ISO李斯特菌.docx

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ISO李斯特菌

国标标准ISO11290-11996（E）

食品和动物饮料微生物学----单核增生李斯特氏菌的检测和计数方法

------第一部分检测方法

1.范围

2.参考标准

3.定义

4.原理

5.培养基和试剂

6.设备和玻璃器皿

7.取样

8.待检样品前处理

9.程序

10.结果表达

11.检测报告

附录：

A.检测程序图

B.培养基和试剂的组成和配制

C.亨氏斜射光镜检

食品和动物饮料微生物学----单核增生李斯特氏菌的检测和计数方法

------第一部分检测方法

警告：

为了保障实验室人员的健康，强烈推荐在适当装备、由有经验的微生物专家控制以及检测中的所有培养物得以谨慎处理的实验室进行单核增生李斯特氏菌检测；尤其是强烈建议孕妇不要从事单核增生李斯特氏菌的培养工作。

1.范围

本ISO11290详细说明了单核增生李斯特氏菌检测和计数方法。

在绪论中受讲座的局限性，本ISO11290适用于供给人类消费或作为动物饲料的产品。

2.参考标准

下列文件中的条款通过本标准的引用而成为本标准的条款.凡是注日期的引用文件，其随后所有的修改单（不包括勘误内容）或修订版均不适用于本标准，然而，鼓励根据本标准达成协议的各方研究是否可使用这些文件的最新版本。

凡是不注日期的引用文件，其最新版本适用于本标准。

IEC和ISO成员保留目前有效的国际标准的注册。

ISO6887：

1983微生物学—微生物检测中稀释液制备的一般导则

ISO：

1996，食品及动物饲料微生物学—微生物检测通则

3.定义

本部分ISO11290提供以下定义：

3.1单核增生李斯特氏菌：

在因体选择性培养基上形成典型菌落，并且当进行鉴定和确认其形态的、生理的和生化特征与本部分ISO11290的描述一致的微生物。

3.2单核增生李斯特氏菌的检测：

依据本部分ISO11290实施细则确定单核增生李斯特氏菌在给定单位质量或体积的样品中存在与否。

4.原理

在本部分ISO11290的限定范围内，检测单核增生李斯特氏菌需要四个连续的阶段（见附录A检测程序图）。

注意：

1：

单核增生李斯特氏菌可能存在量少，并与大量的其它细菌混杂，因此需要选择性增菌。

同时必须检测受到损伤的李斯特氏菌，降低添加于初级选择性增菌培养基的抑制剂浓度可以至少部分达到此目的。

4.1在选择性试剂浓度有所降低的选择性液体增菌培养基（半Fraser肉汤）中进行初级增菌

接种于含有1体积氯化锂、1/2体积的吖啶黄素和1/2体积的萘啶酸的半Fraser肉汤培养液，其一可用作检测部分（9.1）的稀释液，30℃培养24h。

4.2应用含全浓度选择性试剂的液体增菌培养基（Fraser培养液）进行二级增菌

把4.1得到的初级培养物接种于高选择性二级液体增菌培养基，35℃或37℃培养48h。

4.3筛选、分离和鉴定

把4.1和4.2步的培养物接种到两种因体选择性培养基上a）Oxford（b）PALCAM于30℃、35或37℃培养24h后检查，如有必要，继续培养24h后再次检查典型的单核增生李斯特氏菌可疑菌落。

