细胞培养完整手册.docx

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细胞培养完整手册

细胞培养完整手册

常用设备

准备室的设备：

单蒸馏水蒸馏器、双蒸馏水蒸馏器、酸缸、烤箱、高压锅、储品柜（放置未消毒物品）、储品柜（放置消毒过的物品）、包装台。

配液室的设备：

扭力天平和电子天平（称量药品）、PH计（测量培养用液PH值）、磁力搅拌器（配置溶液室搅拌溶液）。

培养室的设备：

液氮罐、储品柜（存放杂物）、日光灯和紫外灯、空气净化器系统、低温冰箱（-80℃）、空调、二氧化碳缸瓶、边台（书写实验记录）。

必须放在无菌间的设备：

离心机（收集细胞）、超净工作台、倒置显微镜、CO2孵箱（孵育培养物）、水浴锅、三氧消毒杀菌机、4℃冰箱（放置serum和培养用液）。

无菌操作基本技术

无菌室的灭菌：

1.定期打扫无菌室：

每周打扫一次，先用自来水拖地、擦桌子、超净工作台等，然后用

3‰来苏尔或者新洁尔灭或者0.5％过氧乙酸擦拭。

2.CO2孵箱（培养箱）灭菌：

先用3‰新洁尔灭擦拭，然后用75％酒精擦拭或者0.5％过氧乙酸，再用紫外灯照射。

3.实验前灭菌：

打开紫外灯、三氧杀菌机、空气净化器系统各20-30分钟。

4.实验后灭菌：

用75％酒精（3‰新洁尔灭）擦拭超净台、边台、倒置显微镜的载物台。

5.定期检测下列项目：

钢瓶之CO2压力；CO2培养箱之CO2浓度、温度、及水盘是否有污染（水盘的水用无菌水，每周更换）；无菌操作台内之airflow压力，定期更换紫外线灯管及HEPA过滤膜，预滤网（300小时/预滤网，3000小时/HEPA）。

6.水槽可添加消毒剂（Zephrin1:

750），定期更换水槽的水。

实验人员的无菌准备：

1.肥皂洗手。

2.穿好隔离衣、带好隔离帽、口罩、放好拖鞋

3.用75％酒精棉球擦净双手。

无菌操作的演示：

1.凡是带入超净工作台内的酒精、PBS、培养基、胰蛋白酶的瓶子均要用75％酒精擦拭瓶子的外表面

2.靠近酒精灯火焰操作。

3.器皿使用前必须过火灭菌

4.继续使用的器皿（如瓶盖、滴管）要放在高处，使用时仍要过火。

5.各种操作要靠近酒精灯，动作要轻、准确，不能乱碰。

如吸管不能碰到废液缸。

6.吸取两种以上的使用液时要注意更换吸管，防止交叉污染。

器械的清洗和消毒

玻璃器械洗消：

一、新的玻璃器皿的洗消：

1.自来水刷洗，除去灰尘。

2.烘干、泡盐酸：

烤箱中烘干，然后再浸入5％稀盐酸中12小时以除去脏物、铅、砷等

物。

3.刷洗、烘干：

12小时后立即用自来水冲洗，再用洗涤剂刷洗，自来水冲干净后用烤箱烘干。

4.泡酸、清洗：

用清洁液（重铬酸钾120g：

浓硫酸200ml：

蒸馏水1000ml）浸泡12小时，然后从酸缸内捞出器皿用自来水冲洗15次，最后蒸馏水冲洗3-5次和用双蒸水过3次。

5.烘干、包装：

洗干净后先烘干，然后用牛皮纸（油光纸）包装。

6.高压消毒：

包装好的器皿装入高压锅内盖好盖子，打开开关和安全阀，当蒸气成直线上升时，关闭安全阀，当指针指向15磅时，维持20-30分钟。

7.高压消毒后烘干

二、旧的玻璃器皿的洗消：

1.刷洗、烘干：

使用过的玻璃器皿可直接泡入来苏尔液或洗涤剂溶液中，泡过来苏尔溶液（洗涤剂）的器皿要用清水刷洗干净，然后烘干。

2.泡酸、清洗：

烘干后泡入清洁液（酸液），12小时后从酸缸内捞出器皿立即用自来水冲洗（避免蛋白质干涸后粘附于玻璃上难以清洗），再用蒸馏水冲洗3次。

3.烘干、包装：

洗干净的器皿烘干后取出用牛皮纸（油光纸）等包装，以便于消毒储存及防止灰尘和再次被污染。

4.高压消毒：

包装好的器皿装入高压锅内，盖好盖子，打开开关和安全阀，随着温度的上升安全阀冒出蒸气，当蒸气成直线冒出3-5分钟后，关闭安全阀，气压表指数随之上升，当指针指向15磅时，调节电开关维持20-30分钟即可。

