黄瓜花叶病毒编码2b的基因抑制拟南芥Argonaute1裂解活性来抵抗植物的防御.docx

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黄瓜花叶病毒编码2b的基因抑制拟南芥Argonaute1裂解活性来抵抗植物的防御

黄瓜花叶病毒编码2b的基因抑制拟南芥Argonaute1裂解活性来抵抗植物的防御

原文出处：

ZhangX,YuanYR,PeiY,etal.Cucumbermosaicvirus-encoded2bsuppressorinhibitsArabidopsisArgonaute1cleavageactivitytocounterplantdefense[J].GenesDev.200620:

3255-3268

黄瓜花叶病毒编码2b的基因抑制

拟南芥Argonaute1裂解活性来抵抗植物的防御

RNA沉默是指RNA调控介导的微流程，抑制内源基因的表达，从而抵抗宿主病毒的侵害。

病毒编码抑制器作为一种抗宿主防御机制，可以阻止RNA沉默。

黄瓜花叶病毒（CMV）编码的2B蛋白是最先的抑制器，决定着抑制转录后基因沉默（PTGS），但很少或几乎不影响

miRNA的功能。

底层2b中抑制RNA沉默的机制是未知的。

在这里，我们证明CMV2B蛋白也能干扰miRNA的途径，引出发展异常部分表型模型AGO1突变的等位基因。

对比大多数抑制器的特征，2b与Argonaute1（AGO1）能在体外和体内直接相互作用，并且这种相互作用主要发生在AGO1表面的一个含PAZ的模块和PIWI—box的一部分。

与此相一致的作用还有在RISC重建试验中2B极大的抑制了AGO1裂解活性。

此外，AGO1新病毒—干扰RNA（siRNA）来源于体内，这表明AGO1是防御CMV感染的主要因素。

我们的结论是2B的AGO1活性通过抑制miRNA的途径，削弱RNA沉默，抵抗宿主防御。

这些发现从分子角度了解了宿主RNA沉默抗病毒的和病毒的自我反抗机制。

关键词：

病毒抑制;黄瓜花叶病毒2b蛋白;RNA沉默;AtAGO1;裂解活性;反防御

RNA沉默是指RNA介导的抑制基因表达的过程。

多种途径影响RNA沉默，但他们都有某些核新的生化特点。

RNA沉默启动通过RNA酶III型的Dicer酶与双链RNA（dsRNA）或不完全自我折叠发夹前体成小干扰RNA（siRNA）或miRNA双链体。

小RNA双链是之后掺入核糖核蛋白复合称为RNA诱导的沉默复合物（RISC），能降解互补的小RNA的任何RNA（巴特尔2004年;泊和赛摩2005）。

RISC复合物的核心组件是一个Argonaute（AGO）蛋白质，它具有PAZ结构域，提供了一个3'2核苷酸伸出来的口袋和PIWI域并赋予核酸内切酶活性（霍尔2005;宋Joshua-2006年TOR）。

在拟南芥中，AGO蛋白家族包含10个假定的部件（Fagard等人，2000），其中AGO1是最好的表征。

参与AGO1中RNA沉默最初由遗传分析揭露，因为强大的AGO1等位基因表现出严重miRNA积累缺陷，靶mRNA切割，和产生的发育异常（Vaucheret等人。

2004年）。

此外，AGO1突变体自发受损转基因的沉默（Fagard等人，2000），并过敏到黄瓜花叶病毒（CMV）（莫瑞尔等，2002）。

AGO1的生物学作用在RNA沉默中通过最近的两项生化研究被证明，同时证明AGO1裂解活性是在体外（鲍姆贝格尔2005年Baulcombe;齐等人。

2005年）。

RNA沉默可以在任一后生介导植物中或转录后水平的植物中。

转录后基因沉默（PTGS）的一个方面是主要miRNA表达途径减少内源性基因（琼斯罗兹等，2006），这需要DCL1和拟南芥里的AGO1功能。

另一个方面PTGS抵御外源核酸入侵主机（例如，转基因，病毒）通过siRNA的途径，涉及不同组RNA依赖性的RNA聚合酶（迪纳普农村服务组织），的DCL，AGOs，和其他组件（2005Voinnet）。

例如，PTGS感基因（S-PTGS）通过dsRNA触发，在SGS3的帮助下通过RDR6被从单链RNA（ssRNA）转换（2006Vaucheret）。

Virusinduced

基因沉默（VIGS）由双链RNA中间体引起复制病毒，RDR1-或RDR6介导形成的dsRNA，或高度结构化区的病毒RNA（Voinnet2005）。

作为适应性免疫系统VIGS允许细胞通过顺式作用的siRNA针对性的降解外源性病毒入侵者。

此外，VIGS还可以在未感染的细胞生成移动沉默信号（2004年Baulcombe;2005年Voinnet）。

因此，全身的植物感染需要通过特定有效机制病毒抑制宿主RNA沉默。

作为反战略，许多植物和动物病毒已经进化，在所述siRNA途径和在不同阶段很多情况下抑制蛋白质，从而阻断宿主RNA沉默以及miRNA的途径（Anandalakshmi等。

1998年;Brigneti等人。

1998年;Kasschau和卡林顿1998年;Chapman等。

2004年;Chen等人。

2004年;Dunoyer等人。

2004年;Mlotshwa等。

2005年）。

siRNA的抑制途径是伴随着siRNA的显著减少或完全消除。

拟南芥里miRNA的干扰途径与发育缺陷有联系，这部分phenocopiedAGO1基因突变体和突变体缺乏参与miRNA的生物合成和代谢（DCL1，HEN1和HYL1）。

