人sox7启动子荧光素酶报告基因的构建及hmga2对其调控的验证.docx

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人sox7启动子荧光素酶报告基因的构建及hmga2对其调控的验证

人SOX7启动子荧光素酶报告质粒的构建及HMGA2对其调控的验证

【摘要】目的:

构建人SOX7基因启动子荧光素酶报告质粒，通过荧光素酶报告实验观察转录因子HMGA2对SOX7基因启动子荧光素酶活性的影响，为进一步研究HMGA2转录表达的调控机制提供必要的实验基础。

方法：

采用PCR技术扩增人SOX7基因启动子序列（-1549～+79nt），将SOX7基因启动子插入荧光素酶报告基因载体pGL3-basic中构建质粒pGL3-SOX7-promoter；再分别将pGL3-SOX7-promoter、pGL3-basic-SOX7-promoter和对照质粒（pLV-UbC-IRES2-EGFP）、pGL3-SOX7-promoter和HMGA2表达质粒（pLV-UbC-HMGA2-IRES2-EGFP）三组质粒共转染293T细胞，培养48小时后，检测三组荧光素酶的表达情况，观察HMGA2对SOX7基因启动子的调控作用。

结果：

通过菌落PCR和核酸测序证实，人SOX7基因启动子荧光素酶报告质粒pGL3-SOX7-promoter构建成功；将pGL3-SOX7-promoter和HMGA2表达质粒（pLV-UbC-HMGA2-IRES2-EGFP）共转染293T细胞48h后，与对照组相比，SOX7基因启动子介导荧光素酶的活性降低约31%，受到明显抑制（P<0.01），提示HMGA2可能调控SOX7基因启动子的活性。

结论：

成功构建了SOX7基因启动子荧光素酶报告质粒，初步验证了SOX7可能是HMGA2下游的作用靶点。

【关键词】SOX7，HMGA2，荧光素酶报告质粒，启动子活性

ConstructionoftheHumanSOX7PromoterLuciferaseReportPlasmidandVerificationofHMGA2’sRegulationtoSOX7

[Abstract]Objective:

ToobserveeffectsofthetranscriptionfactorHMGA2onSOX7promoterluciferaseactivitybyconstructingthehumanSOX7promoterluciferasereportplasmidandtheluciferasereporterexperiment,andprovidethenecessaryexperimentalbasisforfurtherresearchingonthetranscriptionalandregulatingmechanismofHMGA2.

Methods:

ThehumanSOX7genepromotersequences（-1549~+79nt）wereamplifiedbyPCR,andSOX7genepromoterwasinsertedintotheluciferasereportergenevectorpGL3-basic.Threegroupplasmids,SOX7promoterluciferasereporterplasmid（pGL3-SOX7-promoter）,pGL3-SOX7-promoterandthecontrolplasmid（pLV-UbC-IRES2-EGFP）,pGL3-SOX7-promoterandHMGA2expressionplasmid（pLV-UbC-HMGA2-IRES2-EGFP）,were respectivelyco-transfectedinto293Tcells,andthenwemeasuredtheexpressionofluciferaseafter48hoursandobservedthepromotingeffectofHMGA2onSOX7.

Results:

ItwasverifiedthathumanSOX7genepromoterluciferasereporterplasmidwassuccessfullyconstructedbyPCRandnucleotidesequencing.Comparedwiththecontrolgroup，SOX7promoteractivitywassignificantlysuppressedabout31%afterpGL3-SOX7-promoterandpLV-UbC-HMGA2-IRES2-EGFPwereco-transfectedinto293Tcells（P<0.01）,whichindicatedthatHMGA2mayregulateSOX7promoteractivity.

Conclusion:

SOX7genepromoterluciferasereporterplasmidwasconstructedsuccessfully,anditwaspreliminarilyverifiedthatSOX7genemaybethedownstreamtargetofHMGA2.

