握PCR扩增的基本原理与实验技术。

　　2．对扩增后的DNA进行琼脂糖凝胶电泳试验，并分析相应结果。

　　二、实验原理

　　1.PCR扩增

　　多聚酶链反应（PCR）技术的原理类似于DNA的天然复制过程。

在微量离心管中加入适量缓冲液，加入微量模板DNA、四种脱氧核苷酸（dNTP）、耐热Taq聚合酶及两个合成DNA的引物，而后加热使模板DNA在高温下（94℃）变性，双链解链，这是所谓变性阶段。

降低溶液温度，使合成引物在低温（55℃）与模板DNA互补退火形成部分双链，这是所谓退火阶段。

溶液反应温度升至中温（72℃），在Tap酶作用下，用四种dNTP为原料，引物为复制起点，模板DNA的一条双链在解链和退火之后延伸为两条双链，这是延伸阶段。

如此反复，在同一反应体系中可重复高温变性、低温退火和DNA合成这一循环，使产物DNA重复合成，并在重复过程中，前一循环的产物DNA可作为后一循环的模板DNA而参与DNA的合成，使产物DNA的量按指数方式扩增。

经过30～40个循环，DNA扩增即可完成。

　　2.DNA琼脂糖凝胶电泳实验

　　DNA分子在高于其等电点的溶液中带负电，在电场中向阳极移动。

在一定的电场强度下，DNA分子的迁移速度取决于分子筛效应，即分子本身的大小和构型是主要的影响因素。

DNA分子的迁移速度与其相对分子量成反比。

不同构型的DNA分子的迁移速度不同。

该电泳方法以琼脂凝胶作为支持物，利用DNA分子在泳动时的电荷效应和分子筛效应，达到分离混合物的目的。

　　三、实验材料

　　仪器：

PCR扩增仪、薄壁管、离心管、移液枪、枪头、微波炉、电泳仪、水平电泳槽、制胶版、紫外透射仪。

　　试剂：

TapDNA聚合酶、dNTP、buffer、两种引物、16S全长DNA样本、无菌ddH2O、模板DNA、TBE、琼脂糖、EB、显色剂。

　　四、实验步骤

　　1.PCR扩增

　　本次试验选择细菌16SrDNAV3区片段进行扩增。

　　根据计算，首先取离心管按照10×Buffer、1uldNTP、ul341GC、ul534、ulTaq、ddH2O的比例配置足量的PCR反应体系。

　　分别向9个薄壁管中分别加入24ul的反应体系，并分别添加8种不同的模版，并于第9个薄壁管中加入无菌ddH2O作为阴性对照。

　　将薄壁管放入PCR扩增仪中，按照预定程序进行PCR扩增。

其中循环过程需要达到30~40次。

程序如下：

　　预变性：

94℃3min

　　循环：

94℃变性30s

　　55℃退火30s

　　72℃延伸30s

　　末次延伸：

72℃5min

　　PCR扩增完成后，将样品取出并保存于15℃环境中。

　　2.DNA琼脂糖凝胶电泳实验

　　称取琼脂糖粉末，放到一锥形瓶中，加入适量的×TBE电泳缓冲液。

然后置微波炉加热至完全溶化，溶液透明。

摇匀，待冷却至60℃左右，在胶液内加入适量的EB。

　　取有机玻璃制胶板槽，在一端插好梳子，在槽内缓慢倒入已冷至60℃左右的胶液，使之形成均匀水平的胶面。

　　待胶凝固后，小心拔起梳子，使加样孔端置阴极段放进电泳槽内。

　　在槽内加入×TBE电泳缓冲液，至液面覆盖过胶面。

取1μl缓冲液和5μl待测DNA样品混合后，用移液枪滴加至凝胶的加样孔中。

　　接通电泳仪和电泳槽，并接通电源，调节稳压输出，电压最高不超过5V/cm，开始电泳。

点样端放阴极端。

根据经验调节电压使分带清晰。

　　观察溴酚兰的带（蓝色）的移动。

当其移动至距胶板前沿约1cm处，可停止电泳。

　　在紫外透视仪的样品台上重新铺上一张保鲜膜，赶去气泡平铺，然后把凝胶放在上面。

关上样品室外门，打开紫外灯，通过观察孔进行观察。

　　五、实验结果与讨论

　　如图所示：

从左至右，分别是模版

　　1-8号，第9列为阴性对照。

　　前8列均有明显的条带出现，而阴

　　性对照无显示，说明扩增整体效果很

　　好。

图中有上下两条线，上面一条线所

　　覆盖的条带基本可以代表扩增的产生

