天然药物化学实验指导书doc实验一一叶秋碱的提取分离与doc.docx

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天然药物化学实验指导书doc实验一一叶秋碱的提取分离与doc

NATURALMEDICINALCHEMISTRY

（天然药物化学）

EXPERIMENTALGUIDENCE

（实验指导书）

Editedby

RongminYu（于荣敏）

ChunyanYan（严春艳）

YinYin（殷茵）

CollegeofPharmacy,JinanUniversity

December2006

PREFACE

天然药物化学实验是整个天然药物化学课的重要组成部分。

主要目的为：

1通过实验，了解学生在课堂上所学的基本理论知识的理解和掌握情况，并进一步加深学生对理性知识的理解和掌握。

2通过实验，训练学生的基本操作技能，培养学生分析问题和解决问题的能力，使学生获得从事天然药物化学科研工作的基本训练。

3天然药物化学实验要求学生掌握以下技能：

3.1提取分离方面：

3.1.1掌握常用提取分离方法的原理及操作：

包括液－固提取法（渗渍、渗漉、回流提取）、液－液萃取法（简单萃取法、梯度萃取法、反流分布法）、重结晶法等。

要求学生了解常见溶剂的性能，并能较好地选择提取溶剂。

3.1.2掌握纸层析、薄层层析、柱层析（包括吸附柱离子交换层析）的原理及基本操作。

了解气相层析、高效薄层及高效液相层析的基本操作。

3.2鉴定方面

3.2.1化学方法

A掌握一般定性反应鉴定中的应用

B掌握重要衍生物（乙酰化物、甲基化物、生物碱盐等）的制备方法及其在结构鉴定中的应用。

C了解重要降解反应的原理及应用。

如碱降解、霍夫曼降解、臭氧氧化等。

3.2.2光谱方法

了解UV,IR,NMR,MS在天然产物结构测定中的应用。

目前，要求学生能了解黄酮类化合物的UV,NMR波谱，蒽醌的IR以及麻黄生物碱的NMR谱特征。

3.2.3天然产物的结构修饰

要求学生了解天然产物结构改造的意义，并能进行某些简单的结构修饰工作，如由小檗胺制备檗肌松。

通过实验逐步培养学生独立进行实验的能力。

对某些实验内容，并要求学生由一定的设计能力，为今后从事科研工作打下必要的基础。

本实验指导书主要供教师、学生实验时参考。

各专业、年级尚应根据具体情况增删。

TheExperimentalNotes

ofNaturalProductsChemistry

（天然药物化学实验须知）

在天然药物化学实验中，所用的药品、试药、试剂、溶剂大多具有挥发性、易燃、有毒、有腐蚀性、甚至爆炸性，实验操作又经常在加温、加压等情况下进行，需要各种热源、电器或其它仪器，操作不慎易造成火灾、爆炸、中毒、触电等事故。