[Keywords]SOX7，HMGA2，luciferasereporterplasmid，promoteractivity

SOX7是含HMGdomain的SOX转录因子家族F亚族的一个成员[1]。

研究发现，SOX7基因的C端存在转录激活结构域，它可以和β-catenin竞争TCF/LEF（Tcellfctor/lymphoidenhancerfactor）上的结合位点，通过阻滞β-catenin/TCF介导的基因激活而抑制Wnt／β-catenin信号通路的激活，使细胞的异常增生活动终止，从而发挥其肿瘤抑制的功能[2,3]。

目前在肿瘤转移机制方面，普遍认为细胞发生上皮间质转化（EMT）是肿瘤转移的关键环节，肿瘤细胞通过EMT可以获得浸润和远处转移能力[4]。

研究证实，高迁移率族蛋白A2（HMGA2）是一种非组蛋白染色体蛋白，其本身无转录活性，但可以选择性地结合到DNA特异构象中，继而改变染色质结构，调节其他相关基因的转录表达，从而影响胚胎形成、组织发生以及肿瘤的发生发展[5-7]。

多项关于肿瘤侵袭的研究发现[8-10]，HMGA2可能参与了肿瘤细胞的EMT过程。

在本课题组前期研究中[11,12]，发现HMGA2诱导胃癌细胞发生EMT与Wnt/β-catenin信号通路的激活有关，并通过染色质免疫共沉淀技术（ChromatinImmunoprecipitation，ChIP）从chip-on-chip芯片筛选出与胃癌细胞EMT相关的SOX7基因。

结合近年来关于SOX7基因的研究报道[13-15]，发现SOX基因的异常表达与胃肠道肿瘤的发生及进展有关，同时也发现胃癌中SOX7低表达可以激活Wnt/β-catenin信号通路，进而促进胃癌的侵袭和转移[16]。

综合以上因素，我们推测SOX7可能是HMGA2通过Wnt/β-catenin信号通路促进EMT的下游靶基因。

为了证实以上推测，本实验首先通过生物信息学软件（UCSC）预测分析了SOX基因的启动子区，并构建人SOX7基因启动子荧光素酶报告质粒，再将后者与HMGA2过表达质粒共转染293T细胞，利用荧光素酶报告基因观察HMGA2对SOX7基因启动子荧光素酶活性的影响，以验证HMGA2对SOX7基因的启动情况，为进一步研究HMGA2转录表达的调控机制提供必要的理论支持。

1.材料与方法

1.1材料

293T细胞（ATCC、Microbix公司，美国）；DH5a感受态细胞、PrimeSTAR、Taq酶、dNTP、琼脂糖凝胶DNA回收试剂盒以及DL2,000DNAMarker（Takara，日本）；1kbDNAladderMarker（Fermentas，美国）；pGL3-basic载体、双荧光素酶报告基因检测试剂盒（Promega公司，美国）；阳性克隆测序（美吉生物，上海）；无缝克隆试剂盒、pSB1435、pSB328以及pSB125（SunBio，上海）；限制性内切酶HindIII、NheI（NEB公司，美国）；DMEM和Opti-MEM（GIBCO，美国）；Lipo2000（Invitrogen公司，美国）；工具载体（上海生博）；PCR仪（AppliedBiosystems，美国）；HMGA2过表达质粒（pLV-UbC-HMGA2-IRES2-EGFP）已在本课题组前期研究中构建并能成功表达。

以上试剂盒及仪器的使用均按生产厂家提供的说明书操作。

1.2方法

1.2.1细胞培养和DNA提取

将贴壁培养的293T细胞处理成细胞悬液，按照试剂盒说明提取DNA，应用紫外/可见分光光度计测定产物在260nm处吸收值,得出总DNA的含量，并用1%琼脂糖凝胶电泳检测DNA纯度及完整性。

1.2.2载体线性化

用限制性内切酶HindⅢ和NheⅠ对pGL3-basic载体进行双酶切，使pGL3-basic载体线性化。

1.2.3SOX7启动子的PCR扩增和回收纯化

通过生物信息学方法（UCSC软件）分析并预测到SOX7基因启动子区，利用软件Primer5.0辅助设计针对SOX7基因启动子区（-1549～+79nt）的引物。

上游引物：

5’-CTCTTACGCGTGCTAGCCTTGCCGGGTCTTAGCCGT-3’；下游引物：

5’-CCGGAATGCCAAGCTTGGCCGCACGCGGGT-3’。

在PCR反应管中加入5×Buffer（withMg2+）10ul,dNTP（各2.5mM）4ul，上游Primer（10uM）1ul，下游Primer（10uM）1ul,Template1ul,PrimeSTAR0.5ul，ddH2O32.5ul。