（玻璃培养瓶消毒前可将胶帽轻轻盖上）

5.烘干备用：

因为高压消毒后器皿会被蒸气打湿，所以要放入烤箱内烘干备用。

金属器械洗消：

金属器皿不能泡酸，洗消时可先用洗涤剂刷洗，后用自来水冲干净，然后用75％酒精擦拭，再用自来水，然后用蒸馏水冲洗，再烘干或空气中晾干。

放入铝制盒内包装好在高压锅内15磅高压（30分钟）消毒，再烘干备用。

橡胶和塑料：

橡胶和制品通常处理方法是：

先用洗涤剂洗刷干净，再分别用自来水和蒸馏水冲干净，再用烤箱烘干，然后根据不同品质进行如下的处理程序：

1.针式滤器帽不能泡酸液,用NaOH泡6-12小时,或者煮沸20分钟,在包装之前要装好滤膜两张，安装滤膜时注意光面朝上（凹向上），然后将螺旋稍微拧松一些，放入铝盒中在高压锅内15磅30分钟消毒，再烘干备用。

注意在超净台内取出使用时应该立即将螺旋旋紧。

2.胶塞烘干后用2％氢氧化钠溶液煮沸30分钟（用过的胶塞只要用沸水处理30分钟），自来水洗净，烘干。

然后再泡入盐酸液30分钟，再用自来水，蒸馏水，三蒸水洗净，烘干。

最后装入铝盒内高压消毒，烘干备用。

3.胶帽，离心管帽烘干后只能在2％氢氧化钠溶液中浸泡6-12小时（切记时间不能过长），自来水洗净，烘干。

然后再泡入盐酸液30分钟，再用自来水，蒸馏水，三蒸水洗净，烘干。

最后装入铝盒内高压消毒，烘干备用。

4.胶头可用75％酒精浸泡5分钟，然后紫外照射后使用即可。

5.塑料培养瓶，培养板，冻存管.

6.其他消毒方法：

有的物品既不能干燥消毒，又不能蒸气消毒，可用70％酒精浸泡消毒。

塑料培养皿打开盖子，放在超净台台面上，直接暴露在紫外线下消毒。

也可用氧化乙烯消毒塑料制品，消毒后需要用2—3周时间洗除残留的氧化乙烯。

用20000—100000rad的r射线消毒塑料制品效果最好。

为了防止清洗器材已消毒与末消毒发生混淆，可在纸包装

后，用密写墨水作好标记。

其法即用沾水笔或毛笔沾以密写墨水，在包装纸上作一记号，平时这种墨水不带痕迹，一经高温，即出现字迹，从而可以判定它们是否消毒。

密写墨水的配制：

氯化钻（CoC12·6H2o）2g，30％盐酸10m1，蒸馏水88m1。

注意事项：

1.严格执行高压锅的操作规程：

高压消毒时，先检查锅内是否有蒸馏水，以防高压时烧干，水不能过多因为其将使空气流畅受阻，会降低高压消毒效果。

检查安全阀是否通畅，以防高压时爆炸。

2.安装滤膜时注意光面朝上：

注意滤膜光滑一面是正面，要朝上，否则起不到过滤的作用。

3.注意人体的防护和器皿的完全浸泡：

A.泡酸时要戴耐酸手套，防止酸液溅起伤害人体。

B.从酸缸内捞取器皿时防止酸液溅到地面，会腐蚀地面。

C.器皿浸入酸液中要完全，不能留有气泡，以防止泡酸不彻底。

细胞培养用液的配制与消毒

器材与试剂：

干粉型培养基、胰蛋白酶，青霉素、链霉素.纯净水系统、电子天平、PH计、磁力搅拌器。

具体步骤：

一、水的制备：

细胞培养用水必须非常纯净，不含有离子和其他的杂质。

需要用新鲜的双蒸水、三蒸水或纯净水。

二、PBS的制备与消毒（也可用于其它BSS，如：

Hanks，D-Hanks液的配制）：

1.溶解定容：

将药品（NaCl8.0g，KCl0.2g，Na2HPO4·H2O1.56g，KH2PO40.2g）倒入盛有双蒸水的烧杯中，玻璃棒搅动，充分溶解，然后把溶液倒入容量瓶中准确定容至1000ml，摇匀即成新配制的PBS溶液。