但只要加强爱护国家财产和保障人民生命安全的责任心，提高警惕，消除隐患，注意实验规则，完全可以避免一切事故的发生。

TheExperimentalRules

（实验规则）

1.实验前必须预习实验内容，了解实验原理和操作规程。

随时记录实验项目及其现象，以撰写正式实验报告。

2.实验前应清点并检查仪器是否完整，装置是否正确，合格后方可进行实验。

实验时不准做与实验无关的事情，严禁吸烟，不得擅自离开实验室，并应随时注意反应情况，仪器是否漏气、破裂等。

3.药品仪器都是国家财产，须节约爱护使用；公用物品，用后立即放归原处，以便他人使用。

不可调错瓶塞，以免污染。

器皿用后要洗刷干净。

4.操作易燃性有机溶剂，回流、蒸馏、减压蒸馏时，不能明火直接加热，要放沸石或一端封死的毛细管。

若在加热时发现未放沸石则应冷却后再加，防止爆沸冲出。

减压系统应装有安全瓶。

加液时应停火或远离火源，勿漏气开口，冷凝水要通畅。

启封易挥发溶剂瓶盖时，脸面要避开瓶口慢慢开口，以防气体冲脸上，危机尊容。

5.有毒、腐蚀性药品应妥善保管，操作后要立即洗手。

勿沾及五官、创口及身体暴露部位，以免中毒、损伤皮肤。

6.实验中，应在通风橱中使用毒气或腐蚀性气体，必要时，可戴防护用具进行工作。

7.若将玻璃管插入塞中时，可在塞孔中涂些水或甘油等润滑剂，用布包住玻璃管使

其旋转而入，防止折断割伤。

8.实验台上勿放置与实验无关物品，随时保持水槽、仪器、桌面、地面整洁。

9.实验结束时，应将门、窗、水、电、煤气关好，室内打扫干净，并清点仪器后方可离开实验室。

TheSafetyRulesofLaboratory

（安全防火须知）

1.实验室存放易燃性有机溶剂时要远离火源，存量不得超过500ml。

2.在进行易燃性有机溶剂实验时，须按照操作规程进行。

不可将易挥发、易燃性有机溶剂倒入水槽或废液缸内。

3.烘箱内不能烘盛有易燃性溶剂的器皿。

4.消防器材、砂箱、石棉布、灭火器等应放在方便固定的地点，不能随意移动，均应处于备用状态。

5.万一不慎着火，要沉着冷静积极抢救。

应立即切断室内电源和火源，用石棉布将着火部位盖严，使其隔绝空气而熄灭。

或视火势情况选用适当灭火器材进行灭火。

在实验室使用二氧化碳灭火器较好，它具有不腐蚀、不导电等优点。

实验室常见的事故如下，应予以特别注意：

1.蒸馏或回流时，发现未放沸石，未等溶液冷却就补加沸石，结果溶液冲出瓶外，容易引起火灾。

2.蒸馏易燃物时，未通冷却水，大量蒸气逸出易引起火灾。

3.蒸馏易燃物时塞子漏气引起火灾。

4.用三角烧瓶做减压装置的受器，结果炸裂。

5.减压操作结束后，放气太快，使压力计冲破。

6.使用真空干燥器时，未关闭真空泵就直接开干燥器的放气阀，结果使泵内的机油被吸到干燥器中，使样品被污染等。

EXPERIMENTALONE:

IsolationandIdentificationofSecurinine

（实验1:

一叶萩碱的提取分离与鉴定）

1.Introduction

2.PurposeandClaim

3.MethodandNotes

3.1.ExtractandIsolation

3.2.QualityofSecurinine

3.3.ThePreparationofRamificationofSecurinine

3.3.1.ThePreparationofSecurinineNitrate

3.3.2.ThePreparationofMethylSecurinine

3.4.Identification

3.4.1.ThedeterminationofMeltingPointofSecurinineanditsMetylation

3.4.2.TheDeterminationofTLC

3.4.3.IRSpectra

3.4.4.UVSpectra

3.4.5.TheSpecificRotation

4.KeyUnderstandingandNotes

5.ReportWriting

6.Questions

7.EquipmentsandReagents

8.References

INTRODUCTION（概述）

大戟科植物一叶萩（Securinegasuffruticosa（Pall）Rehd）也称叶底珠，别名狗杏条等，我国资源十分丰富，主要成分为一叶秋碱（Fig.9）。

Fig.9TheStructureofSecurinine

一叶萩碱及其衍生物能兴奋中枢N系统，增强心肌收缩、升高血压。

临床用硝酸一叶萩碱治疗面神经麻痹、小儿麻痹骶神经炎和股外侧神经炎感染引起的多发性神经炎，为神经科疾患的常用药物。

一叶萩碱为淡黄色棱形晶体，难溶于水，易溶于醇、氯仿，较难溶于石油醚；一叶萩碱是一个由△αβ不饱和内酯环和一个环己烯及一个哌啶、吡咯啶并合而成的叔胺碱；分子中具有共轭双健，氢原子的孤电子恰好处于键之上，因而可与π电子发生干扰，从而“延伸”了共轭体系，产生了“跨环共轭”。

一叶萩碱与酸生成盐后则为无色，旋光度降低。

表明N原子上电子与质子结合后不再参与“跨环共轭”。

一叶萩中N原子三价都结在环中，有一定程度的碱性（pKa=7.2），因而具有生物碱的一般通性；能与生物碱沉淀试剂产生沉淀反应，亦可与显色剂反应。

从一叶萩中提取生物碱可采用溶剂法[5]、活性炭吸附法[3]和离子交换法。

PURPOSEANDDEMAND

Purpose:

通过一叶萩碱的提取分离掌握用离子交换树脂法提取分离生物碱的原理和方法。

Demand:

分离得到一叶萩碱纯品；制备其衍生物，并加以鉴定。

METHODANDNOTES

ExtractandIsolation：

（Fig.10）

LeafofdriedSecurinegasuffruticosa（75g）

置1000mL烧杯中，pH1－2的H2SO4溶液700ml充分润湿，放置20min后装渗漉筒

（1）。

然后再用pH1－2的H2SO4溶液以4－5ml/min的滴速进行渗漉，收集滤液约1000ml（注意全程测量渗漉液的pH值），取少量溶液进行颜色反应。

ResidueAcidicextract

X取湿态80g树脂，动态湿法装柱。

将渗漉液通过阳离子交换柱

（2）以4－5ml/min的流速进行交换待酸水液全部交换完毕后将树脂倾入烧杯中，水洗至澄明、抽干置培养皿中，室温风干至流沙状

Driedresin

用氨水10－12ml碱化，闷置20min后挥散多余NH3。

将树脂装入沙氏提取器中用150mL（30－60℃）石油醚60℃回流洗脱2.5h。

ResinPetroliumextract

（回收）转移至无水的圆底烧瓶中，旋蒸50℃回收至

体积约20－30ml转移到小锥形中加盖放

置，结晶析出后过滤

PetroliumsolutionCrystal

（回收）（供作鉴定）

Fig.10TheFlowChartofSecurinineAlkaloids’Isolation

NOTES:

[1]装渗漉筒：

渗漉筒底部，放一块脱脂棉（先用水湿润）,然后将湿润过的药材分次加入，分层填压，顶部盖一张滤纸压上洁净的鹅卵石。

[2]树脂处理：

取新树脂（已用水膨胀过的）置烧杯中，用五倍量的6-7%HCl浸泡过夜，先用离子水洗至pH3-4，改用蒸馏水洗至中性，再用5%NaOH（约2倍）搅拌洗涤后，水洗至中性，最后用6-7%HCl转型，蒸馏水洗至近中性。

[3]装树脂柱及交换原理

用蒸馏水将已处理好的树脂悬浮起来加到底部垫有脱脂棉的交换柱中，等树脂颗粒下沉后，其上覆盖一层棉花或一张滤纸，以免加入液体时，冲破树脂表面，注意在整个操作过程中树脂的上部要覆盖少量液体，以免进入空气，影响交换效果。

将树脂柱表层多余液体由底部打开活塞放出，待液层降至树脂层表面时，关闭活塞，由柱的上部加入含一叶萩碱的酸水，打开底部活夹。

控制流速，反应式如下：

RSO3-H++Alk-H+RSO3-·Alk-H++H+

洗脱：

将吸碱树脂用NH4OH碱化后，此反应如下：

RSO3-·Alk+NH4OHRSO3-NH4+Alk+H2O

TheDeterminationofQualitiesofAlkoloids

①取渗漉液1ml，加硅钨酸试剂（Bertrad’sreagent）数滴，产生淡黄色沉淀

②取渗漉液1ml，加碘化钾试剂（Wagner’sreagent）数滴，产生棕褐色沉淀

③取渗漉液1ml，加碘化铋钾试剂（Dragendorff’sreagent）数滴，产生棕红色沉淀

ThePreparationofSecurinineDerivatives：

1.硝酸一叶萩碱（SecurinineNitrate）的制备：

称取一叶萩碱200mg加6ml乙醚及9ml无水乙醇，使生物碱全部溶解，滴加10%硝酸无水乙醇液14ml，滴加乙醚至混浊,放置，白色结晶析出后,过滤，结晶用无水乙醇—乙醚（1：

1）洗涤数次,干燥，即得硝酸一叶萩碱。

硝酸一叶萩碱:

无嗅、味苦，溶于水，难溶于醇。

m.p.222℃

2.一叶萩碱的甲基化物的制备：

称取样品100mg，加碘甲烷（MeI）0.4ml及丙酮（Me2CO）10ml水浴回流1h，放冷结晶析出后，过滤，结晶用乙醇洗涤，用MeOH-EtOH重结晶,得针状结晶。

m.p.232.5℃（分解），反应式（Fig.11）：

Fig.11TheStructuresofSecurinineandMethylSecurinine

Identification

①TLC：

吸附剂：

Al2O3（碱性II-III）200目）

展开剂：

a.CHCl320mL

b.CHCl3:

石油醚（1：

1）10mL

c.CHCl3:

乙醇（9：

1）10mL

样品：

一叶萩碱/CHCl3液

标准品：

一叶萩碱/CHCl3液

计算Rfvalue，并据此作出结论。

②IR:

νmax（KBr,cm-1）（Fig.12）:

1790（不饱和内酯环上α－H）

1730（内酯环C=O）

1620（C=C）

3.UV:

λmax（EtOH,nm）:

256.7;311.6

4.比旋度的测定：

[α]d=-1042

Fig.12TheIRSpectrumofSecurinine

KeyUnderstandingandNotes：

1.理解用离子交换树脂提取生物碱的原理。

2.掌握装树脂柱的基本操作，避免柱中存有气泡。

3.注意交换时的流速及检查流出液的变化，分析发生变化的原理。

4.在使用沙氏提取器时，应作试教，讲解安装方法。

5.用石油醚回流洗脱时应注意防火。

6.回流洗脱时间一定大于3小时。

ExperimentalReport

1.定性实验结果、反应原理。

2.上柱前药液的pH----，半小时后流出液的pH----，二个半小时后pH----；试述pH发生变化的原理。

3.描图说明鉴定结果。

4.分析UV、IR光谱图。

Questions

1.用树脂提取生物碱的原理是什么？

为什么提取生物碱时必须考虑交联度？

2.用石油醚从树脂上回流洗脱一叶萩碱的原理是什么？

DevicesandDrugs（Table4and5，pergroup）

Table4

NameofDevicesStandardNumberNote

锥形瓶1000ml,50ml各1支

烧杯250ml1支

培养皿15cm1个

树脂柱2×60cm1支

沙氏提取器250ml1套

电水浴锅2孔1套

Table5

NameofDrugStandardNumberNote

andReagents

一叶萩碱标准品微量

H2SO4工业5－100ml

732＃阳离子树脂磺酸型60g湿重

NH4OHA-R15－20ml

苯A-R5ml

CHCl3A-R5ml

乙醇A-RO.4ml

石油醚工业或CP250－300ml沸程30－60℃

Al2O3中性或碱性II-III级5－10g

一叶萩叶150g

Arrangement

Table6

TimesTheContentofExperiment

第一次1处理树脂，装柱，进行交换；交换完毕后洗净置于培养皿中风

干；

2Alk定性试验。

第二次树脂和碱化，回流提取至终点后，倾出石油醚至小体积放置。

第三次1过滤结晶，烘干；

2制备衍生物。

第四次1一叶萩碱的TLC鉴定，m.p.,UV,IR测定；

2衍生物的熔点测定。

References：

omitted

EXPERIMENTALTWO:

THEEXTRACTANDIDENTIFICATIONOFRUTIN

（实验二、芦丁的提取及鉴定）

1Introduction

2PurposeandClaim

3MethodandNotes

3.1ExtractandIsolationofRutin

3.2IdentificationofRutin

3.2.1TheReactionofQuality

3.2.2ElucidationofUV

3.2.3ElucidationofNMR

3.2.4ThedeterminationofSugarsandAglyconeofRutin

3.2.4.1Hydrolysis

3.2.4.2IdentificationofAglycone

3.2.4.2.1DegradationbyAlkli

3.2.4.2.2ElucidationofUVSpectra

3.2.4.2.3TheDeterminationofMPofAcetylRutin

3.2.4.3PCDeterminationofSugars

4KeyUnderstandingandNotes

5ReportWriting

6Questions

7EquipmentsandReagents

8References

INTRODUCTION

芦丁（Rutin）广泛存在于植物界中，现已发现含芦丁的植物至少在70种以上，如烟叶、槐花、荞麦和蒲公英中均含有。

尤以槐花米（为植物Sophorajaponica的未开放的花蕾）和荞麦中含量最高，可作为大量提取芦丁的原料。

芦丁是由槲皮素（Quercetin）3位上的羟基与芸香糖脱水缩合形成的苷。

[芸香糖（Rutinose）为葡萄糖（Glucose）与鼠李糖（Rhamnose）组成的双糖。

]（Fig.13）

Fig.13TheStructureofRutin

本品为浅黄色粉末或极细的针状结晶，含有三分子的结晶水，熔点为174-178℃，无水物188-190℃。

溶解度：

1:

10000（冷水），1:

200（热水），1:

650（冷乙醇），1:

60（热乙醇），1:

12（冷吡啶）。

微溶于丙酮、醋酸乙酯,不溶于苯、乙醚、氯仿、石油醚，溶于碱而呈黄色。

提取芦丁的方法很多，目前我国多采用碱提取-酸沉淀法。

该法的提取原理是依据芦丁结构中含有酚羟基，能与碱反应生成盐而溶于水中，向此盐溶液中加入酸，则芦丁游离析出。

此外，还可以采用水或醇提取法。

芦丁具有维生素P样作用。

有助于保持及恢复毛细血管的正常弹性，主要用作防治高血压病的辅助治疗（但不能降压）剂，亦可防治因缺芦丁所致的其它出血症。

多作口服，也可作注射用。

PURPOSEANDDEMAND

Aims:

1.通过芦丁的提取与精制掌握碱-酸法提取黄酮类化合物的原理及操作。

2.通过芦丁结构的检识，了解苷类结构研究的一般程序和方法。

3.学习UV及NMR在黄酮类化合物结构鉴定中的应用。

Demands：

1.分离得到芦丁、槲皮素、全乙酰化芦丁；

2.能够根据化学试验及UV、NMR数据初步推断出芦丁的结构，并对利用谱学方法测定黄酮类化合物的结构有基本了解。

METHODANDNOTES

ExtractandIsolationofRutin（Fig.14）

SeedsofSophorajaponica（20g）

置500ml圆底烧瓶中，加水300ml，在搅拌下加入石灰乳，调至pH8－9[1]，加热套中加热至微沸，盖上滤纸，防止水分过分挥发，但要不时搅拌。

保持30min（注意滴加石灰乳维持pH8－9）趁热抽滤

ResidueFiltrate

（X）在60－70℃下用浓盐酸调至pH2－3[2],静置（2h）,抽滤

FiltratePrecipitation（cruderutin）

（X）重结晶[3]：

将一半沉淀悬浮于70倍蒸馏水中,加热煮

沸15min,趁热过滤

ResidueFiltrate

（X）充分静置2h，过滤,干燥（60-70℃）

Rutin（FinalProduct）

Fig.14TheFlowChartofIsolationofRutin

NOTES:

[1]加入石灰乳即可以达到碱溶解提取芦丁目的,尚可除去槐花米中的大量多糖类粘液质。

但pH不能过高,否则钙能与芦丁形成螯合物而析出沉淀。

[2]pH过低会使芦丁形成养钅羊（YANG）盐而降低收率

[3]利用芦丁在冷热水中溶解度的差别可达到结晶之目的。

得到的沉淀要粗称一下,按照芦丁在热水中1:

70的溶解度加蒸馏水进行重结晶。

IdentificationofRutin

1.芦丁的定性反应

取芦丁3～4mg,加95％乙醇5-6ml使溶,分成三份做下述试验:

（1）取上述溶液1-2ml,加2滴浓盐酸,再酌加少许镁粉,注意观察颜色变化情况.

（2）取上述溶液1-2ml,然后滴加2%ZrOCl2的甲醇溶液,注意观察颜色变化情况；

再继续向试管中加入2%柠檬酸的甲醇溶液,详细记录颜色变化情况.

（3）α-萘酚反应（Molish`sReaction）

取上述溶液1-2ml,加入等体积的10%α-萘酚乙醇溶液,摇匀,沿管壁滴加浓硫酸,注意观察两液界面产生的颜色变化.

Notes:

在样品溶液中加入2%ZrOCl2的甲醇溶液之后,如溶液呈黄色示结构中可能含有C3-OH或C5-OH。

再加入2%柠檬酸甲醇溶液,黄色不褪示有C3-OH；如黄色褪去,加水稀释后转为无色,示无C3-OH,但有C5-OH。

（上述两种条件下生成的锆络合物因对酸的稳定性不同,其中C3-OH、4-酮基络合物的稳定性大于C5-OH、4-酮基络合物.）

2.芦丁的紫外光谱解析

取芦丁溶于甲醇（光谱纯）中,加入规定的试剂（操作见附录），测定其UV光谱（Fig.15）,试解析光谱并初步判断其结构。

3．芦丁的NMR波谱解析

（1）芦丁的三甲基硅醚NMR谱的解析

取芦丁三甲基硅醚衍生物30mg,溶于0.5mlCCl4中,测定NMR图解如下（Fig.16）,试分析其结构.

Notes:

①δ0.8（d,3H,Rha-CH3）

②δ3.0-4.0（m,10H,为鼠李葡萄糖基质子）

③δ4.2（S,1H,为鼠李糖H-1）

④δ5.8（d,1H,J=7Hz,为葡萄糖基H-1,J＝7Hz,说明Glucose的构型为β型）

Fig.15TheUVSpectraofRutinAppendixwithsomeCheckingReagents

Fig.16TheNMRSpectraofRutin（TMSEtherDerivative）inCCl4

⑤δ6.15（d,1H,J=2Hz）与δ6.35（d,1H,J=2H）构成A、B系统，分别为H-6,H-8。

⑥δ6.9（d,1H,J=7Hz）为H-5’

δ7.3-7.5（2H,H-6’andH-2’）

（2）十乙酰化芦丁的