进出口保健食品中育亨宾伐地那非西地那非西力士含量的测定方法.docx
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进出口保健食品中育亨宾伐地那非西地那非西力士含量的测定方法
《保健食品中育亨宾、伐地那非、西地那非、他达那非含量的测定方法液相色谱-质谱/质谱法》编制说明
一、任务来源
本标准是根据国家认监委下达的计划编号为“2009B568”制标任务编写的。
本标准由湖南出入境检验检疫局承担研究和起草。
二、研究目的
育亨宾又称痿必治为非激素类药物，最早是从产于西非洲一种植物（CorynanteYohimbe）树皮中提出的一种生物碱,现已有合成品。
自古以来育亨宾即在非洲用作催欲药，1900年哥维及苗勒等应用于因神经衰弱所致的阳萎及麻痹性不感症取得疗效，因而用于临床。
其药理作用能使血管平滑肌扩张，降低交感神经张力，通过扩张阴茎的动脉，增加阴茎海绵窦血流量；使阴茎勃起，并使中枢性交感神经兴奋。
适用于精神性、神经性、血管性及糖尿病性阳痿。
是目前较为肯定而且应用最多的一种植物性治疗勃起功能障碍的药品，一般服用剂量为500mg。
但育亨宾并不适合正在服用抗忧郁剂的人仕服用﹐也不适合患有肾脏疾病或胃溃疡者服用。
此外，服用高剂量的育亨宾可能会导致严重的副作用﹐包括丧失肌肉功能﹐血压升高，忧虑﹐心悸﹐眩晕等。
对有些人而言，育亨宾能引起幻觉。
某些食物如芝士﹐动物肝脏﹐红酒等﹐也应避免与育亨宾同时进食﹐以免令血压升高。
西地那非俗称伟哥，磷酸二酯酶-5（inhibitorofphosphodiesterasetype5,简写PDE-5）选择性抑制剂,原为一种抗心绞痛的新药，由于其在临床试验中被发现有治疗男性勃起功能障碍（Erectiledysfunction,ED）的作用而改变了研发方向，一般在用药后40min见效，剂量为50mg。
与其作用相似的药物还有德国Bayer与葛兰素史克公司联合开发的伐地那非，于2003年8月获得FDA批准在美国上市，此药用后10min起效，一般剂量为10mg，对PDE-5的抑制能力是西地那非的5倍，因而在临床上5、10、20mg伐地那非的作用相当于25、50、100mg西地那非的作用。
美国Lilly公司开发的他达拉非，商品名他达那非也获得欧盟批准上市，其对磷酸二酯酶5有更好的选择性，促进阴茎勃起的效果可长达36个小时。
他达那非的平均起效时间是16min。
服用量为10-20mg，建议东方人服用量为25-35mg。
磷酸二酯酶5抑制剂的不良反应主要表现在中枢神经、循环和视觉系统，常见有头痛、面部潮红、焦虑、消化不良、腹部不适、肌痛、骨痛、血尿；循环系统表现为心律失常、心梗、心脏猝死、脑出血、高血压；视觉系统表现为对光敏感、视力模糊、复视、眼肿、眼压高、视物蓝绿。
磷酸二酯酶5抑制剂18岁以下的人禁用，对在6个月内曾发生过心梗、中风、致死性心律失常、低血压或高血压者、不稳定心绞痛者、冠状动脉病和视网膜色素沉着患者慎用。
对阴茎畸形者慎用。
急性冠状动脉综合征、冠心病明显缺血、心力衰竭、急性心梗、中风、心律失常者忌用。
对有出血性疾病或胃溃疡、遗传性色素性视网膜炎、脊髓损伤等中枢神经系统病、盆腔手术或创伤及接受放疗者慎用。
当服用较大剂量的西地那非时会引起头痛、消化不良、头晕、皮疹等不良反应，更为严重的是，西地那非能增强硝酸酯类药物的降压能力，与任何一种短效或长效的硝酸酯类药物同时使用时，可能会引起致命性低血压反应，甚至导致突然死亡。
育亨宾、西地那非、伐地那非、他达那非等均为处方药，因此在性保健品中被禁止使用，目前不法保健品厂商为了使产品到达中药难以达到的快速效果，在一些保健食品中加入这些违禁药物，严重威胁了服用者的身体健康，影响出口保健品的信誉。
卫生部和中国食品药品管理局等部门多次发文（如《卫生部、国家经贸委、工商总局、药品监督局关于开展保健食品专项整治工作的通知》（卫法监发[2002]172号）要求查处保健食品中添加此类药物的违法行为，因此对保健品中的壮阳违禁药物进行检测具有非常重要的意义。
育亨宾、西地那非、伐地那非和他达拉非化学性质信息见表1。
三、国内外研究现状
