生物技术概论.docx

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生物技术概论

一、绪论

1、微生物初级发酵三过程。

1）上游处理过程：

对粗材料进行加工，作为微生物的营养与能量来源。

2）发酵和转化：

发酵-微生物大量生长；转化-微生物生理特性的改变。

连续生产目的产品（抗生素、氨基酸、蛋白质等）

3）下游处理过程：

目的产物的纯化过程（既可从细胞培养液中纯化，也可直接从细胞中纯化）。

2、现代生物工程包括哪些内容？

基因工程、细胞工程、酶工程、发酵工程、蛋白质工程等技术。

3、基因工程概念。

基因工程是以分子遗传学为理论基础,以分子生物学和微生物学的现代方法为手段,将生物的遗传物质在体外进行切割、拼接和重组，然后导入活体细胞或个体，从而改变生物原有的遗传特性,获得新品种,生产新产品,或是研究基因的结构和功能。

4、酶工程概念。

利用酶、细胞器或细胞所具有的特异生物催化功能,对酶进行修饰改造，并借助工程手段来生产人类所需产品的一门技术。

二、基因工程

1、操纵子定义。

是基因表达的协调单位，由启动子、操纵基因及其所控制的一组功能上相关的结构基因所组成。

操纵基因受调节基因产物的控制。

2、乳糖（LAC）操纵子的作用机理（三个基因）。

3、基因工程三大条件。

A用于核酸操作的工具酶

B用于基因克隆的载体

C用于基因转移的受体菌或细胞

4、用于核酸操作的工具酶（5个酶）。

限制性核酸内切酶、DNA连接酶、DNA聚合酶、核酸酶、核酸修饰酶

5、同功异源酶的定义。

来源不同的限制酶，识别顺序相同，切割位点可以相同也可以不同，这些酶称同功异源酶。

6、同尾酶的定义。

有些限制性内切酶虽然识别序列不完全相同，但切割DNA后，产生相同的粘性末端，称为同尾酶。

7、连接酶的功能（3方面）。

修复双链DNA上缺口处的磷酸二酯键

修复与RNA链结合的DNA链上缺口处的磷酸二酯键

连接多个平头双链DNA分子

8、K（Klenow）酶的基本功能（4点）。

补平由核酸内切酶产生的5‘粘性末端

DNA片段的同位素末端标记

cDNA第二链的合成

双脱氧末端终止法测定DNA序列

9、T4—DNA酶的基本特性。

5‘→3‘的DNA聚合酶活性和3‘→5‘的核酸外切酶活性

在无dNTP时，可以从任何3‘-OH端外切

在只有一种dNTP时，外切至互补核苷酸暴露时停止

在四种dNTP均存在时，聚合活性占主导地位

10、DNA聚合酶的特性。

热稳定DNA聚合酶

5’-3’聚合活性

5’-3’外切酶活性

11、载体的功能。

运送外源基因高效转入受体细胞

为外源基因提供复制能力或整合能力

为外源基因的扩增或表达提供必要的条件

12、载体应具备的条件。

具有针对受体细胞的亲缘性或亲和性（可转移性）

具有与特定受体细胞相适应的复制位点或整合位点

具有较高的外源DNA的载装能力

具有多种单一的核酸内切酶识别切割位点

具有合适的筛选标记

13、质粒的基本特征及两种复制类型。

质粒的自主复制性：

严紧型复制控制的质粒、松弛型复制控制的质粒

质粒的不相容性

质粒的可转移性

携带特殊的遗传标记

14、pBR322最早使用的质粒，pUC18/19

15、考斯质粒的定义及特征。

考斯质粒是一类人工构建的含有l-DNAcos序列和质粒复制子的特殊类型的载体。

特点：

能像l-DNA那样进行体外包装，并高效转染受体细胞

能像质粒那样在受体细胞中自主复制

重组操作简便，筛选容易

装载量大（45kb）且克隆片段具有一定的大小范围

不能体内包装，不裂解受体细胞

16、受体细胞应具备的条件。

限制性缺陷型、重组整合缺陷型、具有较高的转化效率、具有与载体选择标记互补的表型、感染寄生缺陷型。

17、基因工程操作的基本过程。

ADNA的体外重组（切、接）

B重组DNA分子的转化和扩增（转、增）

C转化子的筛选和鉴定（检）

18、外源DNA转换的方法。

化合物诱导转化法、根癌农杆菌介导转化法、电穿孔转化法、微弹轰击（基因枪）转化法、激光微束穿孔转化法、超声波处理转化法、脂质体介导转化法、体内注射转化法、花粉管通道转化法、精子介导法、低能离子束介导转化法

