HPLC法定量分析水中光合细菌菌体产量.docx
《HPLC法定量分析水中光合细菌菌体产量.docx》由会员分享，可在线阅读，更多相关《HPLC法定量分析水中光合细菌菌体产量.docx（22页珍藏版）》请在冰豆网上搜索。
HPLC法定量分析水中光合细菌菌体产量
HPLC法定量分析水中光合细菌菌体产量
摘要:
为了定量分析水中光合细菌（PSB）菌体产量，为光合细菌污水资源化提供方法依据，采用HPLC法分析CoQ10的质量，进而测得水中PSB的菌体产量．实验结果表明，色谱条件为:
色谱柱为SphherisorbC18（10cm×4.6mmID）柱;甲醇与无水乙醇为流动相，体积比9∶1;流速为1mL/min;柱温35℃;紫外检测波长275nm;进样量15μL;柱压16.4MPa．先用丙酮提取5h后挥掉全部丙酮，再用无水乙醇溶解，这一提取方法对CoQ
10的相对提取率最高．加外标检测法平均回收率为99.13%，相对标准偏差为0.81%（n=5）．不同培养条件及生长时期的PSB内CoQ10的含量十分稳定．废水中杂质、杂菌等干扰因素均不影响CoQ10的检测结果．PSB质量浓度为（Y+37.487）/25.431g/L，其中Y为峰面积（V·s）．该方法简便易行，结果准确，可用于水中PSB菌体含量的定量分析．
关键词:
HPLC;PSB;CoQ10;菌体产量;污水资源化
HPLCquantificationofphotosyntheticbacteriainwater
Abstract:
Totestbiomassofphotosyntheticbacteria（PSB）inwater，andtoprovideawayofPSBsewage
reclamation，thispaperadoptedHPLCtoanalyzetheconcentrationofCoQ
10
andthusobtainedtheconcentra-
tionofPSBinwater．Theresultsshowthatthechromatographicconditionisasfollows:
Thechromatographic
columnisSphherisorbC18（10cm×4.6mmID）;methanol-absolutealcohol（9∶1）asmobilephaseataflow
rateof1mL/min;columntemperature35℃;WaveLengthofUVdetector275nm;samplesize15μL;col-
umnpressure16.4MPa．Byextracting5hwithacetone，volatilizingacetonecompletelyanddissolvingitwith
absolutealcohol，thismethodmayobtainthemaximumrelativeextractionofCoQ
10．
Theaveragerecoveryratio
ofexternalreferencemethodis99.13%andRSD0.81%．Thehighestradiance-extractionisacetoneextrac-
tion5hbeforeevaporatingcompletelyandthensolvinginethanol．TheconcentrationofCoQ
10
inPSBinvari-
ousculturalconditionsandgrowingphasesisquitestable．Theimpuritiesormicrobesinwastewaterdonotaf-
fectthetestingresult．TheconcentrationofPSBis（Y+37.487）/25.431g·L
－1
，Yispeakarea（V·s）．