4.4确认

筛选和分离4.3步所述的典型的单核增生李斯特氏菌疑似菌落，传代培养，并用适当的形态、生理的和系列化的检测方法加以确认。

5.培养基和试剂

5.1常规原则

对于目前实验室操作，详见ISO07218

注意2：

因为被认为更可取的培养基和试剂的数量较多，为使文章简洁，附录B给出其组分和制番。

5.2初级选择性增菌培养基：

选择性试剂浓度降低的Fraser培养液（半Fraser培养液）（见条款B.1）

5.3含全浓度选择性试剂的选择性二级增菌培养液（Fraser培养液）（见条款B.2）

5.4选择性固体分离培养基

5.4.1第一种培养基：

Oxford琼脂（见条款B.3）

5.4.2第二种培养基：

PALCAM琼脂（见条款B.4）

5.5固体培养基：

胰蛋白胨大豆酵母浸膏琼脂（TSYEA）（见条款B.5）

5.6液体培养基：

蛋白胨大豆酵母浸膏琼脂（TSYEA）（见条款B.6）

5.7绵羊血琼脂（见条款B.7）

5.8糖类利用肉汤（鼠李糖和木糖）（条款B.8）

5.9动力试验琼脂（可选做）（见条款B.9）

5.10CAMP（Christle，Atkins，Munch-Petersen）培养基及试验菌株（见条款B.10）

5.11过氧化氢溶液（见条款B.11）

5.12磷酸盐缓冲液（PBS）（见条款B.12）

6.设备和玻璃仪器

常用微生物试验设备（见ISO07218）以及下列设备和玻璃仪器：

6.1干热灭菌设备（烤箱）或湿热灭菌设（灭菌锅）（见ISO07218）

6.2干燥箱或培养箱：

温控范围在25℃±1℃和50℃±1℃之间

6.3培养箱25℃±1℃，30℃±1℃，35℃±1℃或37℃±1℃。

6.4水溶液：

47℃±2℃

6.5接种环：

铂/铱或镍/铬制成，直径大约3mm，以及同样材料制成的金属丝，或曲棍球杆形状的玻璃L-棒或一次性接种环

6.6PH计：

能读数接近0.001PH单位（25℃），保证测量准确至±0.1PH单位

6.7试管或烧瓶

6.8量筒：

容量50ml至1000ml

6.9吸管：

10ml和1ml，分刻度0.5ml和0.1ml

6.10培养皿：

直径90mm至100mm

6.11罐（选用）：

适宜于微需氧培养的

6.12混合气体（选用）：

特用于微需氧培养的混合气体：

5%-12%CO2+5%-15%O2+75%N2

6.13Henry照射试验的设备（选用）（见附录C）

6.14显微镜：

最好是相差显微镜，带有载玻片和盖玻片

7.取样

重要的是实验室收到的样品必须真正具有代表性，并且样品在运输和储存过程中未受破坏和改变。

取样方法在本部分ISO11290中不会详细介绍，如果没有针对产品的特定取样标准，推荐有关各方就此应达成协议。

8.检样制备

制备检样应根据针对相关产品的国际标准，如果没有特定国际标准，推荐有关各方就此达成协议。

9.检测步骤

9.1检样部份和初始悬浮液

见ISO6887以及任一针对相关产品的国际标准

制备初始悬浮淮，使用5.2中详细说明的选择性初级增菌培养基作为稀释液。

一般情况下，制备初始悬浮液是将Xg或Xml待检样品加入到9Xg或9Xml选择性初级增菌培养基（5.2）中，使二者比例为1/10（质量：

体积或体积：

体积）

9.2初级增菌

将按9.1制备的初始悬浮液30℃恒温培养24±2h（6.3）

注意3：

培养过程中会产生黑着色。

9.3二级增菌

9.3.1初级增菌培养24±2h后，取0.1ml9.2步的培养物（无论何色）置入含10ml二级增菌培养基（Fraser培养液）（5.3）的试管（6.7）。

9.3.2将接种物（9.3.1）35℃或37℃培养48h±2h。

注意4：

接种物的培养温度应与各方协议规定一致并记录于检测报告中。

9.4分离和鉴定

9.4.1用接种环或玻璃棒（6.5）蘸取初级增菌培养物（9.2）表层培养物，划线接种于第一种选择性培养基（Oxford琼脂）（5.4.1）表面，以便得到充分分离的菌落。