19、目的基因的克隆（目的基因的获得）。

20、基因文库的概念。

从特定生物个体中分离的全部基因，这些基因以克隆的形式存在（人工构建）。

三、发酵工程

1、现代发酵工程定义

是将DNA重组及细胞融合技术、酶工程技术、组学及代谢网络调控技术、过程工程优化与放大技术等新技术与传统发酵工程融合，大大提高传统发酵技术水平，拓展传统发酵应用领域和产品范围的一种现代工业生物技术体系（新一代工业生物技术）。

2、发酵工程的优化技术有哪些？

菌种改造：

基于组学技术的高通量菌种改造和筛选、基于组学和生物信息学代谢途径分析优化。

发酵工艺优化：

基于实时代谢流分析、代谢途径模型与自动控制技术的发酵过程优化控制。

发酵产物分离纯化：

基于发酵液及产品特性的高收率、低成本、高质量和环境友好的提取精制技术集成。

综合治理技术优化：

基于源头防治与过程监控的资源节约与废物资源化清洁生产技术集成。

3、发酵工程的特点。

基因工程技术、细胞工程技术、酶工程技术以及发酵过程优化及放大技术的全面进步。

高产微生物代谢产物及非微生物代谢产物的基因工程菌构建及产品的发酵生产。

主导碳氧经济发展，碳氢经济的替代及生物炼制技术的兴起。

4、杂菌污染的防治。

无菌空气、培养基灭菌、无污染接种、大型发酵罐的密封与抗污染设计解决了耗氧发酵中的杂菌污染问题。

5、发酵工业的运用范围。

微生物菌体、酶制剂、代谢产物、生物转化、微生物特殊机能的利用

6、微生物发酵的分类。

按微生物对氧的不同需求分：

厌氧发酵、需氧发酵、兼性厌氧发酵。

按培养基的物理性状分：

液体发酵（包括液体深层发酵）、固体发酵。

按发酵工艺流程分：

分批发酵、补料分批发酵、连续发酵。

按菌的种类分：

单菌种发酵、多菌种混合发酵（混合菌发酵）。

7、培养基的分类。

按纯度分：

合成培养基、天然培养基。

按用途分：

孢子培养基、种子培养基、发酵培养基。

按状态分：

固体培养基、半固体培养基、液体培养基。

8、发酵工业的生产过程。

用作种子扩大培养及发酵生产的各种培养基的配制；

培养基、发酵罐及其附属设备的消毒灭菌；

扩大培养出有活性的适量纯种，以一定比例接种入发酵罐中；

控制最适发酵条件使微生物生长并形成大量的代谢产物；

将产物提取并精制，以得到合格的产品；

回收或处理发酵过程中所产生的三废物质。

9、发酵培养基的要求。

①培养基能够满足产物最经济的合成。

②发酵后所形成的副产物尽可能的少。

③培养基的原料应因地制宜，价格低廉；且性能稳定，资源丰富，便于采购运输，适合大规模储藏，能保证生产上的供应。

④所选用的培养基应能满足总体工艺的要求，如不应该影响通气、提取、纯化及废物处理等。

10、微生物发酵前体的定义。

前体指某些化合物加入到发酵培养基中，能直接彼微生物在生物合成过程中合成到产物物分子中去，而其自身的结构并没有多大变化，但是产物的产量却因加入前体而有较大的提高。

11、微生物产物促进剂定义。

所谓产物促进剂是指那些非细胞生长所必须的营养物，又非前体，但加入后却能提高产量的添加剂。

12、图

13、发酵的操作方式及其优缺点。

分批发酵

优点：

操作简单、操作引起染菌的概率低、不会产生菌种老化和变异问题。

缺点：

非生产时间较长、设备利用率低。

连续发酵

优点：

能维持基质浓度、可以提高设备利用率和单位时间的产量、便于自动控制。

缺点：

菌种发生变异的可能性较大、要求严格的无菌条件。

补料分批发酵

优点：

能维持基质浓度、可以提高设备利用率和单位时间的产量、便于自动控制。

缺点：

菌种发生变异的可能性较大、要求严格的无菌条件。

14、微生物发酵中的生长曲线。

15、pH值对发酵的影响。

①影响酶的活性，当pH值抑制菌体中某些酶的活性时，会阻碍菌体的新陈代谢；②影响微生物细胞膜所带电荷的状态，改变细胞膜的通透性，影响微生物对营养物质的吸收及代谢产物的排泄；③影响培养基中某些组分和中间代谢产物的解离，从而影响微生物对这些物质的利用；④pH值不同，往往引起菌体代谢过程的不同，使代谢产物的质量和比例发生改变。

