整理基因工程制药复习.docx
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整理基因工程制药复习
一、
名词解释
1.杂交
核酸分子杂交技术：
具一定同源性的两条（DNA或RNA）单链在适宜的温度及离子强度等
条件下，可按碱基互补配对原则特异性地复性，形成双链。
2.探针：
一段序列已知的单链核酸片段，通过互补的方式检测单链核苷酸序列。
3.粘粒
粘粒载体（cos质粒载体）：
Cos质粒是一类人工构建的含有λ-DNAcos序列和质粒复制子
的特殊类型的载体。
4.同尾酶：
识别的序列不同，但能切出相同的粘性末端。
如BamHI、BglⅡ、BclI、XhoⅡ等。
5.同裂酶：
来源不同的内切酶，识别和切割的是同样的核苷酸靶序列的酶。
不同同裂酶对位点的甲基化敏感性有差别，用来研究甲基化作用。
6.cDNA文库：
某生物mRNA反转录产生cDNA片段分别与合适的克隆载体相连，通过
转化贮存在一种受体菌的群体之中，把这种包含某生物基因组全部基因
cDNA的受体菌群体，称为该生物cDNA文库。
7.基因工程药物：
指利用基因工程技术研制和生产的药物，主要包括重组蛋白（多肽）
药物、反义核酸药物、DNA药物和基因工程抗体等。
8.盐析
盐析一般是指溶液中加入无机盐类而使某种物质溶解度降低而析出的过程。
9.星活性
星号（*）活性：
高浓度的酶、高浓度的甘油、低离子强度、极端pH值等，会使一些
核酸内切酶的识别和切割序列发生低特异性，即所谓的“星活性”现象。
EcoRI*代表EcoRI的星号活力。
星活性的特点：
限制酶识别序列特异性降低
例如：
EcoRI（高pH值或低盐离子强度）
5’GAATTC3’变成5’NAATTN3’，另有一种情况是对AATT中的A、T分辨不严格。
八、简答题
1.如何克隆微生物的纤溶酶基因？
PCR法分离目的基因：
根据核酸序列的相关信息，设计简并引物，通过对mRNA进行反转录得到cDNA，以cDNA为模板，然后将目的基因通过PCR方法扩增，或者直接从基因组DNA扩增的方法。
根据已知探针克隆基因：
首先将探针作放射性或非放射性标记，再将其与用不同内切酶处理的基因组DNA杂交，最后将所识别的片段从胶中切下来，克隆到特定的载体（质粒、噬菌体或病毒）中作序列测定或功能分析。
这种方法不但可以将基因克隆出来，还能同时观察该基因在基因组中的拷贝数。
但在探针杂交后，要注意高强度漂洗，以避免干扰信号，即保证克隆的特异性，同时节省时间。
用特异抗体克隆基因：
在获取理想的抗体后，可以用这些抗体筛选表达型基因组文库或cDNA 文库，从文库中将编码某一特异蛋白质的基因克隆出来。
若控制该性状的目的蛋白质不容易分离纯化，则PCR方法比较适宜，若蛋白质分离纯化容易，且有现成的基因文库，则后两种方法较为简单。
2.获得目的基因的途径有哪些？
一、化学合成法
（一）化学合成法的单元操作
从反应机理上分为：
磷酸二酯法、磷酸三酯法、亚磷酸三酯法、自动化合成法
操作过程：
液相合成、固相合成
化学合成一般由专门的公司完成，也可以通过基因合成仪自己完成。
（二）基因组装战略
1、小片段粘接法：
根据目的基因全序列，分别合成12~15碱基长的单链DNA小片段。
预先设计合成的片段之间都有互补区域，不同片段之间的互补区域能形成有断点的完整双链。
2、补丁延长法：
根据目的基因两条互补链全序列，分别合成12~15碱基长的单链DNA
小片段以及20~30碱基长的单链DNA中片段。
预先设计合成的短片段与长片段的某段序列互补。
3、大片段酶促法：
根据目的基因的全序列，分别合成40~50碱基长的单链DNA片段。
预先设计的片段之间有局部互补区，可以相互作为另一个片段延长的引物。
（三）DNA化学合成的用途
⏹合成天然基因：