　　的片段位置，参照图可以看出扩增片段

　　在200bp左右。

在第9个阴性对照的第

　　二条线处可以看到较为模糊的条带，并

　　非是出现假阴性，而是由于二聚物而产

　　生的条带。

通过该条带与最右侧的

　　marker对比可知该片段出现在100bp左

　　右，并非由于实验操作等问题而产生的

　　污染。

　　实验的照片显示实验结果有拖尾

　　现象，但是并不影响后续实验。

在实验

　　过程中由于有些试剂加到了管壁上面，

　　并没有完全加入，可能会出现一些误

　　差。

另外在第1列条带中出现了其他的亮带，可能是由于在前期的扩增实验中滴加试剂时由于量过少而进行的摇匀和融合等操作产生了非特异性扩增，也有可能是因为胶板制作过程中梳子的位置不合适或者胶板制作时边缘处不够均匀导致产生污染。

但总体而言，实验结果较为满意。

　　六、实验注意事项

　　1.由于PCR技术非常敏感，可使一个DNA分子得以扩增，装有PCR试剂的离心管打开之前，应先在微量离心机上作瞬间离心使液体沉积于管底。

PCR扩增反应的条件，要控制好温度、时间和循环次数。

　　2.最好在加完所有其它反应成分后才加模板DNA。

　　3.配琼脂糖时应使其完全溶化后方可制胶。

　　具有致癌作用，配制及使用时应带一次性手套。

并在专门的实验室内使用。

　　七、实验收获

　　1.通过本次实验学习并掌握了PCR反应的基本原理、实验过程及技术。

　　2.通过本次实验掌握了电泳实验分离DNA的原理和方法。

　　八、思考题

　　1、如果你的研究中要扩增大肠杆菌某个酶的基因，你如何进行相关实验？

　　通过PCR扩增出想要的片段，然后通过凝胶电泳实验进行回收，并与合适的载体连接，转化进感受态细胞。

经过培养提取质粒，进行酶切或PCR验证，测序最终验证，保存菌种

　　2.一对引物序列为5‘-GACTCCAGTCGAATCTACCA-3’和

　　5‘-AACCGTGGCGACACCGCTAA请计算它们的Tm值及选择合适的退火温度，如果按你算的退火温度做PCR时没有得到相应的产物，你怎么解决？

　　5‘-GACTCCAGTCGAATCTACCA-3’

　　Tm值=4（G+C）+2-

　　=4（3+7）+2（6+4）-

　　=60℃-

　　=50~55℃

　　5‘-AACCGTGGCGACACCGCTAA’

　　Tm值=4（G+C）+2-

　　=4+2-

　　=64℃-=54~59℃

　　因此退火温度可以选择在55℃

　　可以通过分析几个逐步提高退火温度的反应以提高特异性。

开始低于估算的Tm5℃，以2℃为增量，逐步提高退火温度。

较高的退火温度会减少引物二聚体和非特异性产物的形成。

为获得最佳结果，两个引物应具有近似的Tm值。

引物对的Tm差异如果超过5℃，就会令引物在循环中使用较低的退火温度而表现出明显的错误起始。

如果两个引物Tm不同，将退火温度设定为比最低的Tm低5℃或者为了提高特异性，可以在根据较高Tm设计的退火温度先进行5个循环，然后在根据较低Tm设计的退火温度进行剩余的循环。

这使得在较为严紧的条件下可以获得目的模板的部分拷贝。

　　篇二：

PCR实验报告

　　普通生物学实验报告

　　实验名称：

用PCR扩增的方法鉴别不同物种来源的肌肉

　　一、特异性目的片段DNA的扩增

（一）实验原理

　　聚合酶链式反应（PolymeraseChainReaction,PCR）是体外酶促合成特异DNA片段的一种方法，其基本原理为DNA的半保留复制。

PCR技术由①高温变性模板；②引物与模板退火；③引物沿模板延伸这3步反应组成一个循环，通过多次循环反应，目的DNA得以迅速扩增。

其主要步骤是：

将模板DNA置于高温下（通常为93℃-94℃），使其变性解成单链；人工合成的两个寡核苷酸引物在其合适的复性温度下分别与目的基因的两条单链互补结合；热稳定DNA聚合酶（Taq酶）在72℃将单核苷酸从引物的3’端开始掺入，以目的基因为模板按5’→3’的方向延伸，合成互补链。