同样方法接种第二种选择性培养基（PALCAM琼脂）（5.4.2）。

注意5：

转移接种实施过程中不应考虑培养物的颜色。

9.4.2重复9.4.1所述步骤，将二级增菌培养物（9.3.2）划线接种于两种选择性平板上。

9.4.3翻转上两步的平板，分别置于30℃、35℃或37℃培养箱中培养（6.3）。

PALCAM琼脂平板置于含混合气体（6.12）的微需氧罐（6.11）中30℃、35℃或37℃培养或者30℃、35℃或37℃需氧培养。

注意6：

Oxford琼脂平板培养于30℃适合于被其他细菌轻度污染的食品，对于被其他细菌重度污染的食品，最好培养于35℃或37℃，因为李斯特氏菌可以与其他细菌一同生长。

不管怎样，培养温度应与各方协议规定一致并记录于检测报告中。

9.4.4经24h培养以及另外18h~24h恒温培养（如果培养24h后生长轻微或未见菌落）后，检查平板（9.4.3）

上有无可疑李斯特菌菌落。

9.4.4.牛津琼脂：

培养24h的典型李氏特斯菌在牛津琼脂上为细小（1mm）的灰色菌落，其外围有黑色晕圈48h后菌落变暗，可见似是而非的绿色辉光，直径约2mm，有黑色的晕圈并且中间凹陷。

9.4.4.2PALCAM琼脂：

对于微需氧培养的平板，培养后平板暴露在空气中1h，使得培养基重新恢复其粉红至紫色。

经过24h培养后，李斯特氏菌呈小的或很小的灰绿色或橄榄色菌落，直径1.5至2.0mm，有时中心黑色，但常常带有黑色晕圈。

48h培养后，呈现直径1.5至2.0mm的绿色菌落，中心下陷并围有黑色的晕圈。

9.5确认

9.5.1选择待确认菌落

9.5.1.1从每种选择性培养基的每一平板（9.4.4.1和9.4.4.2）中选择五个疑似李斯特氏菌的菌落。

如果一只平板中少于五个疑菌落，须确认所有疑似菌落。

9.5.1.2将选择的菌落划线接种到预干燥的TSY-YA琼脂平板上（5.5），以形成良好的单菌落。

注意7：

接种物的培养基温度应与各方协议规定一到并记录于检测报告中。

典型菌落直径1-2mm，凸起，无色透明边缘完整。

如没有得到良好的单菌落，挑取典型李斯特氏菌菌落接种到另一只TSY-EA平板上。

挑取TSY-EA上的纯化菌落进行下列试验：

注意8：

如有必要，进行Henry斜射光镜检（见附录C），此试验的关键点是琼脂培养基要薄（15ml/平板）。

9.5.2过氧化氢酶试验

从9.5.1.2平析中取单个菌落，悬浮于玻片上一滴过氧化氢溶液中（5.11）产即形成泡者为阳性反应。

9.5.3革兰氏染色

从9.5.1.2平板中取单个菌落进行革兰氏梁色，李斯特氏菌为革兰氏阳性，狭长短棒状。

9.5.4运动力试验（如需要）

从9.5.1.2平板中取单个菌落悬浮于TSB-YE的试管中（5.6）。

置于25℃培养箱（6.3a）培养8-24h，直至观察到培养基呈奶灰色的。

用接种环取一滴上述培养基（6.5）于玻璃显微载玻片上，盖上玻片并镜检（6.14）。

李斯特氏菌呈现狭长，短棒状翻滚运动性。

培养温度高于25℃将不能出现这种运动性，与已知培养物比较，球菌、巨大棒状或者棒状并快速游动的不是李斯特氏菌。

作为运动性的可选替代方法，可用接种针（6.5），从TSA-YE培养物（9.5.1.2）上挑取典型菌落，穿刺接种到动力琼脂（5.9），置于25℃培养箱（6.3a）培养48h。