胰岛素基因、干扰素等
有些基因比较短，化学合成费用较低。
⏹修饰改造基因，设计新型基因
“人造儿”
2010，5.20，美国64岁科学家10年耗资4000万美元用电脑进行基因设计改造后，用化学方法合成基因后导入到支原体细菌，DNA象正常细菌的基因一样进行复制——人造生命诞生。
⏹制备探针、引物、接头
⏹定点突变合成：
合成带有定点突变的基因片段
二、PCR技术（多聚酶链式反应）获得目的基因
缺点：
DNA聚合酶不能耐受高温，每个循环需额外添加DNA聚合酶。
1、已知序列基因的分离
（1）已知序列是DNA片段
根据研究的目的，通过已知DNA序列设计相应引物，直接利用PCR方法进行分离。
根据已知序列克隆基因
⏹对已知序列的基因克隆是基因克隆方法中最为简便的一种。
⏹目前，世界上主要的基因库有：
⏹EMBL，为设在欧洲分子生物学实验室的基因库
⏹Genbank，为设在美国国家卫生研究院（NIH）的基因库
⏹Swissport和TREMBL，Swissport是一蛋白质序列库，其所含序列的准确度比较高，而TREMBL只含有从EMBL库中翻译过来的序列
（2）若已知基因的mRNA序列，如何克隆该基因？
⏹首先要分离（或纯化）mRNA
⏹A：
根据mRNA序列直接设计引物
⏹B：
根据mRNA序列设计一条引物和OligoT/A引物进行PCR扩增
⏹C：
逆转录，以获得的cDNA为模板，进行PCR扩增
⏹……
2、未知序列基因的分离
（1）序列在其他物种上已有报道
具体做法：
⏹首先找出上述几个物种的PDS基因序列，进行比对
⏹寻找出其保守序列，根据保守序列设计引物（或简并引物）
⏹PCR扩增（DNA或RNA为模板）
如何根据蛋白序列克隆基因？
（2）已知部分序列，但不完全
可采取RACE技术
cDNA末端快速扩增技术是基于PCR技术由已知的部分cDNA序列来获得完整cDNA序列的一种方法。
3’RACE原理
利用mRNA的3’末端的poly（A）尾巴作为一个引物结合位点，以连有SMART寡核苷酸序列通用接头引物的Oligo（dT）30MN作为锁定引物反转录合成标准第一链cDNA。
然后用一个基因特异引物GSP1作为上游引物，用一个含有部分接头序列的通用引物UPM作为下游引物，以cDNA第一链为模板，进行PCR循环，把目的基因3’末端的DNA片段扩增出来。
5’RACE原理
先利用mRNA的3’末端的poly（A）尾巴作为一个引物结合位点，以Oligo（dT）30MN作为锁定引物在反转录酶MMLV作用下，反转录合成标准第一链cDNA。
利用该反转录酶具有的末端转移酶活性，在反转录达到第一链的5’末端时自动加上3~5个（dC）残基，退火后（dC）残基与含有SMART寡核苷酸序列Oliogo（dG）通用接头引物配对后，转换为以SMART序列为模板继续延伸而连上通用接头。
然后用一个含有部分接头序列的通用引物UPM作为上游引物，用一个基因特异引物2
（GSP2）作为下游引物，以SMART第一链cDNA为模板，进行PCR循环，把目的基因5’末端的cDNA片段扩增出来。
最终，从2个有相互重叠序列的3’/5’-RACE产物中获得全长cDNA，或者通过分析RACE产物的3’和5’端序列，合成相应引物扩增出全长cDNA。
（2）序列未报道
反向PCR：
根据已知DNA区的序列设计引物，以包含已知区和未知区的环化DNA分子为模板来扩增未知DNA区序列的PCR技术。
TAIL-PCR，即交错式热不对称PCR，是一种染色体步移技术。
⏹根据已知DNA序列，分别设计三条同向且退火温度较高的特异性引物，与经过独特设计的退火温度较低的兼并引物（可以设计多条），进行热不对称PCR。
⏹通常情况下，其中至少有一种兼并引物可以与特异性引物之间利用退火温度的差异进行热不对称PCR反应，一般通过三次巢式PCR反应即可获取已知序列的侧翼序列。