2.移入溶液瓶内待消毒：

将PBS倒入溶液瓶（大的吊针瓶）内，盖上胶帽，并插上针头放入高压锅内8磅消毒20分钟。

注意高压消毒后要用灭菌蒸馏水补充蒸发掉的水份。

三、胰蛋白酶溶液的配制与消毒：

胰蛋白酶的作用是使细胞间的蛋白质水解从而使细胞离散。

不同的组织或者细胞对胰酶的作用反应不一样。

胰酶分散细胞的活性还与其浓度、温度和作用时间有关，在pH为8.0、温度为37℃时，胰酶溶液的作用能力最强。

使用胰酶时，应把握好浓度、温度和时间，以免消化过度造成细胞损伤。

因Ca2+、Mg2+和血清、蛋白质克降低胰酶的活性，所以配制胰酶溶液时应选用不含Ca2+、Mg2+的BSS，如：

D-Hanks液。

终止消化时，可用含有血清培养液或者胰酶抑制剂终止胰酶对细胞的作用。

1.称取胰蛋白酶：

按胰蛋白酶液浓度为0.25％，用电子天平准确称取粉剂溶入小烧杯中的双蒸水（若用双蒸水需要调PH到7.2左右）或PBS（D-hanks）液中。

搅拌混匀，置于4℃内过夜。

2.用注射滤器抽滤消毒：

配好的胰酶溶液要在超净台内用注射滤器（0.22微米微孔滤膜）抽滤除菌。

然后分装成小瓶于-20℃保存以备使用。

四、抗生素溶液的配制

1.所用纯净水（双蒸水）需要15磅高压20分钟灭菌。

2.具体操作均在超净台内完成。

青霉素是80万单位/瓶，用注射器加4ml灭菌双蒸水。

链霉素是100万单位/瓶，加5ml灭菌双蒸水，即每毫升各为20万单位。

3.使用时溶入培养液中，使青链霉素的浓度最终为100单位/ml。

1单位＝1微克？

4.细胞库之细胞培养基不加抗生素

5.培养自ATC引进之细胞株，培养基中不加抗生素。

6.培养自其它实验室引进之细胞株，制作tokenfreeze前培养基须添加抗生素，待tokenfreeze通过污染测试后，大量培养时则不加抗生素。

7.寄送活细胞时，须将培养液充满整个flask时，则须添加抗生素。

（penicillin100units/ml+

streptomycin100ug/ml）

8.若要检测mycoplasma，则培养基内不可添加gentamicin，因gentamicin

会抑制

mycoplasma生长。

9.去除细菌污染之抗生素混合配方:

penicillin250units/ml,streptomycin250ug/ml,neomycin250ug/ml,bacitracin2.5units/ml

注意混合使用后药物毒性会增强。

10.抗生素使用种类与浓度：

　　　　　　　　　　　工作浓度.　　　　储存温度.　　　　杀灭细菌

penicillin　　　　　　100units/ml　　-20℃　　　　G（+）bacteria

streptomycin　　　　　100ug/ml　　　　-20℃　　　　G（+）andG（-）bacteriachlotetracycline　　　50ug/ml　　　　-20℃　　　　G（+）andG（-）bacteria

gentamicin　　　　　　50ug/ml　　　　-20℃　　　　G（+）andG（-）bacteria,mycoplasma

amphotericinB　　　　2.5ug/ml　　　-20℃　　　　yeastandmolds

nystatin　　　　　　　50ug/ml　　　　-20℃　　　　yeastandmolds

fungizone　　　　　　2.5ug/ml　　　　-20℃　　　　　yeastandmolds

五、RPMI1640的制备与消毒：

1.溶解、调PH值、定容：

先将培养基粉剂加入培养液体积2/3的双蒸水中,并用双蒸水冲洗包装袋2-3次（冲洗液一并加入培养基中）,充分搅拌至粉剂全部溶解,并按照包装说明添加一定的药品.然后用注射器向培养基中加入配制好的青链霉素液各0.5ml,使青链霉素的浓度最终各为100单位/ml。

