进出口保健食品中育亨宾伐地那非西地那非西力士含量的测定方法.docx

1、进出口保健食品中育亨宾伐地那非西地那非西力士含量的测定方法保健食品中育亨宾、伐地那非、西地那非、他达那非含量的测定方法液相色谱-质谱/质谱法编制说明一、 任务来源本标准是根据国家认监委下达的计划编号为“2009B568”制标任务编写的。本标准由湖南出入境检验检疫局承担研究和起草。二、研究目的育亨宾又称痿必治为非激素类药物，最早是从产于西非洲一种植物(Corynante Yohimbe)树皮中提出的一种生物碱,现已有合成品。自古以来育亨宾即在非洲用作催欲药，1900年哥维及苗勒等应用于因神经衰弱所致的阳萎及麻痹性不感症取得疗效，因而用于临床。其药理作用能使血管平滑肌扩张，降低交感神经张力，通过扩

2、张阴茎的动脉，增加阴茎海绵窦血流量；使阴茎勃起，并使中枢性交感神经兴奋。适用于精神性、神经性、血管性及糖尿病性阳痿。是目前较为肯定而且应用最多的一种植物性治疗勃起功能障碍的药品，一般服用剂量为500mg。 但育亨宾并不适合正在服用抗忧郁剂的人仕服用也不适合患有肾脏疾病或胃溃疡者服用。此外，服用高剂量的育亨宾可能会导致严重的副作用包括丧失肌肉功能血压升高，忧虑心悸眩晕等。对有些人而言，育亨宾能引起幻觉。某些食物如芝士动物肝脏红酒等也应避免与育亨宾同时进食以免令血压升高。西地那非俗称伟哥，磷酸二酯酶-5（inhibitor of phosphodiesterase type 5,简写PDE-5）选

3、择性抑制剂,原为一种抗心绞痛的新药，由于其在临床试验中被发现有治疗男性勃起功能障碍（Erectile dysfunction,ED）的作用而改变了研发方向，一般在用药后40 min 见效，剂量为50 mg。与其作用相似的药物还有德国Bayer与葛兰素史克公司联合开发的伐地那非，于2003 年8 月获得FDA 批准在美国上市，此药用后10 min 起效，一般剂量为10 mg，对PDE-5的抑制能力是西地那非的5倍，因而在临床上5、10、20 mg伐地那非的作用相当于25、50、100 mg 西地那非的作用。美国Lilly公司开发的他达拉非，商品名他达那非也获得欧盟批准上市，其对磷酸二酯酶5有更好

4、的选择性，促进阴茎勃起的效果可长达36个小时。他达那非的平均起效时间是16 min。服用量为10-20 mg，建议东方人服用量为25-35 mg。磷酸二酯酶5抑制剂的不良反应主要表现在中枢神经、循环和视觉系统，常见有头痛、面部潮红、焦虑、消化不良、腹部不适、肌痛、骨痛、血尿；循环系统表现为心律失常、心梗、心脏猝死、脑出血、高血压；视觉系统表现为对光敏感、视力模糊、复视、眼肿、眼压高、视物蓝绿。 磷酸二酯酶5抑制剂18岁以下的人禁用，对在6个月内曾发生过心梗、中风、致死性心律失常、低血压或高血压者、不稳定心绞痛者、冠状动脉病和视网膜色素沉着患者慎用。对阴茎畸形者慎用。急性冠状动脉综合征、冠心病明

5、显缺血、心力衰竭、急性心梗、中风、心律失常者忌用。对有出血性疾病或胃溃疡、遗传性色素性视网膜炎、脊髓损伤等中枢神经系统病、盆腔手术或创伤及接受放疗者慎用。当服用较大剂量的西地那非时会引起头痛、消化不良、头晕、皮疹等不良反应，更为严重的是，西地那非能增强硝酸酯类药物的降压能力，与任何一种短效或长效的硝酸酯类药物同时使用时，可能会引起致命性低血压反应，甚至导致突然死亡。育亨宾、西地那非、伐地那非、他达那非等均为处方药，因此在性保健品中被禁止使用，目前不法保健品厂商为了使产品到达中药难以达到的快速效果，在一些保健食品中加入这些违禁药物，严重威胁了服用者的身体健康，影响出口保健品的信誉。卫生部和中国食