Thismethodissimpleandaccurate，andcanbeusedforquantitativeanalysisofPSBinwater．
Keywords:
HPLC;PSB;CoQ
10
;biomass;sewagereclamation
收稿日期:
2010－09－26．
基金项目:
国家自然科学基金重点项目（50978072）．
作者简介:
赵微（1982—），女，博士研究生;
张光明（1973—），女，教授，博士生导师．
光合细菌（Photosyntheticbacteria，PSB）是一类
以光作为能源、能在光照厌氧或黑暗好氧条件下利
用有机物、硫化物、氨等作为供氢体兼碳源进行光合
作用的微生物．PSB能有效处理高浓度有机废水
［1］
，
对淀粉、豆制品加工
［2］
、啤酒厂
［3］
、油脂工业等工业
废水及生活污水，处理效果好，对COD的去除率达
到60%～95%，且PSB菌体本身含有丰富的营养物
质和生理活性物质
［4］
，能够作为肥料、饲料、饵料
［5］
回收利用，在处理废水的同时可实现污水资源化．然
而，由于废水中各种干扰物质的存在，使得废水中PSB菌体产量的准确测量存在问题．
在纯培养条件下PSB的定量检测方法包括显
微镜直接计数法、平板计数法、紫外分光光度法与
可见分光光度法、HPLC法等．显微镜直接计数法
随机性大，不能宏观、全面地反应菌体数量，在废水
处理中一般不采用该方法．平板计数法计数周期
长、方法复杂，在废水处理中一般也不采用该方法．
紫外分光光度法与可见分光光度法受废水中杂质
影响较大，尤其是受色度的影响，因此这2种方法
不适合检测带有浊度或色度的废水．HPLC法虽然
方法简便易行、精确、不受废水中杂质影响，但不能
将PSB作为直接检测物来分析．吴祖芳等的研
究
［6］
表明，PSB中含有一种特征物质CoQ
10
［7］
（CoQ
10
又称泛醌，化学名称为2，3－二甲氧基－5－
甲基－6－癸异戊烯基－1，4－苯醌）．其在PSB中
含量较高且相对稳定，可以用它的含量来定量表征
PSB的菌体产量．目前CoQ
10
的检测方法包括紫外
分光光度法、可见分光光度法、HPLC法等．同样由
于废水中杂质的干扰，导致不能使用分光光度法分
析CoQ
10
的质量．可选的检测方法只有HPLC法，目
前测定废水中PSB内CoQ
10
质量的HPLC方法，国
内外未见报道．因此本文研究采用HPLC法分析
CoQ
10
的含量以表征废水中PSB的菌体含量，排除
各种干扰因素，拟建立定量分析废水中PSB菌体
产量的方法，以期为PSB在废水中的检验与定量
分析提供科学依据．
1试验
1.1材料
试验所采用的光合细菌为球形红假单胞菌
（Rp．sphaeroids），购于中科院微生物研究所．试
验采用活性污泥模拟废水中各杂菌，污泥取至处
理生活污水A/O工艺的二沉池．试验废水采用浊
度较大，有机物质含量较多的人工配水来模拟大
豆废水．试验仪器与药品:
冰箱（BCD－216ST，
Haier）;超声波清洗器（HS3120，BENCHTOP-
CLEANERS）;高效液相色谱（Agilent1200，Agi-
lentTechnologies，Inc．）．CoQ
10
标准品（Sigma公
司生产）;甲醇、无水乙醇、乙腈、丙酮均为色
谱纯．
1.2方法
CoQ
10
标准样品的制备:
取CoQ
10
标准样品
30mg，加入无水乙醇40mL，在50℃水浴中震荡
溶解．放冷后，转移至100mL容量瓶中，用无水乙
醇稀释至刻度摇匀，作为标准品母液，将母液分别
稀释为3.0、2.5、2.0、1.5、1.0mg/L．所有样品均
经0.45μm膜过滤待用．
纯培养基中CoQ
10
的提取方法:
取2.5mL发
酵液在11000r/min的条件下离心10min，分离
上清和菌体．菌体用去离子水洗至中性，得到菌体
细胞待用．CoQ
10
的提取采用冻融辅助超声法
［8］
，