目前，国外对西地那非、伐地那非、他达拉非检测方法报道较少[1-4]，且多为单个或两个同时检测的方法，国外报道的较多，有液相色谱-紫外检测法、气相色谱-氢火焰检测法、ESI-HPLC-MS法及ESI-LC/MS/MS等[5-15]，但对育亨宾的检测鲜有报道，更未见同时检测保健食品中这四种违禁药物的报道，因而该方法具有创新性和现实意义。
国内外对西地那非、伐地那非、他达拉非检测方法一览表见表2。
表1育亨宾、西地那非、伐地那非和他达拉非的基本化学信息
通用名
结构式
CAS登陆号
分子式
分子量
育亨宾：
yohimbin
146-48-5
C21H26N2O3
354.4
盐酸育亨宾 :
YohimbineHydrochloride
65-19-0
C21H26N2O3.HCl
390.91
西地那非：
Sildenafil
139755-83-2
C22H30N6O4S
474.6
枸橼酸西地那非：
SildenafilCitrate
171599-83-0
C22H30N6O4S·C6H8O7
666.7
伐地那非：
Vardenafilhydrochloride
224785-91-5
C23H32N6O4S.HCl
525.1
伐地那非盐酸盐：
Vardenafilhydrochloridetrihydrate
224785-90-4
C23H32N6O4S·HCl·3H2O
579.1
他达那非；tadalafil
171596-29-5
C22H19N3O4
389.4
表2西地那非、伐地那非、他达拉非检测方法一览表
目标化合物
样品名称
样品前处理方法
仪器方法
参考文献
色谱柱
流动相
检测器
西地那非
保健食品
甲醇超声提取5min～30min。
DiscoveryC18（5μm250×4.6mmI.D），流速：
0.8mL/min
40mmol/L磷酸三乙胺（pH=3.2）+甲醇+乙腈=40+30+22
二极管阵列检测器，检测波长：
291nm。
[1]
西地那非、伐地那非
人血浆
液-液-液微萃取
HypersiC18（5μm250×4.6mmI.D），流速：
0.5mL/min
150mL乙腈与350mL0.025mol/L三乙胺（以磷酸调pH=3）
UV检测器，292nm；
[2]
伐地那非
保健食品
甲醇超声提取20min。
SpherigelC18（5μm250×4.6mmI.D），流速：
1mL/min
0.2%甲酸水溶液+乙腈=65+35
MS检测器：
单极质谱检测器，ESI+，m/z范围200-700
[3]
西地那非
保健品
样品用甲醇超声提取
ZorbaxEclipseXDB-C18柱（5μm150×2.0mmI.D）
乙腈和0.5%甲酸水溶液梯度洗脱，流速：
0.25mL/min
离子阱质谱检测器，在m/z100-500范围内全离子扫描并选择m/z475正离子方式。
[4]
西地那非
人体血浆和尿
样品过WatersSep-PakPlusC18固相萃取小柱，用5mL10mmol/L的磷酸钠缓冲液（pH7.0）洗涤后，5mL甲醇洗脱。
HP-5（15m×0.25mmI.D.,0.25μm膜厚。
氦气，总流速50ml/min。
柱头压力110kPa，流速1.0ml/min，进样口温度325℃，进样量2μL.，程序升温
MS接口温度：
300℃；EI方式：
70eV;EM电压：
1800V。
SACN方式：
扫描范围35aum～550aum，扫描速度：
1.49scans/s
[5]
西地那非
人体血浆和尿
样品加入0.1mol/L碳酸钠缓冲液后，用乙酸乙酯提取
CapcellPakC18柱UG120，5μm150×4.6mmI.D.
乙腈+20mmol/L磷酸钾缓冲液（pH4.5）=3+7，流速1.0mL/min。
HPLCUV检测器，292nm
[6]
西地那非
精液
样品中加入三氯醋酸和0.1mol/LNaOH后，用乙酸乙酯提取。
C18柱UG120，5μm150×4.6mmI.D.；流速1.0mL/min。
乙腈+16mmol/L磷酸（用NaOH调pH为5.3）=32+68，
二极管阵列检测器，检测波长：
230nm。
[7]
伐地那非
药品
甲醇提取
SupelcosilLC-185μm250×4mmI.D.