另外，pH值还会影响某些霉菌的形态。

16、pH值的控制途径。

调节基础培养基的配方：

调节碳氮比（C/N）、添加缓冲剂

补料控制：

直接加酸加碱、补加碳源或氮源

17、泡沫发酵对发酵的影响。

降低发酵设备的利用率；

增加了菌群的非均一性；

增加了染菌的机会；

导致产物的损失；

消泡剂会给后提取工序带来困难。

18、泡沫的控制途径。

物理消沫法：

罐内消沫法、罐外消沫法

化学消沫法：

消泡剂、天然油脂、聚醚类、高级醇类、硅酮类

19、通风发酵罐的种类。

机械搅拌式发酵罐

通风搅拌式发酵罐：

机械通风搅拌发酵罐、气升式发酵罐、自吸式发酵罐、伍式发酵罐、文氏管发酵罐。

四、酶工程

1、酶的来源。

从动植物组织中分离提取

植物细胞培养产酶

动物细胞培养产酶

微生物发酵产酶

2、微生物作为酶来源的优点。

生长繁殖快，生活周期短，产量高，酶比活很高；

培养方法简单，原料来源丰富，经济效益高；

微生物菌株种类繁多，酶的品种齐全；

可以通过诱导、诱变及基因工程等方法培育出新的产酶量高的菌种。

3、优良产酶菌种应具备的优点。

繁殖快、产酶量高

能在便宜的底物上生长良好

产酶性能稳定、菌株不易退化

产生的酶容易分离纯化

4、酶基因克隆表达的基本步骤。

能产生目的酶的生物

酶的纯化总mRNA的纯化

测定N端部分氨基酸序列mRNA

设计引物RT-PCR

与合适的载体重组、重组子筛选与鉴定

转入工业生产用的宿主（工程菌或工程细胞），如米曲霉

酶的工业化生产

5、细胞破碎方法。

机械法、物理法、化学法、生物法（酶解）

6、酶制剂的制备。

破碎细胞、溶剂抽提、离心分离、浓缩、干燥

7、制备沉淀的常见方法。

⑴中性盐沉淀（盐析法）

⑵有机溶剂沉淀

⑶选择性沉淀（热变性和酸碱变性）

⑷等电点沉淀

⑸有机聚合物沉淀

8、层析的分类（按机理的分类）。

吸附层析：

利用吸附剂表面对不同组分吸附性能的差异。

分配层析：

利用不同组分在流动相和固定相之间的分配系数的不同。

离子交换层析：

利用不同组分对离子交换剂亲和力的不同。

凝胶层析：

利用某些凝胶对于不同分子大小的组分阻滞作用的不同。

9、固定化酶的优缺点。

优点：

不溶于水，易于与产物分离；可反复使用；可连续化生产；稳定性好。

缺点：

固定化过程中往往会引起酶的失活。

10、酶的固定化技术（3点，详细）。

活性中心：

保护酶的催化作用，并使酶的活性中心的氨基酸基团固有的高级结构不受到损害，在制备固定化酶时，需要在非常严密的条件下进行。

功能基团：

如游离的氨基、羧基、半胱氨酸的巯基、组氨酸的咪唑基、酪氨酸的酚基、丝氨酸和苏氨酸的羟基等，当这些功能基团位于酶的活性中心时，要求不参与酶的固定化结合

酶的高级结构：

要避免用高温、强酸、强碱等处理，而且有机溶剂、高浓度的盐也会使酶变性、失活，因此，操作应尽量在非常温和的条件下进行。

11、衡量酶固定化的指标（3方面）。

相对酶活力、酶的活力回收率、固定化酶的半衰期

12、酶分子修饰的定义。

通过各种方法使酶分子的结构发生某些改变，从而改变酶的某些特性和功能的技术过程称为酶分子修饰。

即：

在体外将酶分子通过人工的方法与一些化学基团（物质），特别是具有生物相容性的物质，进行共价连接，从而改变酶的结构和性质。

13、酶分子修饰的意义。

提高酶的活力activity

增强酶的稳定性stability

降低或消除酶的抗原性immunologicalproperty

研究和了解酶分子中主链、侧链、组成单位、金属离子和各种物理因素对酶分子空间构象的影响structure

14、酶分子修饰的方法（大致—方法、名称）。

金属离子置换修饰

大分子结合修饰（共价/非共价）

侧链基团修饰

