核心蛋白聚糖对TGFβ1诱导的人肾小管上皮细胞产生胶原的影响.docx

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核心蛋白聚糖对TGFβ1诱导的人肾小管上皮细胞产生胶原的影响

核心蛋白聚糖对TGFβ1诱导的人肾小管上皮细胞产生胶原的影响

（作者:

___________单位:

___________邮编:

___________）

作者：

成学琴,鲍华英,潘小勤,费莉,黄松明,张维真【摘要】　　目的:

探讨核心蛋白聚糖对转化生长因子β1（TGFβ1）诱导的人近端肾小管上皮细胞（HK2）Ⅰ、Ⅲ型胶原表达的影响。

方法:

将体外培养的HK2细胞分为:

（1）阴性对照组;

（2）10μg/LTGFβ1组;（3）TGFβ1（10μg/L）+（10μg/L）核心蛋白聚糖组;（4）TGFβ1（10μg/L）+（100μg/L）核心蛋白聚糖组。

倒置显微镜下观察加入刺激因子48h后肾小管上皮细胞的细胞形态学改变;应用逆转录聚合酶链反应（RTPCR）观察不同浓度的核心蛋白聚糖对HK2细胞Ⅰ、Ⅲ型胶原表达变化的影响。

结果:

加入刺激因子48h后,

（1）组细胞形态与正常HK2细胞形态基本一致,大部分仍为椭圆形;

（2）组细胞形态发生明显的变化,大部分细胞由椭圆形拉长为长梭形;（3）和（4）组,梭形样细胞明显减少,尤其是（4）组梭形样细胞减少更为明显。

（2）组HK2细胞Ⅰ型胶原mRNA表达上升到

（1）组的27.86倍,Ⅲ型胶原mRNA的表达上升到

（1）组的21.83倍。

（3）和（4）组与

（2）组相比,Ⅰ型胶原mRNA的表达分别下降了36.39%、53.36%,Ⅲ型胶原mRNA的表达分别下降了26.35%、47.96%（P0.05）,但仍未下降到正常水平。

结论:

核心蛋白聚糖能抑制TGFβ1诱导的人近端肾小管上皮细胞Ⅰ、Ⅲ型胶原的表达,可能是核心蛋白聚糖抑制肾间质纤维化的原因之一。

　　AIM:

ToexploretherolesofcoreproteoglycanandTGFβ1ontheexpressionsofⅠandⅢcollageninhumanrenaltubularepithelialcellline（HK2）invitro.METHODS:

ConfluentHK2cellswereexposedtoTGFβ1andcoreproteoglycanforupto48h.Thecellsweredividedintofourgroups.Group

（1）,negativecontrolgroup;group

（2）,single10μg/LTGFβ1treatedgroup;group（3）,10μg/LTGFβ1+10μg/Lcoreproteoglycangroup;group（4）,10μg/LTGFβ1+100μg/Lcoreproteoglycangroup.MorphologiccharacterizationofHK2cellswasshownbyinvertmicroscope;PreciseamountsofⅠandⅢcollagenmRNAweremeasuredbyRTPCR.RESULTS:

After48h,morphologyof

（1）groupcellshadnochanges,mostcellswerenormalshape;

（2）groupcellstookgreatchanges,mostcellsconvertedintospindleshape,likefibroblast,（3）and（4）groups,spindleshapecellsreducedsignificantly.Incontrastto

（1）group,theexpressionsofⅠcollagenin

（2）groupfrommRNAsignificantincreasedby27.86fold.TheexpressionsofⅢcollagenincreasedby21.83fold.Comparing（3）and（4）groupsto

（2）group,theexpressionsofⅠcollagenfrommRNAeffectivelydecreased36.39%and53.36%.Ⅲcollagenexpressionsincreased26.35%and47.96%（P0.05）respectively.But,neither（3）groupnor（4）groupalonecouldregulateⅠandⅢcollagenmRNAtonormallevels.CONCLUSION:

CoreproteoglycancaninhibittheexpressionsofⅠandⅢcollageninHK2cellsinducedbyTGFβ1invitro.Possibly,suggestcoreproteoglycancontributetotheregulationofrenalfibrosis.【关键词】核心蛋白聚糖;转化生长因子β1;胶原;肾小管上皮细胞　　大量证据表明,肾小管上皮细胞在肾小管间质纤维化发病机制中起着重要的作用,它不仅是被动受害者,还是直接参与者。