乙腈+磷酸钠缓冲液（pH3）=2+8，流速1.0mL/min
UV检测器，230nm
[8]
西地那非、伐地那非、他达那非
口服液、酒、饮料
用甲醇稀释
C18柱（5μm），流速1.0mL/min
20mmol/L乙酸铵和0.2%甲酸水溶液梯度洗脱。
UV检测器，292nm；MS检测器：
全扫描：
m/z60-600,SIR定量
[9]
西地那非
药品
药品用流动相超声提取20min。
PhenomenexLunaC185μm150×4.6mmI.D.
乙腈+水=45+55（V/V），流速1.0mL/min。
UV检测器，220nm
[10]
他达那非
药品
样品用甲醇超声（80℃）提取
ChromolithPerformanceRP-18e（100×4.6mmI.D）
0.1mol/L磷酸缓冲液（pH3.0）+乙腈=8+2;流速0.5mL/min
UV检测器，230nm；
[11]
西地那非
药品
样品用水湿润后用甲醇振药提取
H和C18柱，10μm300×3.9mmI.D.（Waters,USA）
甲醇+水+乙腈=6+2+2，用0.1%冰醋酸调pH6.1，流速0.50mL/min
UV检测器，290nm；
[12]
西地那非
体液
样品加入NH4Cl缓冲液（pH9.5）后，用氯仿/2丙醇/n-heptane（25/10/65）提取。
NovaPakC18（Waters,Milford,MA）,4μm150×2.0mmI.D.
乙腈+三乙胺和2mmol/LNH4COOH缓冲液梯度洗脱流速：
0.20mL/min
API-100单四极杆质谱分析器，阳离子方式，SIR（m/z475,283,534）
[13]
西地那非
软饮料
样品用甲醇稀释
TSKgelODS80TM（5μm150×4.6mmI.D）
水+乙腈=13+7，用甲酸调pH3.0，流速1.0mL/min
MS检测器：
单极，正离子
[14]
四、术语（《中国药典2005年版》）
片剂：
系指药物与适宜的辅料压制而成的圆片状或异形片状的固体制剂，抗疲劳保健食品只要是口服普通片。
胶囊剂：
系指药物或叫加有辅料充填于空心胶囊或密封于软质囊材中的固体制剂。
抗疲劳保健食品胶囊剂主要为硬胶囊和软胶囊两类，供口服用。
硬胶囊（通常称为胶囊）：
系采用适宜的制剂技术，将药物或加适宜辅料制成粉末、颗粒、小片或小丸等充填于空心胶囊中的胶囊剂。
软胶囊：
系将一定量的液体药物直接包封，或将固体药物溶解或分散在适宜的敷形剂中制备成溶液、混悬液、乳状液或半固体，密封于球形或椭圆形的软质囊材中的胶囊剂。
可用滴制法或压制法制备。
软质囊材是由胶囊用明胶、甘油或其他适宜的药用材料单独或混合制成。
口服溶液剂（药酒与口服溶液剂一致）：
系制药物溶解于适宜溶剂中制成供口服的澄清液体制剂。
五、方法论证
1、样品制备
本标准方法的样品制备按照《中国药典2005年版附录I制剂通则》的取样量及药典相关剂型制备方法进行。
对于片剂、胶囊剂进行检测时，最大的取样量均为20片（粒），口服溶液剂最大的取样量均为10支。
片剂试样的制备方法：
随机取同一批号的供试品20片，研细（用研钵充分研成粉末状试样）。
硬胶囊试样的制备方法：
随机取同一批号的供试品20粒，倾出内容物，研细（用研钵充分研成粉末状试样）。
软胶囊试样的制备方法：
随机取同一批号的供试品20粒，将内容物全部挤到一离心管中，在混匀器上充分混匀，作为试样。
口服溶液剂试样的制备方法：
随机取同一批号的供试品10支（瓶），取等量体积样品到同一容器中混匀作为试样。
2、试剂和材料
除另有说明外，所用试剂均为分析纯，水为GB/T6682规定的一级水。
2.1甲醇：
液相色谱级。
2.2乙腈：
液相色谱级。
2.3乙酸：
优级纯。
2.40.1%乙酸水溶液∶甲醇混合液：
1+1（V/V）。
2.5育亨宾（yohimbin）CAS 号：
146-48-5，分子式：
C21H26N2O3）标准品纯度大于等于99.0%。
2.6他达那非（tadalafil，CAS号：
171596-29-5，分子式：
C22H19N3O4）标准品纯度大于等于99.0%。
2.7西地那非（Sildenafil，CAS号：
139755-83-2，分子式：
C22H30N6O4S）标准品：
纯度大于等于99.0%。
2.8伐地那非（vardenafil，CAS号：
224785-91-5，分子式：