　　本实验采用物种特异性引物扩增的方法来鉴定3种不同物种来源的肌肉。

以不同物种来源的动物DNA为模板，用物种特异性的引物进行PCR扩增，只有在模板和引物的物种相对应的情况下才会有特异性条带的出现。

应用此方法，可以特异性地检测样品中痕量的特定DNA成分。

（二）实验步骤

　　1.不同反应体系的配制

　　按下表将各成分分别加入一做好标记的无菌PCR管中，配制50μl的PCR反应体系，注意酶要最后加，加完后将PCR管放置在冰上。

　　2.将上述混合液稍加离心，约10s左右。

取下后立即置于PCR仪中，盖紧热盖，定好PCR仪的反应程序，执行扩增程序。

　　反应程序为：

　　预变性94℃5min

　　变性94℃5s

　　退火50℃5s

　　延伸72℃20s

　　后延伸72℃5min

　　3.反应结束后，终止程序，将PCR管取出，放置于4℃，待电泳检测。

循环30次

　　二、水平式琼脂糖凝胶电泳法鉴定PCR产物

（一）实验原理

　　核酸分子是两性解离分子，在高于其等电点的电泳缓冲液（pH）中，其碱基不解离，而磷酸集团全部解离，核酸分子因而带负电荷，电泳时向正极迁移。

琼脂糖主要是从海洋植物琼脂中提取而来并经糖基化修饰，为一种聚合链线性分子。

使用琼脂糖凝胶作为电泳支持介质，发挥分子筛功能，使得大小和构象不同的核酸分子的迁移率出现较大差异，从而达到分离的目的。

（二）实验步骤

　　1.制胶

　　称取琼脂糖，放入250ml的锥形瓶中，加入120ml1×TAE缓冲液，微波炉高火加热约40s直至沸腾，摇动，使琼脂糖分散，在重复煮沸2次，直至溶液澄清透明。

待琼脂糖温度降到60℃左右时，按1:

20000的浓度加入GoldenView,混匀后倒入已插上合适齿孔梳子的模具中，静置，约30-45min后凝胶完全凝固。

轻轻的垂直拔出梳子，将凝胶取出，放入电泳槽中，添加1×TAE缓冲液至刚好没过凝胶（有样品孔的一端靠近负极）。

　　2.加样

　　取15μlPCR产物与3μl的6×上样缓冲液混匀，加入到凝胶样品孔中。

每加完一个样品应更换一个吸头。

加样前，要记下加样的顺序。

在每排样品孔中留出一个位置加入5μl的marker。

　　3.电泳

　　加样后的凝胶板立即通电进行电泳，电压100V，样品由负极向正极移动。

当溴酚蓝移动到距离凝胶下缘约1/3时，停止电泳。

　　4.拍照

　　电泳完毕后，取出凝胶，采用凝胶成像系统拍照保存。

　　三、实验小结

（一）实验结果

　　PCR产物电泳结果

　　由上图可以看出，样品1和样品6出现了目的条带（大小约200bp），所以DNA模板1为猪肉DNA，DNA模板3为牛肉DNA,DNA模板2为兔肉DNA。

（二）实验讨论

　　1.在加入Taq酶时，应始终保持酶在冰浴中，不可握在手中。

　　2.每加完一次酶，都应更换吸头。

因为在加酶时，吸头会插入液面以下，为防止污染，应更换吸头。

　　3.拔出梳子时，应两端一起用力，垂直，缓慢地拔出，以免破坏胶孔。

　　4.将样品与上样缓冲液混合时，要反复吸进，挤出溶液。

为防止出现较多气泡，在每次挤出溶液时，可在吸头中残留少量溶液。

　　5.在加样时，吸头要垂直于凝胶板且不要插入太深，以免破坏样品孔。

　　6.我们组的电泳图中，条带不是很明显，应该是加样时样品的量不够充足，以后应注意。

　　篇三：

PCR实验报告

　　PCR实验报告

　　实验目的：

了解PCR技术原理，掌握最基础的PCR实验步骤。

　　实验试剂：

模板DNA，Mg2+，buffer，dNTPs，TaqDNA聚合酶，引物，H2O。

　　实验原理：

　　?