然后用一个当量的盐酸和NaOH调PH到7.2左右。

最后定容至1000ml，摇匀。

2.安装蔡式滤器：

安装时先装好支架，按规定放好滤膜，用螺丝将不锈钢滤器和支架连接好。

然后卸下支架腿分别用布包好待消毒。

3.抽滤：

配制好的培养液通常用滤器过滤除菌。

通常用蔡式滤器在超净工作台内过滤。

4.分装：

将过滤好的培养液分装入小瓶内置于4℃冰箱内待用。

5.使用前要向100ml培养液中加入1ml谷氨酰胺溶液（4℃时两周有效）。

六、血清：

1.血清的灭火：

细胞培养常用的是小牛血清，新买来的血清要在56℃水浴中灭火30分钟后，再经过抽滤方可加入培养基中使用。

血清必须贮存于–20～-70℃，若存放于4℃，请勿超过一个月。

如果一次无法用完一瓶，可将40～45ml分装于无菌50ml离心管中，由于血清结冻时体积会增加约10%，必须预留此膨胀体积之空间，否则易发生污染或容器冻裂之情形。

2.一般厂商提供之血清为无菌，不需再无菌过滤。

若发现血清有许多悬浮物，则可将血清入培养基内一起过滤，勿直接过滤血清。

3.瓶装（500ml）血清解冻步骤（逐步解冻法）:

-20℃或–70℃至4℃冰箱溶解一天，至室温下全溶后再分装，一般50ml无菌离心管可分装40～45ml。

在溶解过程中须规则摇晃均匀（小心勿造成气泡，使温度与成分均一，减少沈淀的发生。

勿直接由－２０℃直接至３７℃解冻，因温度改变太大，容易造成蛋白质凝结而发生沈淀。

4.heat-inactivation是指56℃,30分钟加热已完全解冻之血清。

加热过程中须规则摇晃均匀。

此热处理之目的是使血清中之补体成份（complement）去活化。

除非必须，一般建议作此热处理，因为会造成沈淀物之显著增多，且会影响血清之品质。

补体参与之反应有：

cytolyticactivities,contractionofsmoothmuscle,releaseofhistaminefrommastcellsandplatelets,enhancedphag℃ytosis,chemotaxisandactivationoflymph℃yticandmacrophagecelltype。

5.勿将血清置于３７℃太久，若在３７℃放置太久，血清会变得混浊，同时血清中许多较不稳定之成份亦会因此受到破坏，而影响血清之品质。

6.血清之沉淀物

6.1凝絮物：

发生之原因有许多种，但普遍之原因是血清中之脂蛋白（lipoprotein）变性及解冻后血清中存在之血纤维蛋白（fibrin）造成，这些凝絮沈淀物不会影响血清本身之品质。

若欲减少这些凝絮沈淀物，可用离心3000rpm,5min去除，或离心后上清液可以加入培养基中一起过滤。

不建议用过滤步骤去除这些凝絮沈淀物，因为会阻塞过滤膜。

6.2显微镜下观察之“小黑点”：

通常经过热处理之血清，沉淀物的形成会显著的增多。

有些沉淀物在显微镜下观察像是小黑点，常会误认为血清遭受污染，而将血清放在３７℃中欲培养此微生物“，但在37℃环境下，又会使此沈淀物增多，更会误认为微生物之增殖，但以培养细菌之培养基检测，又没有污染。