将菌体细胞放入冰箱冷冻区冷冻24h后提取溶
剂．样品均经0.45μm膜过滤后取上清液进行
HPLC分析．杂质中CoQ
10
的提取方法为:
分别取
7200mg/L的大豆废水、160mg/L的PSB、
7200mg/L的大豆废水加160mg/L的PSB，
CoQ
10
的提取方法同上．杂菌中CoQ
10
的提取方法:
取2.5mL质量浓度为10000mg/L的活性污泥，
在11000r/min的条件下离心10min，分离上清和
菌体．菌体用去离子水洗至中性，得到菌体细胞，
CoQ
10
的提取方法同上．不同培养条件CoQ
10
的提
取方法:
将PSB在纯培养基中纯培养7d，光照－
溶解氧条件分别为光照－厌氧、黑暗－好氧、自然
光－微好氧．分别取不同培养条件的发酵液
2.5mL，CoQ
10
的提取方法同上．不同生长时期
CoQ
10
的提取方法:
将PSB在纯培养基中培养，光
照－溶解氧条件为自然光－微好氧．分别在第
24、48、72、96h取发酵液2.5mL，CoQ
10
的提取方
法同上．安静等研究
［9］
表明PSB生长前36h为延
滞期，36～72h为生长期，从72h开始进入稳定
期，96h以后细胞进入衰亡期．加样回收率试验
方法:
采用外标加样回收法，取已知含量的CoQ
10
样品5份，精密称定，分别置具塞的锥形瓶中，加
同量的废水（7200mg/L）、PSB（160mg/L），
CoQ
10
的提取方法同上．
2结果与讨论
2.1色谱条件
流动相的选择:
选用的色谱柱为Sphherisorb
C18（10cm×4.6mmID）柱，柱温35℃，紫外检
测波长275nm，进样量15μL．流动相分别为甲醇
和水、甲醇和乙腈、无水乙醇和水、甲醇和无水乙
醇．当流动相为甲醇和水时，检测不到CoQ
10
标准
品．当流动相为甲醇和乙腈时，两者任意比例关系
下，色谱峰或者不出峰，或者峰型不对称．当流动
相为无水乙醇和水时，由于无水乙醇粘度大，
CoQ
10
标准品的保留时间长，柱压特别高．当流动
相为甲醇和无水乙醇时，色谱峰峰型对称出峰较
好，因此对甲醇与无水乙醇的比例进行深入研究．
分别配制甲醇与无水乙醇的体积比为1∶1、3∶2、
4∶1、9∶1进行实验，随着流动相甲醇比例的增加
CoQ
10
标准品的保留时间缩短，当甲醇和无水乙醇
·54·哈尔滨工业大学学报第43卷比例为3∶2时，在28.773min出峰，当两者比例
为4∶1时，在23.257min处出峰，当两者比例为
9∶1时，在21.183min处出峰．综合比较后发现，
不同比例甲醇与无水乙醇为流动相时峰型都很
好，出峰时间选择甲醇与无水乙醇的比例为9∶1．
流速的选择:
当流速为0.6mL/min时，CoQ
10
标准品的保留时间超过35min，保留时间过长．当
流速为1.5mL/min时，柱压过高．当流速为
1mL/min时，CoQ
10
标准品的保留时间
21.183min，柱压16.4MPa．综合比较，选择流速
为1mL/min．
综合上述结果，本文提出的色谱条件:
色谱
柱为SphherisorbC18（10cm×4.6mmID）柱;甲
醇与无水乙醇（体积比9∶1）为流动相;流速为
1mL/min;柱温为35℃;紫外检测波长为
275nm;进样量为15μL;柱压为16.4MPa．在此
条件下，色谱出峰快、峰型良好．采用如上确立的
HPLC检测方法，获得CoQ
10
标准品谱图与标准曲
线分别见图1与图2，由图可见，CoQ
10
标准品的保
留时间为21.183min，CoQ
10
标准品密度与峰面积
具有良好的相关性．
0.02
0.01
0
-0.01
7.515.022.530.0
t/min
U
/
V
图1CoQ
10
标准品HPLC色谱图
2.2提取溶剂的选择
由于CoQ
10
为细胞内物质，其提取效果的好
y=623.32x-37.487
R
2
=0.9848
2000
1500
1000
500