检查沿穿刺线的菌落生长状况。

李斯特氏菌是有动力、呈现典型的伞样生长特征，如生产不充分，最多再恒温培养5天并观察穿刺线情况。

9.6单核增生李斯特氏菌的确认

9.6.1溶血性试验

如果形态和生理特征以及过氧化氢酶（触媒）反应都表明所纯化的菌珠是李斯特氏菌，就接种到绵羊血琼脂平板（5.7）以决定溶血性。

取9.5.1.2中每平板的单个菌落并用金属丝（6.5）依次穿刺接种于表面干燥的羊血琼脂。

同时穿刺接种标准阳性（单核增生李斯特氏菌）和阴性对照培养物（英诺克李斯特氏菌）。

接种物35℃或37℃培养24h±2h后，检查待验菌株各对照菌株。

单核增生李斯特氏菌呈现狭窄、清晰、明亮的溶血圈（β-溶血环），（见图1），英诺克李斯特氏菌无清晰的区域环绕着穿刺点。

西尔李斯特氏菌出现弱的溶血圈；绵羊李斯特氏菌通常呈宽的、轮廓清晰的β-溶血区域。

在明亮的光线下检查平板并比较试验物与对照物。

注意9：

溶血性试验也可以用红血球来做。

将所取菌落分散于150μlTSB-YE（5.6），35℃或37℃恒温培养2h，加入150μl用2%PBS稀释的绵羊红血球（5.12）。

35℃或37℃培养15-60min，然后置于3℃±2℃冰箱约2h，再检查溶血现象的出现与否，如果试验结果不确定，可置于3℃±2℃冰箱长至24h，再观察结果。

9.6.2糖类利用试验

用接种环（6.5）挑取TSB-YE（9.5.4）培养物，接种至糖类利用试验中（5.8），35℃或37℃培养至5天，阳性反应（产酸）呈现黄色并大多数在24-48h内产生。

9.6.3协同溶血试验（CAMP）

在绵羊平板（5.7或10.3）上相对平行接种金黄色葡萄球菌和马红球菌培养物（R.equi）（B10.4）（见图1），接种线必须窄而均匀，可通过用接种环和金属线与琼脂平面呈直角的方向（垂直）接种而得。

在它们两个培养物中间靠近1-2mm处垂直接种9.5.12取的可疑李斯特氏菌，但不能与二者接触。

几个试验菌株应该同时接种于同一平板内。

注：

1、如上图所示接种薄的血琼脂平板（5.7或10.3）。

垂直线代表平行排列的金黄色葡萄球菌和马球菌，水平线代表条状排列的待检培养物，阴影部分说明较明显的溶血作用；2、加点的部分说明是影响金黄色葡萄球菌培养物的区域。

同样，垂直接种对照菌株（单核增生李斯特氏菌、西尔李斯特氏菌、英诺克李斯特氏菌）。

如果使用血琼脂（5.7），则需35℃或37℃培养18-24h，如果用双层琼脂平板（B.10.3），则需35℃或37℃恒温培养12-18h。

待验菌株与金黄色葡萄球菌和马红球菌间β-溶血作用增强者均可认为是阳性反应。

单核增生李斯特氏菌或西尔李斯特氏菌在靠近金黄色葡萄球菌接种点附近的溶血增强，绵羊李斯特氏菌在靠近马红菌接种点附近的溶血增强，可见明显的箭头状溶血现象，其他李斯特氏菌不产生溶血现象。

9.7形态的、生理的和生化特征的解释

所有的李斯特氏菌为小的，革兰氏阳性、棒状、有动力。

过氧化氢酶（触媒）阳性，单核李斯特氏菌与其它李斯特氏菌的区别见表1。

表1：

李斯特氏菌菌种鉴定的反应特征

种类

溶血性

产酸

CAMP试验

鼠李糖

木糖

金黄色葡萄球菌

马红球菌

单核增生李斯特氏菌

英诺克李斯特氏菌

绵羊李斯特氏菌

西尔李斯特氏菌

威尔斯李斯特氏菌

格氏李斯特氏菌

墨氏李斯特氏菌

+

-

+

（-）

-

-

-

+

V

-

-

V

-

V

-

-

+

+

+

-

-

+

-

-

（+）

-

-

-

-

-

+

-

-

-

-

V：

反应不定（+）：

弱性反应+：

＞90%阳性反应-：

无反应

注意：

在本部分ISO11290中，存在少数单核增生李斯特氏菌不出现β-溶血现象，或者CAMP试验无阳性反应。

9.8定性确认

被认为是单核增生李斯特氏菌的菌株（9.7）应该送至认为的李斯特氏菌参考实验室进行血清当分型，或在有条件的情况下进行噬菌体定型。

输送分离菌株时应该带上菌株的所有相关信息。

9.9对照菌株

为了检查增菌和鉴定培养基是否有利于单核增生李斯特氏菌的选择性生长性能，将最近分离的单核增生李斯特氏菌参考菌株和阴性对照物（例如，杆菌、葡萄球菌）稀释并接入装有初级增菌培养基的对照烧瓶中（9.2），每个烧瓶中加10-100个李斯特氏菌或阴性对照菌细胞。