一般而言，此黑点应不会影响细胞之生长，但若怀疑此血清之品应立即停用，更换另一批号的血清。

七、HEPES溶液：

HEPES的化学全称位羟乙基呱嗪乙硫磺酸（N'-a-hydroxythylpiperazine-N'-ethanesulfanicacid）。

对细胞无毒性作用。

它是一种氢离子缓冲剂，能较长时间控制恒定的pH范围。

使用终浓度为10-50mmol/L，一般培养液内含20mmol/LHEPES即可达到缓冲能力。

1mol/LHEPE缓冲液配制方法如下：

准确称取HEPTS238.3g，加入新鲜三蒸水定容至1L。

过滤除菌，分装后4℃保存。

注意：

因为现在市售HEPES为约10g包装的小瓶，所以可根据实际情况灵活配制，但是要保证培养液内HEPES的终浓度仍然为20mmol/L。

如：

称取4.766克HEPES溶于20ml三蒸水中，过滤除菌后可完全（20ml）加入1L培养液中，或者每100ml培养液中加入2ml即可。

八、谷氨酰胺：

合成培养基中都含有较大量的谷氨酰胺，其作用非常重要，细胞需要谷氨酰胺合成核酸和蛋白质，谷氨酰胺缺乏要导致细胞生长不良甚至死亡。

在配制各种培养液中都应该补加一定量的谷氨酰胺。

由于谷氨酰胺在溶液中很不稳定，4℃下放置1周可分解50％，故应单独配制，置于-20℃冰箱中保存，用前加入培养液。

加有谷氨酰胺的培养液在4℃冰箱中储存2周以上时，应重新加入原来的谷氨酰胺。

一般培养液中谷氨酰胺的含量为1～4mmol/L。

可以配制200mmol/L谷氨酰胺液贮存，用时加入培养液。

配制方法为，谷氨酰胺2.922g溶于三蒸水加至100ml即配成200mmol/L的溶液，充分搅拌溶解后，过滤除菌，分装小瓶，-20℃保存，使用时可向100ml培养液中加入1ml谷氨酰胺溶液。

九、肝素溶液的配制：

含有肝素的培养液可以使内皮细胞纯度提高，肝素加入全培养液中最终浓度为50ug/ml。

因为现在市售的多为肝素钠，包装为约为0.56克/瓶，配制时，可将其溶于100ml三蒸水中，定容，过夜，然后过滤除菌，分装小瓶，保存温度为℃。

使用时，向100ml培养液中加入1ml（精确可加入0.9ml）即可。

十、Ⅰ型胶原酶：

0.1％Ⅰ型胶原酶溶液同胰蛋白酶一样配制和消毒灭菌。

注意：

因为Ⅰ型胶原酶分子颗

粒比胰酶大，不容易过滤，因此可以用蔡式滤器过滤除菌。

分装入10ml小瓶-20℃保存。

十一、明胶溶液：

因为明胶难于过滤，所以配制0.1％明胶溶液必须用无菌的PBS配制。

所以制备过程中必须要注意无菌操作。

首要的问题是如何无菌准确称量0.1克（配成100ml溶液）—即解决无菌分装药品的问题。

其次要注意即使是01.的溶液，明胶也难溶，因此要充分摇匀，过夜放置，然后无菌分装入50ml小瓶中，4℃保存。

注意事项：

1.配制溶液时必须用新鲜的蒸馏水。

2.安装蔡式滤器时通常使用孔径0.45微米和0.22微米滤膜各一张，放置位置为0.45的位于0.22微米的滤膜上方，并且要特别注意滤膜光面朝上。

3.配制RPMI1640培养基时因为还要加入小牛血清，而小牛血清略偏酸性，为了保证培养液PH值最终为7.2，可在配制时调PH至7.4。

细胞培养的一般过程

一、准备工作

准备工作对开展细胞培养异常重要，工作量也较大，应给予足够的重视，推备工作中某一环节的疏忽可导致实验失败或无法进行。

准备工作的内容包括器皿的清洗、干燥与消毒，培养基与其他试剂的配制、分装及灭菌，无菌室或超净台的清洁与消毒，培养箱及其他仪器的检查与调试，具体内容可参阅有关文献。

二、取材

在无菌环境下从机体取出某种组织细胞（视实验目的而定），经过一定的处理（如消化分散细胞、分离等）后接入培养器血中，这一过程称为取材。

如是细胞株的扩大培养则无取材这一过程。

机体取出的组织细胞的首次培养称为原代培养。

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理论上讲各种动物和人体内的所有组织都可以用于培养，实际上幼体组织（尤其是胚胎组织）比成年个体的组织容易培养，分化程度低的组织比分化高的容易培养，肿瘤组织比正常组织容易培养。