0
0.71.42.12.83.5
籽（C
O
Q
10
）/（10
-3
g·L
-1
）
峰
面
积
/
（
V
·
s
）
图2CoQ
10
标准曲线
坏直接关系到产品的收率，许芳等研究表明采用
乙醇与丙酮对PSB中CoQ
10
提取效果较好．本文
对菌体细胞分别采用:
1）无水乙醇提取5h;2）丙
酮提取5h;3）丙酮提取5h后，挥发去除全部丙
酮，用无水乙醇溶解．不同提取溶剂对CoQ
10
提取
率的影响见图3，可见，先用丙酮提取5h后，挥发
掉全部丙酮，再用无水乙醇溶解，这一提取方法相
对提取率最高．
120
90
60
30
0
乙醇丙酮先乙醇后丙酮
相
对
提
取
率
/
%
图3不同溶剂对CoQ
10
提取率的影响
2.3外标加样回收率及检测限实验
采用上述确立的检测方法及提取方法，并进
行外标加样实验，加样回收率见表1．平均回收率
为99.13%，相对标准偏差为0.81%（n=5）．实
验表明，上述方法精密度高，重复性好，可用于
CoQ
10
的提取与检测．
表1加样回收率（n=5）
样品中CoQ
10
质量/mg对照品中加入CoQ
10
质量/mgCoQ
10
总质量/mg回收率
/%
6.403.209.6099.17
6.406.4012.8099.23
6.409.6016.0099.01
6.4012.8019.2099.21
6.4016.0022.4099.04
表2样品中CoQ
10
质量检测限试验可见，当
CoQ
10
质量浓度低于9.6mg/L时，检测结果出现
很大的偏差，当CoQ
10
质量浓度高于22.4mg/L时，
由于质量浓度过高也出现很大的偏差，可重复性
差，因此对CoQ
10
质量浓度的检测限为9.6～
22.4mg/L．当CoQ
10
质量浓度低于3.2mg/L时，
应先浓缩再进行检测，当CoQ
10
质量浓度高于
22.4mg/L时，应先稀释再进行检测．
·55·
第12期赵微，等:
HPLC法定量分析水中光合细菌菌体产量2.4不同培养条件与培养时期对PSB内CoQ
10
质量的影响
PSB内CoQ
10
的含量是否稳定将直接关系到
检测方法的可行性．PSB培养条件光照－溶解氧
组合的不同可能导致PSB代谢类型不同，不同代
谢类型的PSB内CoQ
10
的质量可能不同
［10］
．同一
种微生物在不同的生长时期，由于细胞代谢活力、
对不良条件的抵御能力、菌体体积的不同可能引
起CoQ
10
含量不同．不同培养条件及培养时期PSB
内CoQ
10
质量的研究见图4和图5．
表2检测限试验
样品中CoQ
10
质量浓度/（mg·L
－1
）回收率/%
3.2070.15±2.89
9.6099.17±0.92
22.4099.04±0.84
25.6080.01±2.37
45
30
15
0
黑暗-好氧光照-厌氧自然光-微好氧
m
（
C
o
Q
1
0
）
/
g
图4不同培养条件每克烘干后PSB内CoQ
10
的质量
由图4可见，黑暗－好氧、光照－厌氧、自然
光－微好氧条件下，每克烘干后PSB内CoQ
10
的质
量分别为（41.2±1.7）、（41.6±1.3）、（41.3±
2.3）mg，不同培养条件下每克烘干后的PSB内
CoQ
10
的质量稳定．
44
33
22
11
0
迟缓期稳定期
m
（
C
o
Q
1
0
）
/
g
对数期衰亡期
图5不同培养时期每克烘干后PSB内CoQ
10
的质量
由图5可见，在不同培养时期迟缓期、稳定期、
对数期、衰亡期每克烘干后PSB内CoQ
10
的质量分
别为（39.8±1.4）、（41.4±2.0）、（40.3±1.8）、
（40.1±1.9）mg．不同培养时期每克烘干后PSB内
CoQ
10
的质量稳定．
2.5废水中干扰因素对PSB内CoQ
10
质量的影响
废水中的糖类、蛋白质、脂类等杂质的存在可
能干扰CoQ
10
的检测．处理污水过程中不可避免地