C23H32N6O4S·HCl）标准品：
纯度大于等于99.0%。
2.9标准溶液：
分别准确称取适量育亨宾、伐地那非、西地那非、他达那非标准品，用甲醇配制成浓度为10μg/mL的混合标准储备液（4℃下避光保存6个月）。
根据需要用0.1%乙酸∶甲醇混合液（4.4）将标准储备液稀释成1ng/mL、5ng/mL、10ng/mL、50ng/mL、100ng/mL的混合标准工作溶液（4℃下避光保存1个月）。
3仪器
3.1高效液相色谱-串联质谱仪：
配有电喷雾离子源（ESI）。
3.2超声波清洗器。
3.3旋涡混匀器。
3.4分析天平：
感量0.1mg和0.01g各一台。
3.5真空泵。
3.6离心机。
4质谱条件的确定
将仪器条件、各路气体流量调到最佳值,使仪器响应达到最佳。
API4000优化的参数为：
雾化气、窗帘气、辅助加热气、碰撞气均为高纯液氮气，其参考值为：
窗帘气（CUR）：
20.00；雾化气（GS1）：
40.00psi；辅助加热气（GS2）：
45.00psi；碰撞气（CAD）：
7.00psi；离子源喷雾电压（IS）：
5000.00V；TEM：
550.00℃；ihe：
ON。
采用SyringePump对4种目标化合物进行质谱条件的优化（以育亨宾为例）
4.1Q1扫描寻找母离子,为355.2。
图1Q1扫描图
4.2进行DP扫描,确定DP电压为108v。
图2DP电压扫描图
4.3Q3扫描确定子离子为144.1和212.4;进行CE扫描和MRM试验,确定两个子离子的最佳CE值为30和50,EXP值为15.
图3子离子扫描图
同样方法确定各目标化合物的质谱条件见表3.
表34种目标化合物质谱条件
目标化合物
Q1
m/z
Q3
m/z
DP电压
（V）
EP
（V）
CE
（V）
CXP
（V）
育亨宾
355.2*
144.1*
108
10
30
15
355.2
212.4
108
10
50
15
伐地那非
489.5*
151.1*
120
10
60
14
489.5
312.1
120
10
56
18
西地那非
475.3*
100.1*
110
10
40
16
475.3
58.0
110
10
82
12
他达那非
390.4*
268.3*
70
10
18
17
390.4
135.1
70
10
30
22
注：
“*”为定量离子对。
5、色谱柱的确定
在上述质谱条件下，选择色谱柱COSMOSIL5C18-MS-IIWaters，2.1×150mm,5μm；色谱柱2：
ZORBAXEclipseXDB-C18，4.6×250mm,5μm；流动相组成：
0.1%乙酸水溶液与乙腈梯度洗脱。
此两种色谱柱均能对该4种化合物进行分离，从实验室通用性考虑，我们采用了ZORBAXEclipseXDB-C18，4.6×150mm,5μm。
6流动相组成的确定
由于有机相的含量对目标化合物洗脱影响较大，采用等梯度洗脱时，若有机相含量低，伐他达那非难以洗脱，提高有机相含量，不仅伐地那非、西地那非分离不佳，而且育亨宾洗脱速度太快，易产生离子抑制效应，影响定量分析，因而我们采取了梯度洗脱方式。
通过实验证明，在流动相中加入0.1%的乙酸，可以减少拖尾，优化色谱峰型。
经过实验证明，流速为500μL/min，在下列梯度洗脱条件（见表4）下，4种目标化合物均得到了很好的分离（见图4）。
表4流动相梯度洗脱程序
时间
min
0.1%乙酸水溶液
%
乙腈
%
0.00
80.0
20.0
3.00
80.0
20.0
8.00
5.0
95.0
13.00
5.0
95.0
13.01
80.0
20.0
20.00
80.0
20.0
图4育亨宾、伐地那非、西地那非、他达那非标准提取离子叠加色谱图及提取离子色谱图
5、标准曲线和线性范围
在所选择的LC/MS/MS条件下，采用选择的定量离子，4种目标化合物在1ng/mL-100ng/mL范围内成线性关系，线性方程、相关系数和线性曲线见图5-8。
图5育亨宾定量离子对（355.2/144.1）线性曲线（r=0.9997）
图6伐地那非定量离子对（486.5/151.1）线性曲线（r=0.9993）
图7西地那非定量离子对（475.3/100.1）线性曲线r=0.9997
图8他达那非定量离子对（390.4/268.3）线性曲线r=0.9996