6、品药品管理局等部门多次发文（如卫生部、国家经贸委、工商总局、药品监督局关于开展保健食品专项整治工作的通知（卫法监发2002172号）要求查处保健食品中添加此类药物的违法行为，因此对保健品中的壮阳违禁药物进行检测具有非常重要的意义。育亨宾、西地那非、伐地那非和他达拉非化学性质信息见表1。 三、国内外研究现状目前，国外对西地那非、伐地那非、他达拉非检测方法报道较少1-4，且多为单个或两个同时检测的方法，国外报道的较多，有液相色谱-紫外检测法、气相色谱-氢火焰检测法 、ESI-HPLC-MS 法及ESI-LC/MS/MS等5-15，但对育亨宾的检测鲜有报道，更未见同时检测保健食品中这四种违禁药物的报

7、道，因而该方法具有创新性和现实意义。国内外对西地那非、伐地那非、他达拉非检测方法一览表见表2。表 1 育亨宾、西地那非、伐地那非和他达拉非的基本化学信息 通用名 结构式 CAS 登陆号 分子式 分子量 育亨宾：yohimbin146-48-5 C21H26N2O3354.4盐酸育亨宾: Yohimbine Hydrochloride65-19-0C21H26N2O3.HCl390.91西地那非：Sildenafil 139755-83-2 C22H30N6O4S 474.6 枸橼酸西地那非：Sildenafil Citrate 171599-83-0 C22H30N6O4SC6H8 O7 66

8、6.7 伐地那非：Vardenafil hydrochloride224785-91-5C23H32N6O4S.HCl525.1伐地那非盐酸盐：Vardenafil hydrochloride trihydrate224785-90-4 C23H32N6O4SHCl 3H2O 579.1 他达那非；tadalafil 171596-29-5 C22H19N3O4 389.4 表2 西地那非、伐地那非、他达拉非检测方法一览表目标化合物样品名称样品前处理方法仪器方法参考文献色谱柱流动相检测器西地那非保健食品甲醇超声提取5 min30 min。Discovery C18（5m 2504.6 mm I

9、.D），流速：0.8 mL/min 40 mmol/L 磷酸三乙胺（pH=3.2）+甲醇+乙腈=40+30+22 二极管阵列检测器，检测波长：291 nm。1 西地那非、伐地那非人血浆液-液-液微萃取Hypersi C18（5m 2504.6 mm I.D），流速：0.5 mL/min 150 mL 乙腈与350mL 0.025 mol/L 三乙胺（以磷酸调pH=3） UV 检测器，292nm； 2 伐地那非保健食品甲醇超声提取20min。Spherigel C18（5m 2504.6 mm I.D），流速：1 mL/min 0.2%甲酸水溶液+乙腈=65+35 MS 检测器：单极质谱检测器，

10、ESI+，m/z 范围200-700 3 西地那非保健品样品用甲醇超声提取Zorbax Eclipse XDB-C18 柱（5 m 1502.0 mm I.D） 乙腈和0.5%甲酸水溶液梯度洗脱，流速：0.25 mL/min 离子阱质谱检测器，在m/z 100-500 范围内全离子扫描并选择 m/z 475 正离子方式。4 西地那非人体血浆和尿样品过Waters Sep-Pak Plus C18 固相萃取小柱，用5 mL 10 mmol/L 的磷酸钠缓冲液（pH 7.0）洗涤后，5mL 甲醇洗脱。HP-5(15 m0.25 mm I.D.,0.25 m 膜厚。氦气，总流速50ml/min 。柱

11、头压力110kPa ，流速1.0 ml/min ， 进样口温度325，进样量2L.，程序升温MS 接口温度：300；EI 方式：70 eV;EM 电压：1800V。SACN 方式：扫描范围35 aum550 aum，扫描速度：1.49scans/s 5 西地那非人体血浆和尿样品加入0.1 mol/L 碳酸钠缓冲液后，用乙酸乙酯提取Capcell Pak C18 柱 UG120， 5 m 1504.6 mm I.D. 乙腈+20 mmol/L 磷酸钾缓冲液（pH4.5） =3+7，流速1.0 mL/min。HPLC UV 检测器，292 nm 6 西地那非精液样品中加入三氯醋酸和0.1 mol/