会感染杂菌，杂菌的菌群中可能含有PSB，因此杂
菌的存在也可能干扰CoQ
10
的检测．废水中干扰因
素的研究见图6和图7．
45
30
15
0
发酵液大豆废水发酵液+大豆废水
m
（
C
o
Q
1
0
）
/
g
图6发酵液、大豆废水、发酵液+大豆废水中每克烘干后
PSB内CoQ
10
的质量
由图6可见，发酵液、大豆废水、发酵液+大
豆废水中每克烘干后PSB内CoQ
10
的质量分别为
（41.5±1.5）、0、（40.3±1.9）mg．废水本身不含
有PSB，废水中杂质的存在不干扰CoQ
10
的检测．
45
30
15
0
发酵液杂菌发酵液+杂菌
m
（
C
o
Q
1
0
）
/
g
图7发酵液、杂菌、发酵液+杂菌中每克烘干后PSB内
CoQ
10
的质量
由图7可见，发酵液、杂菌、发酵液+杂菌中
每克烘干后PSB内CoQ
10
的质量分别为（41.5±
2.1）、（61.2±0.01）、（41.0±1.7）mg．杂菌中
CoQ
10
的含量十分的少，与废水中PSB内CoQ
10
的
质量不在同一数量级上，因此杂菌的存在不干扰
CoQ
10
的检测．
由图4～7可见，不同培养条件及培养时期的
PSB内CoQ
10
质量分数非常稳定，废水中的杂质以
及杂菌等干扰因素均不影响CoQ
10
的检测．表明本
方法可用于水及废水中CoQ
10
质量的检测，从而可
用于分析水及废水中PSB的产量．
2.6PSB菌体产量的换算
由图1可知，CoQ
10
质量浓度与峰面积关系为
Y=623.32X－37.487．
·56·哈尔滨工业大学学报第43卷其中:
X为CoQ
10
的质量浓度，g/L;Y为峰面积，
V·s;R
2
=0.9848）．
CoQ
10
质量分数为
w（CoQ
10
）=
ρ（CoQ
10
）
ρ（PSB）
×100%．
由图4和图5可知，CoQ
10
质量分数为
4.08%．
由式
（1）、
（2）可得，峰面积与PSB质量浓度
的关系为
ρ（PSB）=
Y+37.487
25.431
．
3结论
1）利用HPLC法分析水与废水中CoQ
10
的质
量来定量表征PSB的产量，建立了一个定量表征
水及废水中PSB含量的方法．提出色谱条件为:
色谱柱为SphherisorbC18（10cm×4.6mmID）
柱;甲醇与无水乙醇为流动相，体积比9∶1;流速为
1mL/min;柱温35℃;紫外检测波长275nm;进样
量15μL;柱压16.4MPa．
2）先用丙酮提取5h后挥掉全部丙酮再用无
水乙醇溶解这一提取方法对CoQ
10
的相对提取率
最高．平均回收率为99.13%，相对标准偏差为
0.81%（n=5）．不同培养条件及培养时期PSB内
CoQ
10
的含量十分稳定．废水中杂质、杂菌等干扰
因素均不影响检测结果．
3）PSB质量浓度为（Y+37.487）/25.431g/L，
其中Y为峰面积，V·s，可用上述方法定量分析水
中PSB的菌体产量．
参考文献:
［1］LIUHuiling，ZHANGZhanfeng，LIChangling，etal．
Effectofphotosyntheticbacteriaontilapiabasedonwa-
terqualityanddiseaseresistence［J］．FisheryModerni-
zation，2009，6（10）:
1003－1011．
［2］LIUShuangjiang．Hydrogenproductionfromsoybean
wastewaterbyimmobilizedphotosyntheticBacteria［J］．
ChineseJournalofEnviromentalScience，1995，1
（1）:
12－19．
［3］戴晓，张光明．光合细菌（Z08）啤酒废水资源化研究
［J］．哈尔滨工业大学学报，2010，42（6）:
937－940．
［4］F
升级会员 