肽链有限水解修饰

氨基酸置换修饰

酶分子的物理修饰

五、细胞工程

1、植物生物技术在农业上的应用

1、植物次级代谢产物的生产

2、植物组织培养

3、人工种子

2、什么是人工种子

人工种子（Artificialseed）定义：

又称合成种子（Syntheticseed）或体细胞种子（Somaticseed），是指将植物离体培养中产生的胚状体或芽包裹在含有养分和保护功能的人工胚乳（Artificialendosperm）和人工种皮（Artificialseedcoat）中形成的类似种子的颗粒。

3、组织快繁技术的优点

1.周期短，便于人工控制培养条件。

繁殖速度快，经济效益高。

2.占用空间小，不受地区、季节限制。

3.繁殖珍稀、濒危苗木和突变体，是优良品种培育的有效途径。

4.利于保持原来品种的特性。

4、反义RNA定义及意义

反义RNA技术：

与靶核酸（如mRNA或有义DNA）链互补的RNA分子，可抑制靶核酸的功能。

反义RNA技术：

根据编码正常蛋白质的基因序列设计与之相对应的能转录出反义RNA链的反义DNA，转基因后所产生的反义RNA链根据碱基互补配对原则会与mRNA链结合成双链，使正常的mRNA无法和核糖体结合，导致蛋白质翻译终止。

5、抗草甘膦作物的机理

抗草甘膦机制：

转基因技术向作物中导入不敏感的EPSP则成功得到了作物对草甘膦的高度抗性。

6、细胞工程的意义

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7、什么叫体外受精

体外受精（Invitrofertilization，IVF）是指将哺乳动物的精子和卵子在体外人工控制的环境中完成受精过程的技术。

8、试管动物的培育过程

（1）精子采集与体外获能、卵子采集与成熟培养

（2）体外受精

（3）胚胎体外培养

（4）胚胎移植（Embryotransfer，ET）：

是指将受精卵或发育到一定阶段的胚胎移植到与供体同时发情排卵、但未经配种的“受体”母畜输卵管或子宫的技术

（5）体内发育、出生

9、精子的获能

精子获能（Capacitation）是指精子获得穿透卵子透明带能力的过程。

10、精子的顶起反应

精子的顶起反应：

遇到卵子时，精子头部“顶体”脱落，顶体酶释放，使卵子的放射冠和透明带溶解，精子进入卵细胞，达到受精的目的。

11、体内获能的机理

雄性精液中含有“去能因子”（多是：

糖蛋白），附在精子表面，是顶体酶的抑制剂，抑制了精子的受精能力。

去能因子的清除，使精子顶体酶活性恢复，具有受精能力

主要依靠宫颈、子宫及输卵管液中的β淀粉酶、胰蛋白酶、β葡糖苷酶及唾液酸酶，后者在卵泡液中含量也很高。

可以水解糖蛋白等“去能因子”。

12、什么叫试管婴儿

试管婴儿（Test-tubebaby）是指将卵子与精子取出在体外受精，培养发育成早期胚胎，再植回母体子宫内发育出生的婴儿,也就是采用体外受精联合胚胎移植技术培育的婴儿。

13、什么叫细胞核移植

细胞核移植（Cellnucleartransfer）是一种利用显微操作技术将一种动物的细胞核移入同种或异种动物的去核成熟卵细胞内的技术。

14、什么叫细胞核移植动物

细胞核移植动物：

是用特定发育阶段的核供体及相应的核受体（去核的卵子）体外构建重组胚，通过胚胎移植达到受体，发育出生的动物。

15、核移植动物的技术流程

1-核供体细胞的准备

2-受体细胞的去核

3-细胞核移植、激活

4-重组胚的培养与移植

5-核移植后代的鉴定

16、什么教体细胞克隆

体细胞克隆：

是将动物体细胞经过抑制培养使其处于休眠状态，利用细胞核移植技术将其导入去核卵母细胞，培育成早期胚胎，将胚胎移植至受体，妊娠产仔培育出与核供体一样的成体动物的一种细胞工程技术。