⏹如果一次实验获取的长度不能满足实验要求时，还可以根据第一次步移获取的序列信息，继续进行侧翼序列获取。
随着基因组测序技术的发展，以PCR途径获得目的基因的重要性更加突出！
三、基因文库法获得目标基因
基因库：
特定生物体全基因组的集合（天然存在）。
每个种群都具有其独特的基因库。
基因文库：
通过克隆的方法将某一基因组DNA或mRNA保存于适当宿主菌中形成的转化子群。
所有重组DNA组合代表该基因组的全序列。
根据构建方法的不同，基因文库分为：
基因组文库和cDNA文库
（一）基因文库的容量和完备性
在构建的基因文库中任一基因存在的概率，它与基因文库最低所含克隆数N之间的关系可用下式表示：
N=ln（1-P）/ln（1-f）
P=任一基因被克隆（存在于基因文库中）的概率
F=克隆片段的平均大小/生物基因组的大小
影响因素：
基因组大小、目的基因在基因组中的拷贝数、克隆载体的容量及目的基因的大小
基因文库的完备性：
在构建的基因文库中任一基因存在的概率。
完备性越高，文库容量越大。
例：
人的单倍体DNA总长为2.9×109bp，基因文库中克隆片段的平均大小为15kb，则构建一个完备性为0.9的基因文库至少需要45万个克隆；而当完备性提高到0.9999时，基因文库至少需要180万个克隆。
（二）理想基因文库条件
1、完备性高，筛选任一基因的概率均应为99%
2、重组克隆的总数不宜过大
3、载体的装载量最好大于基因的长度
4、克隆与克隆之间必须存在足够长度的重叠区域
5、克隆片段易于从载体分子上完整卸下
6、重组克隆能稳定保存、扩增、筛选
（三）基因组文库及其构建程序
基因组文库：
包含某种生物基因组全部遗传信息的一系列DNA片段，通过克隆载体贮存在一种受体菌的群体中，这个群体称为这种生物的基因组文库。
文库中所有克隆所携带的DNA片段重新组合起来可以覆盖该生物的整个基因组。
基因组文库的构建程序
1、基因组DNA的制备和切割（保证DNA片段之间存在部分重叠；DNA片段大小均一）
超声波处理；限制性内切酶部分酶切
2、载体和受体的选择
载体：
λ-DNA或cosmid质粒，大型基因组使用YAC或BAC
受体：
大肠杆菌或酵母菌
3、DNA片段和载体的相连
直接连接、人工接头或同聚物加尾
4、重组体转化宿主细胞，构建形成了基因组文库的初库
5、初库扩增形成终库
把培养皿上的细菌全部洗下加以保存
（四）cDNA文库
定义：
某生物mRNA反转录产生cDNA片段分别与合适的克隆载体相连，通过转化贮存在一种受体菌的群体之中，把这种包含某生物基因组全部基因cDNA的受体菌群体，称为该生物cDNA文库。
cDNA文库的特点是什么？
（1）不含内含子序列；
（2）可以在细菌中直接表达；（3）包含了所有编码蛋白质的基因；（4）比DNA文库小，容易构建
（五）从文库中筛选目的基因
探针法：
杂交；阳性克隆；质粒提取纯化；酶切或测序验证
PCR法：
设计引物；PCR；电泳检测；质粒提取纯化；酶切或测序验证
其他方法
四、转座子标签法获得目的基因
转座子：
指位于染色体上可以从基因组的一个位置转移到另一个位置的DNA片段或基因。
转座子标签法获得目的基因流程
五、图位克隆获得目的基因
Ø图位克隆：
又叫定位克隆
Ø根据目的基因在染色体上的位置进行分离基因，无需预先知道基因的DNA顺序，也无需预先知道其表达产物的有关信息。
可通过染色体步移技术逐步逼近目标基因。
六、mRNA差别显示技术获得差异表达的基因
mRNA差别显示技术：
对组织特异性或诱导专一性表达基因进行分离的有效方法之一。
将mRNA逆转录和PCR技术相互结合发展起来的一种RNA指纹图谱技术，也称为DDRT-PCR。
七、酵母双杂交系统分离目的基因
酵母双杂交系统：