反应条件：

98℃反应3min；98℃反应10sec，55℃反应15sec，72℃反应1.5min，72℃反应10min，共30个循环；4℃维持。

PCR产物于2%琼脂糖凝胶电泳并回收目的产物。

1.2.4连接和转化

分别取双酶切回收产物SOX7-promoterDNA（68ng/ul）6ul和pGL3-basic（160ng/ul）2ul,5×Buffer2ul,无缝克隆反应液15ul,ddH2O10ul,共35ul，22℃连接2h后，将35ul连接液与一支溶解后的DH5a感受态细胞（每管100µl，-80℃保存）混匀，冰上放置30min，再将管在42℃的恒温水浴锅中热激90秒后，快速转移到冰浴中，使细胞冷却2-3分钟；每管加900µlLB培养液，37℃摇床上温育1小时使细菌复苏；取适当量的转化菌液涂布于LB琼脂平板上（含表达载体相应的抗生素）；倒置平皿，于恒温培养箱中37℃培养16小时，平板上有克隆长出，挑取部分阳性克隆进行鉴定。

1.2.5阳性克隆鉴定、测序

挑取平板上长出的转化子重悬于10µlLB（Kan+抗性）培养液中，37℃、220r/min振摇混匀，从中取1µl做模板进行菌落PCR鉴定，于2%琼脂糖凝胶电泳，提取阳性克隆质粒作NheI和HindIII双酶切鉴定。

设计上游引物：

5’-CTAGCAAAATAGGCTGTCCC-3’；下游引物：

5’-CCTTATGCAGTTGCTCTCC-3’。

PCR鉴定反应体系：

10×Buffer（withMg2+）2ul,dNTP（各2.5mM）1.6ul，上游Primer（10uM）0.8ul，下游Primer（10uM）0.8ul,Template1ul,Taq酶0.1ul，ddH2O13.7ul。

反应条件：

94℃反应5min；94℃反应30sec，55℃反应30sec，72℃反应1.5min，共30个循环；72℃维持10min。

预期阳性克隆得到1833bp的片断，阴性克隆得到212bp的片断。

阳性克隆测序由上海美吉生物完成。

1.2.6HMGA2对SOX7启动子转录活性的影响

分别将SOX7基因启动子荧光素酶报告质粒（pGL3-basic-SOX7-promoter）、pGL3-basic-SOX7-promoter和对照质粒（pLV-UbC-IRES2-EGFP）、pGL3-basic-SOX7-promoter和HMGA2表达质粒（pLV-UbC-HMGA2-IRES2-EGFP）三组质粒共转染293T细胞，培养48小时后测荧光强度，检测三组荧光素酶的表达情况，观察HMGA2对SOX7基因启动子的调控作用。

luciferase活性检测方法如下：

质粒转染48小时后，弃去培养基，用1×PBS洗1遍；倾斜24孔板，吸干剩余的PBS；配制1×PLB。

使用前放到常温；每孔加100μl稀释好的1×PLB，摇床常温条件下摇15min，进行裂解；反复吹吸裂解好的细胞和PLB（操作时将孔板置于冰上）；白色不透光的96孔板中每孔加20μl预先混好的LARII和细胞裂解液上清2μl，加入水28μl，2s后测数据；每孔添加20μl预先混合好的Stop&GloReagent，静止2s后测数据。

1.2.7统计学方法

结果以均数±标准差（

±s）表示，采用SPSS17.0统计软件进行数据分析，P<0.05为差异有统计学意义。

2结果

2.1荧光素酶pGL3-basic载体线性化结果

将pGL3-basic载体经HindIII和NheI双酶切后，回收到4786bp大小的载体片段（图2-1）。

图2-1荧光素酶载体pGL3-basic线性化

2.2SOX7启动子扩增凝胶电泳结果

以293T细胞基因组DNA为模版，通过PCR扩增SOX7启动子片断，经琼脂糖凝胶电泳分析可见大小约1661bp的DNA片断，结果与预期的PCR产物大小一致（图2-2）。