按9.4-9.6测试对照烧瓶中质控菌株，确定阳性对照培养物的活性得到恢复。

10.结果的表述

根据结果的表述要求，报告单位样品（Xg或Xml）中检出或未检出单核增生李斯特氏菌。

注意10：

如果分离到其它种类李斯特氏菌，应该在报告中，并遵循各方约定。

11.结果的报告

报告中应注明所用的检测方法、培养的温度和获得的结果。

还应注明本ISO11290中未提及的或认为是可选择的操作细节以及可能会影响结果的任何细节。

检测报告应包括所有进行样品鉴定的必需信息。

附件A（标准化）

单核增生李斯特氏菌检测程序图

检样（Xg或Xml）

初级增菌培养基（半Fraser）（5.2）

30℃培养24±2h

备注：

1）牛津琼脂在30℃，35℃或37℃需氧培养24～48h。

2）PALCAM琼脂基在30℃，35℃或37℃培养24～48h，如有必要采用微需氧。

3）温度必须满足有关各方规定的要求。

附件B（标准化）

培养基和试剂的组份与制备

B.1选择性初级营养液：

半Fraser肉汤

B.1.1基本成份

B.1.1.1组成

肉蛋白胨（动物组织的胃蛋白酶消化产物）5.0g

胰化蛋白胨（酪蛋白的骨蛋白酶消化产物）5.0g

牛肉浸膏5.0g

酵母浸膏5.0g

氯化钠20.0g

磷酸氢二钠12.0g

KH2PO41.35g

七叶苷1.0g

水1000ml

B.1.1.2制备

将以上组份或脱水成份溶解于水中，必要时可加热。

调节PH值，使其在杀菌后保持在25℃时7.2±0.2。

把试验所需的量（9.1）分装到一定容积的烧瓶（6.7）中。

121℃高压灭菌15min（6.1）。

注：

LiCl溶液（B.1.2）和萘啶酮酸（B.1.3）溶液可以在高压灭菌前加入到基础培养基中（B.1.1）。

B.1.2氯化锂溶液

B.1.2.1组成

氯化锂3.0g

水10ml

B.1.2.2制备

将氯化锂加入水中，过滤除菌。

注意：

溶解氯化锂时一定要做好预防措施，因为该反应大量热且对粘膜有刺激作用。

B.1.3萘啶酸钠溶液

B.1.3.1组成

萘啶酸钠0.1g

0.05ml/LNaOH溶液10ml

B.1.3.2制备

将萘啶酸钠溶解NaOH溶液中，过滤除菌。

B.1.4盐酸吖碇黄素溶液

B.1.4.1组成

盐酸吖碇黄素0.25g

水100ml

B.1.4.2制备

将盐酸吖碇黄素溶于水中，过滤除菌。

B.1.5柠檬酸铁（Ⅲ）铵

B.1.5.1组成

柠檬酸铁（Ⅲ）铵5.0g

水100ml

B.1.5.2组成

将柠檬酸铁（Ⅲ）铵溶于水中，过滤除菌。

B.1.6全培养基

B.1.6.1组成

基本成份（B.1.1）100ml

氯化锂溶液（B.1.2）1.0ml

萘啶酸钠溶液（B.1.3）0.1ml

吖啶黄盐酸盐（B.1.4）0.5ml

柠檬酸铁（Ⅲ）铵溶液（B.1.5）1.0ml

B.1.6.2制备

使用前，将上述四种溶液分别加入到100ml的基本成份中去。

B.2选择性二级增菌培养基：

Fraser肉汤

B.2.1基本成份

B.2.1.1组成

肉蛋白胨5.0g

胰蛋白胨5.0g

牛肉浸膏5.0g

酵母浸膏5.0g

氯化钠20g

磷酸氢二钠12.0g

KH2PO41.35g

七叶苷1.0g

氯化锂3.0g