转化生长因子是被公认的致纤维化生长因子,它可以通过多种途径增加细胞外基质的产生,导致肾小管间质纤维化的发生［1,2］。

核心蛋白聚糖被认为是转化生长因子的一种天然拮抗剂,基因定位于12q21q22,有8个外显子,翻译为一个含有359个核苷酸的蛋白［3］。

它属于富含亮氨酸的小分子蛋白聚糖家族中的一员,由核心蛋白和一条糖胺聚糖链组成。

以10～12个富含亮氨酸重复序列的结构域为特征［4］。

核心蛋白聚糖参与体内许多活动,其生物活性主要通过核心蛋白部分与相应物质结合而发挥作用,可以参与细胞增殖、分化及基质的形成等［5,6］。

近年来对其抗纤维化作用也有不少报道。

但核心蛋白聚糖具体的抗纤维化机制仍不是很清楚,核心蛋白聚糖在肾小管上皮细胞中的作用仍未有报道。

本研究利用体外培养的人肾小管上皮细胞,观察了核心蛋白聚糖对TGFβ1诱导的人肾小管上皮细胞胶原表达的影响。

　　1材料和方法　　1.1材料重组人核心蛋白聚糖购自美国RD公司;DMEM/F12培养基为美国GIBCOL公司产品;胎牛血清购自杭州四季青公司;重组人TGFβ1为美国Peprotech公司产品;RTPCR相关试剂购于美国Promega公司;引物均由美国Invitrogen公司合成;图像分析处理系统购自美国UVP公司;人肾小管上皮细胞株购于中国典型培养物保藏中心。

　　1.2方法　　1.2.1细胞培养HK2细胞培养于37℃、50mL/LCO2培养箱,培养基成分包括DMEM/F12培养基（包含2g/L生物缓冲剂HEPES）、100mL/L胎牛血清（FBS）、1.8g/L碳酸氢钠、青霉素1×105U/L、链霉素100mg/L。

5g/L胰蛋白酶+2g/LEDTA消化后,2×106细胞接种于50mL塑料培养瓶。

细胞70%～80%融合时改为无血清培养基培养24h,使细胞生长同步化后进行刺激。

同时加入核心蛋白聚糖和TGFβ148h后,观察细胞形态学变化,同时收集细胞。

每个实验组均设3个复孔,取平均值。

　　1.2.2细胞形态学观察倒置显微镜下观察加入核心蛋白聚糖和TGFβ148h后,各组HK2细胞的形态学变化,并拍照记录。

　　1.2.3RTPCR方法检测HK2细胞中Ⅰ、Ⅲ型胶原mRNA表达水平的变化按TRLzol试剂说明书提取细胞总RNA,按逆转录试剂说明书逆转录合成cDNA模板,并以等量cDNA为模板进行PCR扩增反应。

序列如下:

Ⅰ型胶原上游5′GGCGGCCAGGCTCCGACCC3′,下游5′AATTCCTGGTCTGGCACC3′产物347bp;Ⅲ型胶原上游5′GCTTCCCAGAACATCACA3′,下游5′GGTAGTCTCACAGCCTTGC3′产物230bp;GAPDH上游5′ACCACAGTCCATGCCATCAC3′,下游5′TCCACCACCCTGTTGCTGTA3′产物452bp。

反应条件:

94℃预变性5min,然后进入循环,94℃变性30s,各基因最佳退火温度,退火30s,72℃延伸30s,最后72℃终末延伸7min。

GAPDH为28个循环,Ⅰ、Ⅲ型胶原均为30个循环。

PCR产物经10g/L琼脂糖凝胶电泳,凝胶成像系统成像,用图像分析处理系统进行灰度扫描,以吸光度值代表其表达量。

用GAPDH量校正,将二者吸光度值进行比较。

重复3次独立的RTPCR全过程。

　　1.2.4统计学分析结果以x±s表示,采用SPSS11.5软件进行统计学分析。

组间比较采用单因素方差分析,两组均数之间的比较采用q检验,P0.05示差异有统计学意义。

　　2结果　　2.1HK2细胞形态学改变倒置显微镜下观察细胞形态学变化（图1）。

正常HK2细胞为卵圆形或椭圆形贴壁细胞,细胞间连接紧密,成片生长。

阴性对照组HK2细胞与正常HK2细胞无明显区别,细胞基本上为椭圆形贴壁生长状（图1A）;单独加入TGFβ148h后,大多数细胞拉长为梭形,似成纤维细胞状生长。

可见,TGFβ1在10μg/L浓度时能明显诱导HK2细胞发生形态学改变（图B）;而TGFβ1和核心蛋白聚糖共同作用时,梭形样细胞明显减少,尤其是核心蛋白聚糖剂量较大时更为明显（图1C、D）。