PCR全称聚合酶链反应，是体外快速扩增特定基因或DNA序列最常用的方法。

　　?

基本原理：

首先将双链DNA分子在临近沸点的温度下

　　加热分离成2条单链DNA分子，DNA聚合酶以单链DNA为模板并利用反应混合物中的四种脱氧核苷三磷酸合成新的DNA互补链。

PCR反应时，只要在试管内加入模板DNA、PCR引物、四种核苷酸及适当浓度的Mg2+，DNA聚合酶就能在数小时内将目标序列扩增100万倍以上。

（1）双链模板DNA分子首先在高温下解开成长的单链，短链引物分子立即与该模板DNA

　　两端的特定序列相结合，产生双链区。

（2）DNA聚合酶从引物处开始复制其互补链，迅速产生与目标序列完全相同的复制品。

　　（3）在后续反应中，无论是起始模板DNA还是经复制的杂合DNA双链，都会在高温下解

　　开成为单链，体系中的引物分子再次与其互补序列相结合，聚合酶也再度复制模板DNA。

　　（4）由于在PCR反应中选用的一对引物，是按照与扩增区域两端序列彼此互补的原则设计

　　的，因此每一条新生链的合成都是从引物的退火结合位点开始并朝反方向延伸的，每一条新合成的DNA链上都有新的引物结合位点。

　　（5）整个PCR的反应全过程，即DNA解链（变性）、引物与模板DNA结合（退火）、DNA

　　合成（链的延伸）三步可以被不断重复。

经多次循环之后，反应混合物中所含有的双链DNA分子数，即两条引物结合位点之间的DNA区段的拷贝数，理论上的最高值应该是2

，能进一步满足遗传分析的需要。

　　?

试剂作用：

（1）引物：

DNA复制的起始点，针对复制DNA片段的两端，有5’引物和3’引物

（2）TaqDNA聚合酶：

促进dNTPs与模板结合。

　　（3）Buffer：

Tris-HCl反应缓冲液，TaqDNA聚合酶提供一个最适酶催反应条件。

　　（4）Mg2+：

对PCR扩增效率影响很大，浓度过高可降低PCR扩增的特异性，浓度过低则

　　影响PCR扩增产量甚至使PCR扩增失败而不出扩增条带。

　　（5）dNTPs：

底物，在引物引导下合成与模板互补的DNA新链。

　　（6）石蜡油：

防止PCR加热过程中DNA蒸发。

　　?

试剂配置体积：

（1）热启动：

94℃，5~10min

（2）变性：

94℃，45~60s。

　　（3）退火：

50~65℃，1min。

退火温度计算：

Tm-（5℃~10℃），Tm（解链温度）=4（G+C）

　　+2（A+T）。

　　（4）延伸：

72℃，1~。

　　（5）步骤

（2）~（4）热循环25~30个周期

　　（6）保温：

延伸72℃，10min

　　?

产物检测：

凝胶电泳。

　　实验步骤：

（1）设计20μl体系各试剂配比：

（2）按照预先设计的20μl体积配置6管试管量，实际加入量如下表

　　（3）完成后分6管加入pcr管中，每管15μl体积，标注1-6号码。

　　（4）在前1-~4号PCR管中加入模板DNA，在5号管中加入C3H模板作为阳性参照，6号中不加任何模板DNA，作为阴性参照。

　　（5）在加完模板的6管试剂中各加入20μl石蜡油

　　（6）将PCR管放入

　　PCR仪，按之前设定的加热温度与时间设置

　　a．热启动：

94℃，2min；80℃，1min；

　　此时在各管中加入dNTPs4μl

　　b．变性：

94℃，30s；

　　c．退火：

65℃，；

　　d．延伸：

72℃，2min

　　步骤b~d循环40次

　　e．保温：

72℃，10min

　　（7）完成后用3%琼脂糖凝胶（60ml）电泳进行检测。

　　实验结果：

　　PCR目标产物约为295bp

　　琼脂糖凝胶电泳结果如下图所示

　　123456Marker

　　1、2号泳道为♂性小鼠DNA模板的PCR产物

　　3、4号泳道为♀性小鼠DNA模板的PCR产物

　　5号泳道为C3H阳性参照

　　6号泳道为阴性参照

　　由Marker参照可知，PCR产物大小约为290~300bp