将待研究的两种蛋白质的基因分别克隆到酵母表达质粒的转录激活因子（如GAL4等）的DNA结合结构域和GAL4激活结构域，构建成融合表达载体，从表达产物分析两种蛋白质相互作用的系统。
功能：
有效地分离能与一种已知的诱饵蛋白相互作用的蛋白质。
八、生物信息技术分离和鉴定目的基因
电子克隆
电子克隆技术以数学为核心，以计算机和互联网为工具，利用现有的表达序列标签（EST）和生物信息数据库，可以加速对人类基因组未知功能新基因的发掘，为人类功能基因组学与蛋白质组学研究提供新的线索和基础。
利用电子克隆并结合实验验证可以纠正或避免现有的人类基因组编码序列错误。
3.限制性内切酶的特点（掌握如何从给出的序列中寻找酶切位点）。
核酸限制性内切酶的类型及主要特性
Ⅱ类限制性核酸内切酶的基本特性
1）在DNA双链的特异性识别序列部位切割DNA分子，产生链的断裂；
2）两个单链断裂部位在DNA分子上的分布，通常不是彼此直接相对的；
3）因此，断裂的结果形成的DNA片断，也往往具有互补的单链延伸末端。
限制酶的其它特性
✓限制酶识别靶序列同DNA的来源无关；
✓限制酶识别靶序列是唯一的（对某种限制酶只具一个限制性切割位点）。
在三个限制与修饰系统中，只有II型限制酶与甲基化酶具有相当高的核苷酸识别特异性，因而被广泛用于基因工程中。
Ⅱ型在限制与修饰系统所占的比例达到93%。
它们识别回文对称序列，在回文序列内部或附近切割DNA，产生带3’-羟基和5’-磷酸基团的DNA产物，需Mg2+的存在才能发挥活性，相应的修饰酶只需SAM（S-腺苷甲硫氨酸）。
识别序列一般为4-6bp，切割位置因酶而异。
II型限制性核酸内切酶的基本特点
1、识别位点的特异性：
每种酶都有其特定的DNA识别。
位点，通常是由4~8个核苷酸组成的特定序列（靶序列）。
2、识别序列的对称性：
靶序列通常具有双重旋转对称的结构，即双链的核苷酸顺序呈回文
结构。
3、切割位点的规范性：
交错切或对称切（可形成粘性末端或平末端的DNA分子）。
Ⅱ型限制性核酸内切酶的基本特性
1）识别序列
✓绝大多数的Ⅱ型限制性核酸内切酶都能够识别由4~8个核苷酸组成的特定的核苷酸
序列。
限制性核酸内切酶就是从其识别序列内切割DNA分子的，因此这些识别序列又叫
核酸内切酶的切割位点或靶序列。
✓识别序列有连续的（如GATC）和间断的（如GANTC）两种，它们都呈回文结构。
回文结构：
双重旋转对称结构，即有一个中心对称轴，从这个轴朝两个方向读序列是完全
一样的。
序列正读和反读是一样的。
什么是回文序列？
双链DNA中的一段倒置重复序列，当该序列的双链被打开后，可形成发夹结构。
这段序列被称为回文序列。
2）切割方式
Ⅱ限制性核酸内切酶切割双链DNA，水解磷酸二酯键中3’位酯键产生两个末端，末端结构是5’-P和3’-OH，产生3种不同的切口。
补：
位点偏爱
✓某些限制酶对不同位置的同一个识别序列表现出不同的切割效率的现象称作位点偏爱。
✓λ噬菌体DNA全长48502bp，有5个EcoRⅠ酶切位点。
切割时并非在5个位点随机
进行，靠近右端的位点比分子中间的位点切割快10倍。
造成位点偏爱现象的原因
Ø限制酶在切割DNA之前需要同时与两个识别位点作用；
Ø限制酶对要求作用的DNA序列有两个明显不同的结合位点，其中一个是为DNA
切割时激活另一个的变构位点。
4.PCR的类型及其应用（举例介绍）。
PCR的类型及应用
一、PCR的类型
重组PCR不对称PCR
反向PCR多重PCR
原位PCRRT－PCR
巢式PCR递减PCR
热启动PCR实时定量PCR
1、巢式PCR
用第2对引物来验证用第1对引物所扩增的PCR产物
3、热启动PCR（HotStartPCR）
✓热启动主要是通过抑制一种基本成分延迟DNA合成，直到PCR仪达到变性温度；
✓现在有很多公司都有HotStartTaq酶出售，该酶具有热启动的性能，使用简单方便，