17、体细胞克隆的意义

A-理论价值：

高度分化的体细胞具有全能性

B-实践意义：

由于体细胞数量丰富并且易于获得，因此体细胞克隆动物技术在加快珍稀动物繁殖，抢救濒危动物（如大熊猫）方面意义重大。

可以用患者本人细胞培育出新组织。

18、体细胞克隆的过程

1-供核细胞获得与取核

2-卵母细胞收集与去核

3-细胞核融入卵细胞

4-重构胚的培养

5-妊娠监护

19、细胞融合的概念、分类

细胞融合（Cellfusion）是指使用人工方法使两个或两个以上的细胞合并形成一个细胞的技术。

分类：

1.材料：

原生质体（去除了细胞壁的裸露的细胞）、动物细胞

2.从亲本来源：

（1）同核体（Homokaryon）：

基因型相同的细胞融合成的融合细胞称为。

（2）异核体（Heterokaryon）：

来自不同基因型的融合细胞。

3.从融合效果：

（1）对称融合（Symmetricfusion）：

两个完整的细胞间的融合。

（2）不对称融合（Asymmetricfusion）：

利用物理或化学方法使某亲本的核或细胞质失活后再与另外一个完整细胞进行融合。

20、细胞融合技术的主要环节

（1）亲本选择（单细胞或原生质体制备）

（2）两原生质体或细胞互相靠近，粘附

（3）质膜融合形成细胞桥

（4）胞质渗透

（5）细胞核融合

（6）融合细胞筛选

21、什么是干细胞

干细胞是一类具有自我更新和分化潜能的细胞。

22、干细胞的特征

1.自我更新特征自我更新是指干细胞具有分裂和自我复制能力。

（1）对称分裂（symmetricdivision）是指一个干细胞分裂产生的两个子细胞全是干细胞。

（2）不对称分裂（asymmetricdivision）是指一个干细胞分裂成一个干细胞和一个短暂增殖细胞，称之为祖细胞（progenitorcell）。

祖细胞分裂形成的是两个专一功能的子细胞，不具备自我复制的能力。

2.增殖特征

（1）增殖的缓慢性一般情况下，干细胞处于休眠或缓慢增殖状态。

缓慢增殖还可以减少基因发生突变的可能性。

（2）增殖的自稳性也称自我维持，是指干细胞会自我更新维持自身数目的恒定，主要是通过不对称分裂来实现。

3.分化特征

（1）单能干细胞（Monopotentstemcell）是只能分化为单一类型细胞的干细胞。

例如表皮的基质细胞（即表皮干细胞）只能分化产生角化表皮细胞。

（2）多能干细胞（Multipotentstemcell）是能够形成两种或两种以上类型细胞的干细胞。

例如骨髓造血干细胞就是典型的多能干细胞，可以分化成红细胞、巨噬细胞、粒细胞（中性、嗜碱性、嗜酸性）、巨核细胞（发育成血小板）、巴细胞（至少6种以上的淋巴细胞）等多种类型细胞。

（3）全能干细胞（Almightystemcell）是具有无限分化潜能的干细胞。

例如胚胎干细胞。

23、诱导干细胞的途径

1.化学试剂诱导法

2.细胞因子诱导细胞因子能显著改变ES细胞的发育途径。

3导入外源性基因也可使Es细胞发生定向分化

24、胚胎干细胞和成体干细胞各自的优点

1.胚胎干细胞优点

无限的分化潜能

1.成体干细胞优点

（1）来源方便：

可以从自身获得。

（2）没有伦理学问题：

成体干细胞来自成熟个体，不会损伤供体。

（3）避免免疫排斥反应：

同种异体胚胎干细胞及其分化细胞用于临床会引起免疫排斥。

尽管通过采取自身供体细胞核通过治疗性克隆可以得到自身胚胎干细胞，但是克隆技术的不成熟限制了目前的应用。

（4）比较安全：

虽然胚胎干细胞能分化成各种细胞类型，但目前还不能完全控制胚胎干细胞的定向分化，容易导致畸胎瘤。

相对而言，成体干细胞比较安全。