取材后应立即处理，尽快培养，因故不能马上培养时，可将组织块切成黄豆般大的小块，置4℃的培养液中保存。

取组织时应严格保持无菌，同时也要避免接触其他的有害物质。

取病理组织和皮肤及消化道上皮细胞时容易带菌，为减少污染可用抗菌素处理。

由组织并分离分散细胞的方法可参阅有关文献。

三、培养

将取得的组织细胞接入培养瓶或培养板中的过程称为培养。

如系组织块培养，则直接将组织块接入培养器皿底部，几个小时后组织块可贴牢在底部，再加入培养基。

如系细胞培养，一般应在接入培养器皿之前进行细胞计数，按要求以一定的量（以每毫升细胞数表示）接入培养器皿并直接加入培养基。

细胞进入培养器皿后，立即放入培养箱中，使细胞尽早进入生长状态。

正在培养中的细胞应每隔一定时间观察一次，观察的内容包括细胞是否生长良好，形态是否正常，有无污染，培养基的PH是否太酸或太碱（由酚红指示剂指示），此外对培养温度和CO2浓度也要定时检查。

一般原代培养进入培养后有一段潜伏期（数小时到数十天不等），在潜伏期细胞一般不分裂，但可贴壁和游走。

过了潜伏期后细胞进入旺盛的分裂生长期。

细胞长满瓶底后要进行传代培养，将一瓶中的细胞消化悬浮后分至两到三瓶继续培养。

每传代一次称为“一代”。

二倍体细胞一般只能传几十代，而转化细胞系或细胞株则可无限地传代下去。

转化细胞可能具有恶性性质，也可能仅有不死性（Immortality）而无恶性。

培养正在生长中的细胞是进行各种生物医学实验的良好材料。

四、冻存及复苏

为了保存细胞，特别是不易获得的突变型细胞或细胞株，要将细胞冻存。

冻存的温度一般用液氮的温度?

－196℃，将细胞收集至冻存管中加入含保护剂（一般为二甲亚砜或甘油）的培养基，以一定的冷却速度冻存，最终保存于液氮中。

在极低的温度下，细胞保存的时间几乎是无限的。

复苏一般采用快融方法，即从液氮中取出冻存管后，立即放入37℃水中，使之在一分钟内迅速融解。

然后将细胞转入培养器皿中进行培养。

冻存过程中保护剂的选用、细胞密度、降温速度及复苏时温度、融化速度等都对细胞活力有影响。

细胞原代培养

一、原理

将动物机体的各种组织从机体中取出，经各种酶（常用胰蛋白酶）、螯合剂（常用EDTA）或机械方法处理，分散成单细胞，置合适的培养基中培养，使细胞得以生存、生长和繁殖，这一过程称原代培养。

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二、仪器、材料及试剂

仪器：

培养箱（调整至37℃），培养瓶、青霉素瓶、小玻璃漏斗、平皿、吸管、移液管、纱布、手术器械、血球计数板、离心机、水浴箱（37℃）

材料：

胎鼠或新生鼠

试剂：

1640培养基（含20%小牛血清），0.25%胰酶，Hank’s液，碘酒

三、操作步骤

（一）胰酶消化法

1、器材：

将孕鼠或新生小鼠拉颈椎致死，置75%酒精泡2—3秒钟（时间不能过长、以免酒精从口和肛门浸入体内）再用碘酒消毒腹部，取胎鼠带入超净台内（或将新生小鼠在超净台内）解剖取肝脏，置平皿中。

2、用Hank’s液洗涤三次，并剔除脂肪，结缔组织，血液等杂物。

附：

Hank’s液配方：

5mKH2PO40.06g，Nacl8.0g，NaHCO30.35g，KCl0.4g，葡萄糖1.0g，Na2HPO4·H2O0.06g，加H2O至1000mlG1

注：

Hank’s液可以高压灭菌。

4℃下保存。

3、用手术剪将肝脏剪成小块（1mm2），再用Hank’s液洗三次，转移至小青霉素瓶中。

4、视组织块量加入5—6倍的0.25%胰酶液，37℃中消化20—40分钟，每隔5分钟振荡一次，或用吸管吹打一次，使细胞分离。

5、加入3—5ml培养液以终止胰酶消化作用（或加入胰酶抑制剂）。

6、静置5—10分钟，使未分散的组织块下沉，取悬液加入到离心管中。

7、1000rpm，离心10分钟，弃上清液。

8、加入Hank’s液5ml，冲散细胞，再离