适合于高通量应用；
✓热启动PCR是除了好的引物设计之外，提高PCR特异性最重要的方法之一。
4、RT-PCR
✓逆（反）转录酶以mRNA为模板合成第1条cDNA链，然后通过PCR反应扩增出
许多cDNA分子拷贝。
✓RT-PCR是扩增mRNA的快速及灵敏的方法。
1）检测某一基因在转录水平的表达
2）克隆特异的cDNA
5、qRT-PCR，RealTimeQuantitativePCR
在PCR反应体系中加入荧光报告基团，利用荧光信号的积累实时监测PCR反应进程，对扩增的PCR产物进行定量分析的方法。
∙具有高度敏感性：
用于检测微量的DNA或RNA样品；
∙检测每一次PCR循环中产物的积累；
∙扩增反应结束后不需要对PCR产物进行电泳。
二、PCR的应用
1研究：
基因克隆，DNA测序，分析突变
2诊断：
细菌、病毒、寄生虫检测，诊断
3人类基因组工程：
遗传图谱的构建，DNA测序，表达图谱
4法医：
犯罪现场标本分析
5肿瘤：
各种肿瘤检测
6其他……
5.电泳上样缓冲液的作用有哪些？
上样缓冲液：
临上样到凝胶加样孔之前与待电泳的样品相混合的一种缓冲液。
三个作用：
1）增加样品密度保证DNA沉入加样孔内
2）使样品带有颜色便于简化上样过程
3）指示剂（染料）在电场中的迁移可以为预测样品的迁移位置作参考
6.如何估算引物的Tm值？
Tm值：
就是DNA熔解温度，指把DNA的双螺旋结构降解一半时的温度。
或者：
DNA在加热变性过程中，紫外吸收值达到最大值的50%时的温度称为核酸的变性温度或解链温度，用Tm表示。
Ø不同序列的DNA，Tm值不同
ØDNA中G/C含量越高，Tm值越高，成正比关系
ØTm值与溶剂性质有关：
离子强度低，Tm值低
Tm值的计算：
1）长度为25mer以下的引物，Tm计算公式为：
Tm=4℃（G+C）+2℃（A+T）
2）对于更长的寡聚核苷酸，Tm计算公式为：
Tm=81.5+16.6×Log10[Na+]+0.41（%GC）–600/size
公式中，Size=引物长度
7.基因文库的特点是什么？
8.药物蛋白分离纯化的技术要求有哪些？
分离纯化技术要求：
（1）技术条件要温和，能保持目的产物的生物活性；
（2）选择性要好，能从复杂的混合物中有效的地将目的产物分离出来，达到较高纯化倍数；
（3）收率要高；
（4）两个技术之间要能直接衔接，不需要对物料加以处理或调整，这样可减少工艺步骤；
（5）整个分离纯化过程要快，能够满足高生产率的要求。
根据蛋白本身的特性，在分离纯化工作中必须注意下列问题：
（1）要注意防止蛋白的变性失活
（2）蛋白的分离纯化的目的是将目标蛋白以外的所有杂质尽可能的除去，因此，在不破坏所需蛋白的条件下，可使用各种“激烈”的手段
9.包涵体及其形成的原因是什么？
当外源蛋白质在大肠杆菌中高效表达时常形成不可溶、无生物活性的聚集体，又称包涵体。
包涵体必须经过变性、复性才能获得生物学功能。
而这种变性/复性是在体外环境中进行，缺乏辅助肽链折叠的酶系和分子，造成重组蛋白质在复性过程中形成大量的很难再溶解的蛋白质聚集体，使以包涵体形式存在的高效表达产物大部分成为“看得见，拿不到”的废品。
包涵体的形成原因：
目前认为，包涵体的形成有如下原因：
①表达蛋白的速率过快、浓度过高，生成的蛋白质没有足够的时间和空间折叠形成正确结构
②蛋白在折叠过程中疏水区暴露于溶液中，分子间的相互作用形成错误折叠导致凝集
③表达环境的细胞内部还原性过高，使蛋白质中二硫键稳定性下降，
出现错配或多余的二硫键
④培养温度、pH值、某些金属离子等因素影响包涵体动力学的稳定
⑤原核系统缺乏真核系统对真核生物蛋白的加工和修饰功能
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