　　2.2HK2细胞Ⅰ、Ⅲ型胶原mRNA表达的变化正常HK2细胞仅有少量的Ⅰ、Ⅲ型胶原表达。

从

（1）组可见Ⅰ、Ⅲ型胶原mRNA的表达很少,尤其是Ⅲ型胶原几乎未见表达;单独加入TGFβ148h后,Ⅰ、Ⅲ型胶原mRNA的表达明显增加,平均值分别为（0.892±0.093）和（0.786±0.065）,与

（1）组相比较有统计学意义（P＜0.05）;（3）组和（4）组Ⅰ、Ⅲ型胶原的表达有所减少,（3）组Ⅰ、Ⅲ型胶原的平均值分别为（0.416±0.024）和（0.409±0.018）,（4）组Ⅰ、Ⅲ型胶原的平均值分别为（0.197±0.009）和（0.105±0.007）,两组与

（2）组相比,均有统计学意义（P＜0.05）。

但加入核心蛋白聚糖的（3）和（4）组都未使Ⅰ、Ⅲ型胶原的表达降至正常水平（图2）。

　　图1人肾小管上皮细胞的形态学改变（略）　　Fig1MorphologiccharacterizationonHK2cells　　A:

Negativecontrolgroup;B:

10μg/LTGFβ1group;C:

10μg/LTGFβ1+10μg/Ldecoringroup;D:

10μg/LTGFβ1+100μg/Ldecoringroup.　　图2Ⅰ胶原和Ⅲ胶原mRNA的表达（略）　　Fig2TheexpressionofⅠandⅢcollagenmRNA　　A:

RTPCRpicturesofⅠandⅢcollagen;B:

RTPCRresultsofⅠcollagenmRNA;C:

RTPCRresultsofⅢcollagenmRNA.1:

DNAmarker;2:

Negativecontrolgroup;3:

10μg/LTGFβ1group;4:

10μg/LTGFβ1+10μg/Ldecoringroup;5:

10μg/LTGFβ1+100μg/Ldecoringroup.　　3讨论　　肾小管上皮细胞是小管间质产生基质的重要细胞之一。

TGFβ1是被公认的中心调节因子。

近年来,关于核心蛋白聚糖与TGFβ1之间的相互作用有许多研究。

Liliana等［7］的研究结果表明,在大鼠单侧输尿管结扎模型中,当敲除核心蛋白聚糖基因时,肾间质纤维化的程度更加严重。

Wang等［8］的研究提示,在抗大鼠胸腺细胞血清诱导的肾小球肾炎模型中,当通过系膜细胞作为载体转染核心蛋白聚糖基因后,细胞外基质聚集的程度明显减轻。

Costacurta等［9］通过系膜细胞转染核心蛋白聚糖基因也证实,核心蛋白聚糖能减轻肾间质纤维化的程度。

但大多数是利用大鼠模型作为研究对象,而且未具体到就某种细胞进行研究［10,11］。

我们在以前的实验中,通过收集儿童的肾活检标本,应用免疫组化的方法观察到,核心蛋白聚糖在肾间质损害较严重的病历中,表达明显增加,而且与TGFβ1的表达呈正相关关系。

猜测,核心蛋白聚糖的表达与TGFβ1的表达有一定的关系,但核心蛋白聚糖如何发挥作用呢？

通过外源性加入核心蛋白聚糖对肾小管上皮细胞表达胶原有何影响呢？

因此,实验中我们观察了核心蛋白聚糖对TGFβ1诱导的人肾小管上皮细胞分泌细胞外基质的影响。

结果显示,TGFβ1可使HK2细胞形态学发生变化,拉长似成纤维样细胞,并且能促进HK2细胞分泌胶原Ⅰ及胶原Ⅲ,验证了TGFβ1在肾小管上皮细胞中的致纤维化作用;实验中,核心蛋白聚糖可抑制TGFβ1诱导的HK2细胞形态学改变,并可抑制TGFβ1诱导的HK2细胞胶原Ⅰ及胶原Ⅲ的表达,且存在剂量相关性,证明核心蛋白聚糖可以减少细胞外基质的聚集。

同时提示,核心蛋白聚糖在肾间质细胞外基质重塑过程中有重要的调节作用。

但核心蛋白聚糖具体是通过抑制外源性TGFβ1的活性发挥作用还是通过抑制内源性TGFβ1发挥作用仍需进一步研究。

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