图2-2SOX7-promoterPCR产物琼脂糖凝胶电泳图

2.3阳性克隆PCR鉴定结果

取菌落上的少许菌体作为模版进行PCR扩增，经电泳分析发现挑选的8个菌落均可见1833bp大小的阳性克隆片断，212bp大小的阴性克隆片断，初步可以判断本实验挑选的8个克隆均为阳性克隆（图2-3）。

图2-3阳性克隆PCR鉴定

2.4阳性克隆测序结果

测序结果发现，目的序列已经正确插入位点，有一个突变，且突变位点未位于HMGA2结合区域，无需修复（图2-4a，图2-4b）。

图2-4aSOX7启动子部分序列测序结果（起始50bp）

图2-4bSOX7启动子部分序列测序结果（末尾50bp）

2.5HMGA2过表达对SOX7启动子活性的影响

Luciferase检测结果显示，与对照组相比，HMGA2过表达后SOX7启动子

荧光素酶活性降低约31%，受到明显抑制。

因此，HMGA2过表达后可以明显降低SOX7启动子活性，差异显著（P<0.01，图2-5）。

图2-5HMGA2过表达对SOX7启动子活性的影响

3讨论

荧光素酶（Luciferase）报告基因系统是以荧光素（luciferin）为底物来检测萤

火虫荧光素酶（fireflyluciferase）活性的一种报告系统[17]。

荧光素酶是生物体在有氧气的情况下催化荧光素或者脂肪醛氧化而发光的一类酶，它可以催化荧光素氧化成氧化荧光素（oxyluciferin），同时在荧光素氧化的过程中，会发出生物荧光（bioluminescence），通过荧光测定仪可以测定氧化过程中释放的生物荧光的强度。

通过荧光素和荧光素酶这一生物发光体系，可以极其灵敏、高效地检测基因的表达。

报告基因是一种易于检测酶或蛋白质等表达产物的基因，其主要通过报告基因产物的表达来显示出目的基因的表达调控。

原理主要是通过把报告基因的编码序列与基因表达调节序列融合或者与其他目的基因融合形成重组基因，在调控序列控制下进行表达，从而通过报告基因表达产物的状况来标定目的基因的表达状况。

由于荧光素酶具有与底物结合特异性强、灵敏度高、发光易于检测，而且内源性低，检测时不受细胞内其他物质的影响等优点，已经被广泛应用于生物医学领域基因表达调控的研究中[17,18]。

研究发现，核转录因子HMGA2可以促进肿瘤细胞发生EMT，后者与肿瘤

的侵袭转移密切相关。

本课题组前期研究在验证HMGA2可以通过激活Wnt/β-catenin信号通路引起胃癌细胞发生EMT的同时，也采用ChIP技术从chip-on-chip芯片筛选出与胃癌细胞EMT相关的下游基因SOX7。

为了进一步验证HMGA2与其下游基因SOX7之间的调控关系，我们进行了人SOX7启动子荧光素酶报告基因的构建及HMGA2对SOX7调控的验证实验。

本实验首先采用PCR方法从人基因组中扩增出SOX7启动子相对于5’起始密码子上游的-1549～+79nt区，并将其克隆至荧光素酶报告载体pGL3-basic中，合成SOX7基因启动子荧光素酶报告质粒pGL3-basic-SOX7-promoter；再分别将pGL3-basic-SOX7-promoter、pGL3-basic-SOX7-promoter和对照质粒（pLV-UbC-IRES2-EGFP）、pGL3-basic-SOX7-promoter和HMGA2表达质粒（pLV-UbC-HMGA2-IRES2-EGFP）三组质粒共转染293T细胞，48小时后通过检测荧光素酶的强度，分析HMGA2对SOX7基因启动子的调控作用。

结果发现，HMGA2过表达后可以明显降低SOX7启动子介导的荧光素酶表达，进一步说明HMGA2可以通过抑制SOX7基因启动子的转录活性而起作用。

本研究成功构建了SOX7基因启动子荧光素酶报告质粒，并初步验证了HMGA2可以通过结合SOX7基因启动子调控SOX7的转录，为深入研究HMGA2在肿瘤发生发展中的作用提供了必要的实验依据。

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