萘啶酸钠0.02g

水1000ml

B.2.1.2制备

将以上组份或脱水成份溶于水中，可加热，调节PH值，使其杀菌后25℃时PH为7.2±0.2；将试验所需量分装到试管中，121℃高温消毒15min。

B.2.2盐酸吖啶黄溶液

见B.1.4

B.2.3柠檬酸铁（Ⅲ）铵溶液

见B.1.5

B.2.4全培养基

使用前，在各个试管（10ml）分别加0.1mlB.2.2溶液和B.2.3溶液，缓缓混合均匀。

B.3选择性平皿培养基：

牛津琼脂

B.3.1琼脂基础

B.3.1.1组成

哥伦比亚琼脂*39g

七叶苷1g

柠檬酸铁（Ⅲ）铵0.5g

氯化锂15g

水1000ml

哥伦比亚琼脂*

蛋白胨23.0g

淀粉1.0g

氯化钠5.0g

琼脂（根据琼脂强度）9至18g

B.3.1.2制备

煮沸，使上述组成完全溶解于水中，调节PH值使其灭菌处理后25℃时PH值为7.0±0.2，121℃高温灭菌15min。

B.3.21000ml添加剂

B.3.2.1组成

放线菌酮400mg

硫酸黏菌素盐20mg

盐酸吖啶黄素5.0mg

头孢双硫唑甲氧2.0mg

磷霉素10mg

乙醇5.0ml

水5.0ml

B.3.2.2制备

将上述组成物质溶解于乙醇/水溶液中，过滤除菌。

B.3.3制备全培养基

高压灭菌的琼脂基础（B.3.1）冷至47℃时，在无菌条件上加入添加剂（B.3.2），充分混匀后到无菌的培养皿中（15ml/皿），凝固。

避光保存。

B.4琼脂基础

B.4.1组成

蛋白胨23.0g

淀粉1.0g

氯化钠5.0g

酵母浸膏3.0g

琼脂（根据凝固程度）9至18g

D-葡萄糖0.5g

D-苷露糖10.0g

七叶苷0.8g

柠檬酸铁（Ⅲ）铵0.5g

苯酚红0.08g

氯化锂15.0g

水960ml

B.4.1.2制备

将上述组份加入水中，煮沸使其溶解。

调节PH值使其灭菌处理后25℃时PH值为7.0±0.2，121℃高温灭菌15min。

B.4.2硫酸多粘菌素B溶液

B.4.2.1组成

硫酸多粘菌素B（100’000IU）0.1g

水100ml

B.4.2.2制备

将硫酸多粘菌素B溶解于水中，过滤除菌。

B.4.3盐酸吖啶黄素溶液

B.4.3.1组成

盐酸吖啶黄素0.05g

水100ml

B.4.3.2制备

将盐酸吖啶黄素溶解于水中，过滤除菌。

B.4.4五水头孢噻甲羧亏钠溶液

B.4.4.1组成

五水头孢噻甲羧亏钠0.116g

水100ml

B.4.4.2制备

将五水头孢噻甲羧亏钠溶解于水中，过滤除菌。

B.4.5全培养基

B.4.5.1组成

琼脂基础（B.4.1）960ml

硫酸多粘菌素B溶液（B.4.2）10ml

吖啶黄素盐酸盐溶液（B.4.3）10ml

五水头孢噻甲羧亏钠溶液（B.4.4）20ml

待琼脂基础冷至约47℃时，分别加入上述B.4.2至B.4.4溶液同，缓缓混匀。

B.4.6制备琼脂平板

每只平板内加入15ml上述新制备的完全培养基（B.4.5），凝固，避光保存。

B.5固体培养基（TSA-YE）

B.5.1组成

胰酪胨大豆肉汤1）30g

酵母浸膏6g

琼脂9至18g

水1000ml

胰酪胨大豆肉汤1）

胰酪胨17.0g

大豆胨3.0g

氯化钠