12、L NaOH 后，用乙酸乙酯提取。C18 柱 UG120， 5m 150 4.6 mm I.D. ；流速1.0 mL/min。乙腈+16 mmol/L 磷酸（用NaOH 调pH 为5.3）=32+68， 二极管阵列检测器，检测波长：230 nm。7 伐地那非药品甲醇提取Supelcosil LC-18 5m 2504 mm I.D. 乙腈+磷酸钠缓冲液（pH3）=2+8 ，流速1.0 mL/min UV 检测器，230 nm 8 西地那非、伐地那非、他达那非口服液、酒、饮料用甲醇稀释 C18 柱（5m），流速1.0 mL/min 20 mmol/L 乙酸铵和0.2%甲酸水溶液梯度洗脱。UV 检

13、测器，292nm；MS 检测器：全扫描： m/z 60-600,SIR 定量9 西地那非药品药品用流动相超声提取20 min。Phenomenex Luna C18 5m 150 4.6 mm I.D. 乙腈+水=45+55（V/V），流速1.0 mL/min。UV 检测器，220 nm 10 他达那非药品样品用甲醇超声（80）提取Chromolith Performance RP-18e (1004.6 mm I.D) 0.1 mol/L 磷酸缓冲液（pH 3.0）+乙腈=8+2; 流速0.5 mL/min UV 检测器，230nm； 11 西地那非药品样品用水湿润后用甲醇振药提取H 和C1

14、8 柱，10m 3003.9 mm I.D. (Waters,USA) 甲醇+水+乙腈=6+2+2，用0.1%冰醋酸调pH 6.1，流速0.50 mL/min UV 检测器，290nm； 12 西地那非体液样品加入NH4Cl 缓冲液（pH 9.5） 后，用氯仿/2丙醇/n-heptane(25/10/65)提取。NovaPak C18(Waters,Milford, MA), 4m 1502.0 mm I.D. 乙腈+三乙胺和2 mmol/L NH4COOH 缓冲液梯度洗脱流速：0.20 mL/min API-100 单四极杆质谱分析器，阳离子方式，SIR （ m/z 475,283,534）

15、 13 西地那非软饮料样品用甲醇稀释TSK gel ODS 80TM（5m 150 4.6 mm I.D） 水+乙腈=13+7，用甲酸调pH 3.0，流速1.0 mL/min MS 检测器：单极，正离子14四、术语（中国药典 2005 年版） 片剂：系指药物与适宜的辅料压制而成的圆片状或异形片状的固体制剂，抗疲劳保健食品只要是口服普通片。胶囊剂：系指药物或叫加有辅料充填于空心胶囊或密封于软质囊材中的固体制剂。抗疲劳保健食品胶囊剂主要为硬胶囊和软胶囊两类，供口服用。硬胶囊（通常称为胶囊）：系采用适宜的制剂技术，将药物或加适宜辅料制成粉末、颗粒、小片或小丸等充填于空心胶囊中的胶囊剂。软胶囊：系将一

16、定量的液体药物直接包封，或将固体药物溶解或分散在适宜的敷形剂中制备成溶液、混悬液、乳状液或半固体，密封于球形或椭圆形的软质囊材中的胶囊剂。可用滴制法或压制法制备。软质囊材是由胶囊用明胶、甘油或其他适宜的药用材料单独或混合制成。口服溶液剂（药酒与口服溶液剂一致）：系制药物溶解于适宜溶剂中制成供口服的澄清液体制剂。五、方法论证 1、样品制备 本标准方法的样品制备按照中国药典2005 年版附录I 制剂通则的取样量及药典相关剂型制备方法进行。对于片剂、胶囊剂进行检测时，最大的取样量均为20 片（粒），口服溶液剂最大的取样量均为10 支。片剂试样的制备方法：随机取同一批号的供试品20 片，研细（用研钵充

17、分研成粉末状试样）。硬胶囊试样的制备方法：随机取同一批号的供试品20 粒，倾出内容物，研细（用研钵充分研成粉末状试样）。软胶囊试样的制备方法：随机取同一批号的供试品20 粒，将内容物全部挤到一离心管中，在混匀器上充分混匀，作为试样。口服溶液剂试样的制备方法：随机取同一批号的供试品10 支（瓶），取等量体积样品到同一容器中混匀作为试样。2、试剂和材料除另有说明外， 所用试剂均为分析纯，水为GB/T 6682规定的一级水。2.1 甲醇：液相色谱级。2.2 乙腈：液相色谱级。2.3 乙酸：优级纯。2.4 0.1 %乙酸水溶液甲醇混合液：1+1（V/V）。2.5 育亨宾 （yohimbin）CAS号：