超出线性范围后，应当对提取液进行适当的稀释，使得检测的响应在线性范围之内。
根据样品处理方法,在此浓度范围内，它们分别相当于样品含有目标化合物：
固体样品为1.0mg/kg～100.0mg/kg的含量范围,液体样品为0.010mg/L～100.0mg/L.此时固体样品的检测定量低限为1.0mg/kg，液体样品的定量低限为0.01mg/L，满足保健食品中是否添加有这4种违禁药物检验要求。
图9育亨宾检测低限1ng/mL提取离子色谱图
图10伐地那非检测低限1ng/mL提取离子色谱图
图11西地那非检测低限1ng/mL提取离子色谱图
图12他达那非检测低限1ng/mL提取离子色谱图
6、实验室内精密度实验
6.1量取待测试样1.0mL于10.0mL容量瓶中，加入0.1%乙酸l+甲醇（1+1，V/V）经充分混匀后定容，过0.45μm微孔滤膜后，上LC/MS/MS测定。
实验试样：
氨基酸饮品，该试样不含待测违禁物。
表5氨基酸饮品育亨宾、伐地那非、西地那非、他达那非添加实验室内精密度实验结果
添加水平（ng/mL）
育亨宾
伐地那非
西地那非
他达那非
测定结果（ng/mL）
变异系数
CV（%）
回收率
（%）
测定结果（ng/mL）
变异系数CV（%）
回收率
（%）
测定结果（ng/mL）
变异系数CV（%）
回收率
（%）
测定结果（ng/mL）
变异系数CV（%）
回收率
（%）
10.0
10.4
5.8
93.6
-112
9.77
5.7
81.1-
97.9
9.95
5.3
91.1-107
9.77
5.5
82.1-97.7
9.80
8.91
9.11
8.58
11.2
9.15
9.42
9.27
9.36
9.09
10.7
9.03
10.7
8.11
9.7
8.85
10.2
9.48
10.2
8.21
50.0
51.9
2.4
96.6-104
48.2
4.6
86.6-
99.2
45.6
4.8
91.2-103
48.2
3.9
89.8-101
50.4
49.6
51.6
50.6
48.3
43.3
49.3
48.3
51.5
47.6
50.1
48.6
47.6
49.6
44.7
45.3
50.2
50.3
45.9
51.5
44.9
100
97.5
4.4
94.4-104
95.8
4.3
85.6-
98.6
99.1
3.0
95.8-105
96.5
4.2
92.8-103
102.8
93.9
95.8
98.9
92.2
98.6
101.4
90.9
94.4
94.3
105.3
102.7
104．1
85.6
102.7
93.7
95.6
91.7
98.7
92.8
图13试剂空白提取离子叠加色谱图
图14氨基酸口服液提取离子叠加色谱
图15氨基酸口服液添加10μg/L育亨宾、伐地那非、西地那非、他达那非提取离子叠加色谱图
图16氨基酸口服液添加50μg/L育亨宾、伐地那非、西地那非、他达那非提取离子叠加色谱图
图17氨基酸口服液添加100μg/L育亨宾、伐地那非、西地那非、他达那非提取离子叠加色谱图
6.2、片剂样品提取方法的选择及实验室内回收率
称取碾碎混匀的样品1.00g于100mL容量瓶中，加入80mL甲醇于超声波清洗器中超声处理30min后，取出冷却，用甲醇定容并充分混匀，定量取1.0mL提取液于10.0mL容量瓶中，用0.1%乙酸+甲醇（1+1）定容后混匀，过0.45μm微孔滤膜后，上LC/MS/MS测定。
我们选择了可邦男性抗衰老片作为添加回收实验样，经试验该试样中不含这4种违禁药物。
表6可邦男性抗衰老片中添加育亨宾、伐地那非、西地那非、他达那非实验室内精密度数据及回收率
育亨宾
伐地拉非
西地拉非
他达那非
测定结果
mg/kg
回收率
（%）
变异
系数
CV
测定结果
mg/kg
回收率
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变异
系数
CV
测定结果（mg/kg）
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系数
CV
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系数CV
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