18、146-48-5，分子式：C21H26N2O3）标准品纯度大于等于99.0%。2.6 他达那非（tadalafil，CAS号：171596-29-5，分子式：C22H19N3O4）标准品纯度大于等于99.0%。2.7 西地那非（Sildenafil，CAS号：139755-83-2，分子式：C22H30N6O4S）标准品：纯度大于等于99.0%。2.8 伐地那非（vardenafil，CAS号：224785-91-5，分子式：C23H32N6O4SHCl）标准品：纯度大于等于99.0%。2.9 标准溶液：分别准确称取适量育亨宾、伐地那非、西地那非、他达那非标准品，用甲醇配制成浓度为10 g/m

19、L的混合标准储备液(4下避光保存6个月)。根据需要用0.1 % 乙酸甲醇混合液（4.4）将标准储备液稀释成1 ng/mL、5 ng/mL、10 ng/mL、50 ng/mL、100 ng/mL的混合标准工作溶液(4下避光保存1个月)。3 仪器3.1高效液相色谱-串联质谱仪：配有电喷雾离子源(ESI)。3.2 超声波清洗器。3.3 旋涡混匀器。3.4 分析天平：感量 0.1 mg和 0.01 g各一台。3.5 真空泵。3.6 离心机。4 质谱条件的确定 将仪器条件、各路气体流量调到最佳值,使仪器响应达到最佳。API 4000优化的参数为： 雾化气、窗帘气、辅助加热气、碰撞气均为高纯液氮气，其参考

20、值为：窗帘气（CUR）：20.00；雾化气（GS1）：40.00 psi；辅助加热气（GS2）：45.00 psi；碰撞气（CAD）：7.00 psi； 离子源喷雾电压（IS）：5000.00 V；TEM：550.00；ihe：ON。 采用Syringe Pump 对4 种目标化合物进行质谱条件的优化(以育亨宾为例) 4.1 Q1扫描寻找母离子,为355.2。图 1 Q1扫描图4.2 进行DP扫描,确定DP电压为108v。图2 DP电压扫描图4.3 Q3扫描确定子离子为144.1和212.4;进行CE扫描和MRM试验,确定两个子离子的最佳CE值为30和50,EXP值为15.图3 子离子扫描图同

21、样方法确定各目标化合物的质谱条件见表3.表3 4种目标化合物质谱条件目标化合物Q1m/zQ3m/z DP电压(V)EP(V)CE(V)CXP(V)育亨宾355.2*144.1*108103015355.2212.4108105015伐地那非489.5*151.1*120106014489.5312.1120105618西地那非475.3*100.1*110104016475.358.0110108212他达那非390.4*268.3*70101817390.4135.170103022注：“*”为定量离子对。5、色谱柱的确定在上述质谱条件下，选择色谱柱COSMOSIL 5C18-MS-II W

22、aters，2.1 150 mm, 5 m；色谱柱2：ZORBAX Eclipse XDB-C18，4.6 250 mm, 5 m；流动相组成：0.1%乙酸水溶液与乙腈梯度洗脱。 此两种色谱柱均能对该4种化合物进行分离，从实验室通用性考虑，我们采用了ZORBAX Eclipse XDB-C18，4.6 150 mm, 5 m。6 流动相组成的确定 由于有机相的含量对目标化合物洗脱影响较大，采用等梯度洗脱时，若有机相含量低，伐他达那非难以洗脱，提高有机相含量，不仅伐地那非、西地那非分离不佳，而且育亨宾洗脱速度太快，易产生离子抑制效应，影响定量分析，因而我们采取了梯度洗脱方式。通过实验证明，在流动

23、相中加入0.1%的乙酸，可以减少拖尾，优化色谱峰型。经过实验证明，流速为500 L/min， 在下列梯度洗脱条件（见表4）下，4种目标化合物均得到了很好的分离（见图4）。表4 流动相梯度洗脱程序时间min0.1%乙酸水溶液%乙腈%0.0080.020.03.0080.020.08.005.095.013.005.095.013.0180.020.020.0080.020.0图 4 育亨宾、伐地那非、西地那非、他达那非标准提取离子叠加色谱图及提取离子色谱图5、标准曲线和线性范围在所选择的LC/MS/MS 条件下，采用选择的定量离子，4种目标化合物在1ng/mL-100ng/mL范围内成线性关系，

24、线性方程、相关系数和线性曲线见图5-8。图 5 育亨宾定量离子对（355.2/144.1）线性曲线(r=0.9997)图6 伐地那非定量离子对（486.5/151.1）线性曲线(r=0.9993)图 7 西地那非定量离子对（475.3/100.1）线性曲线r=0.9997图 8 他达那非定量离子对（390.4/268.3）线性曲线r=0.9996超出线性范围后，应当对提取液进行适当的稀释，使得检测的响应在线性范围之内。根据样品处理方法,在此浓度范围内，它们分别相当于样品含有目标化合物：固体样品为1.0 mg/kg100.0 mg/kg的含量范围,液体样品为0.010 mg/L100.0 mg/

25、L.此时固体样品的检测定量低限为1.0 mg/kg，液体样品的定量低限为 0.01 mg/L，满足保健食品中是否添加有这4种违禁药物检验要求。图 9 育亨宾检测低限1 ng/mL 提取离子色谱图图 10 伐地那非检测低限1 ng/mL 提取离子色谱图图 11 西地那非检测低限1 ng/mL 提取离子色谱图图 12 他达那非检测低限1 ng/mL 提取离子色谱图6、实验室内精密度实验6.1 量取待测试样1.0 mL 于10.0 mL 容量瓶中，加入0.1 %乙酸l+甲醇（1+1，V/V）经充分混匀后定容，过0.45 m 微孔滤膜后，上LC/MS/MS 测定。实验试样：氨基酸饮品，该试样不含待测违

26、禁物。表 5 氨基酸饮品育亨宾、伐地那非、西地那非、他达那非添加实验室内精密度实验结果添加水平（ng/mL） 育亨宾伐地那非 西地那非 他达那非 测定结果（ng/mL）变异系数CV（%） 回收率（%）测定结果（ng/mL）变异系数CV（%） 回收率（%）测定结果（ng/mL） 变异系数CV（%） 回收率（%）测定结果（ng/mL） 变异系数 CV（%） 回收率（%）10.0 10.4 5.893.6-1129.77 5.781.1-97.99.95 5.391.1-1079.77 5.5 82.1-97.79.80 8.91 9.11 8.58 11.2 9.15 9.42 9.27 9.36

27、9.09 10.79.03 10.7 8.119.78.8510.29.48 10.2 8.2150.0 51.9 2.4 96.6-10448.2 4.686.6-99.245.6 4.891.2-10348.2 3.9 89.8-10150.4 49.6 51.6 50.6 48.3 43.3 49.3 48.3 51.5 47.6 50.148.6 47.6 49.6 44.7 45.3 50.2 50.3 45.9 51.5 44.9 100 97.5 4.4 94.4-10495.84.385.6-98.699.1 3.0 95.8-10596.5 4.2 92.8-103102.8

28、 93.9 95.8 98.9 92.298.6 101.4 90.9 94.494.3105.3102.7104185.6102.793.795.6 91.798.792.8图 13试剂空白提取离子叠加色谱图图 14 氨基酸口服液提取离子叠加色谱 图 15 氨基酸口服液添加10 g/L 育亨宾、伐地那非、西地那非、他达那非提取离子叠加色谱图图 16氨基酸口服液添加50 g/L 育亨宾、伐地那非、西地那非、他达那非提取离子叠加色谱图图 17 氨基酸口服液添加100 g/L 育亨宾、伐地那非、西地那非、他达那非提取离子叠加色谱图6.2、片剂样品提取方法的选择及实验室内回收率称取碾碎混匀的样品1.

29、00 g于100 mL 容量瓶中，加入80 mL甲醇于超声波清洗器中超声处理30 min 后，取出冷却，用甲醇定容并充分混匀，定量取1.0 mL 提取液于10.0 mL 容量瓶中，用0.1%乙酸+甲醇(1+1)定容后混匀，过0.45m 微孔滤膜后，上LC/MS/MS 测定。我们选择了可邦男性抗衰老片作为添加回收实验样，经试验该试样中不含这4种违禁药物。表 6 可邦 男性抗衰老片中添加育亨宾、伐地那非、西地那非、他达那非实验室内精密度数据及回收率育亨宾伐地拉非西地拉非他达那非测定结果mg/kg 回收率（%）变异系数CV 测定结果mg/kg 回收率（%）变异系数CV 测定结果（mg/kg） 回收率（%）变异系数CV 测定结果mg/kg 回收率（%）变异系数CV 样品 未检出未检出