沉默抑制的几种分子机制在研究中，其中至今最好的发现是tombusviralP19蛋白。

P19头到尾都由同型二聚体形成，能隔离siRNA双链和预防他们进入RISC（Vargason等人，2003;Ye等。

2003年）。

甜菜黄病毒和P1的P21/HC-Pro萝卜花叶病毒（芜菁花叶病毒）也类似（叶和005年帕特尔;拉卡托斯等。

2006年）。

研究提出FlockHouse病毒B2蛋白结合dsRNA和siRNA和siRNA的抑制形成（Chao等人。

2005年），和P38抑制DCL4活动（Deleris等。

2006年）。

CMV2b确定了是在前两个抑制器中，这可能抑制敏感-GFP基因PTGS（S-PTGS）（Brigneti等人，1998），对miRNA的功能很少或几乎没有影响（Chapman等人，2004年）。

就RNA沉默作用在CMV2b里的部位，我们调查其抑制机制。

我们发现，CMV2B还阻止miRNA诱发途径phenocopyingAGO1突变等位基因异常发育。

我们发现，CMV2b与AGO1直接互动并在RISC重建中抑制其裂解活性测定而且该AGO1募集病毒衍生的siRNA在体内。

这些结果表明，CMV2b的AGO1裂解活性能减弱RNA沉默并对抗宿主防御。

结果

CMV2b的抑制在拟南芥里会导致发育异常。

CMV编码的2B蛋白是在前两个抑制器中，确定了能抑制PTGS（Brigneti等人。

1998年），但CMV上miRNA的功能很少或没有影响（Chapman等人，2004年）。

考虑到来自温和应变的CMV（郭鼎2002）（Q株）2b抑制器先研究（Chapman等人，2004年），我们调查是否能从一个同源抑制器严重应变（FNY株）（佐和1990年Palukaitis）行为会不同。

CMV（FNY）感染在拟南芥中引起严重症状，包括发育迟缓，节间距离缩短，扭曲茎，和型花小，这些还无法考证（无公开数据）。

图1显示了FNY感染植物后2b蛋白变多，miRNA含量升高，比如为miR168、星链和目标的mRNA（图1A[面板的a，b]，B[顶板，泳道1-3]），表明对miRNA的途径有抑制作用。

因为与miRNA的干扰途径是许多病毒抑制器一种常见的特点（马洛里等人。

2002年;Kasschau等。

2003;Chapman等。

2004年;Dunoyer等。

2004年;Mlotshwa等。

2005年），我们推测感染植物的FNY分子机制可以归因于2b抑制器。

最后，我们从两个CMV里比较了转基因拟南芥植物表达转基因35S-CMV2B，FNY和QFNY2b还有Q2b蛋白有51％身份和62％相似的氨基酸序列（佐和Palukaitis1990;郭丁2002年）。

约80％（132104）初级转化的35S-FNY2b有轻重不一的发育异常（图1C）。

最严重的转基因株系（例如FNY2b-1）（图1C，面板D-F）叶子过细长、狭窄、锯齿、并严重向上卷曲。

线条的20％，叶子似乎已失去了它们极性扭曲的叶柄。

这些植物花卉都非常紧凑，狭窄的萼片和花瓣由间隙分开，并且大多不育。

大约有一半的花仍未开放，而剩余花的花粉缺乏花药。

线条较轻的株型（例如，FNY2b-3）显示锯齿，浅裂，或卷曲莲座叶，而因为植物的花朵含有短雄蕊，所以部分不育（图1C，板G-1）。

由FNY2b-5（图1C，面板J-1）表达线条轻度发育缺陷。

这些植物很茂盛，有轻微卷曲或其抚平莲座叶具有较强的锯齿。

他们的萼片和花瓣转头，有部分损失正面和背面的身份;而他们的心皮和雄蕊依然茂盛。

char-acteristicsphenocopiedago1-25和ago1-27，两个较弱AGO1突变等位基因形态（图1C，板M-O;羊肚菌等。

2002年;数据未显示）。

Northern和Westernblot分析表明，表型的严重相关程度和FNY2b表达水平（图1B）。

图1.CMV2B导致发育异常的拟南芥。

（A），CMV（FNY株）感染增强AGO1积累（图a）和miR168和miR168*（图b）。

样本采集7或12天接种后（DPI）。

仅缓冲液对照植物用处理（模拟）。

每条泳道下面的数字指对装载标准化后控制的相对于野生型的表达水平，（25S或5S种rRNA）。

在35S-FNY2b线和CMV（FNY株）（B）的FNY2b转录和蛋白水平感染的植物。

针对FNY2b多克隆抗体使用。

（顶板，泳道1-3）对于CMV的实验中，样品收集7或12dpi的。

转基因系数列在上面。

甲交叉反应带（星号）作为上样对照。

（C）形态的35S-FNY2b转基因株系的表型。

照片拍摄于4周龄的幼苗，他们的第四个真叶，和成人的花朵的WTCol-0中（图a-c）和代表性的35S-FNY2b线路（＃1，＃3，和＃5），和3周龄幼苗，第二片真叶时，与成人ago1-27花（板M-O）。

（面板D-F）35S-FNY2b-1。

（面板克-i）的35S-FNY2b-3。

（面板J-升）35S-FNY2b-5。

板：

板A，D，G，J，M，10毫米;板B，E，H，K，N，2毫米;面板c,f,i,l,o,1mm。

（D）的35S-FNY2b，一系列AGO1突变等位基因和WTCol-0中苗在的子叶期。

（图A）WTCOL-0。

（面板B，C）极其严重35S-FNY2b线，未展开的子叶。

（图D-F）35S-FNY-3，35S-FNY-4和，35S-FNY-5。

（图G-I）ago1-36，ago1-25和ago1-27。

板，3mm。

在T2或随后几代，在野生型（WT）里容易分辨表型异常的35S-FNY2b＃3-5和35S-FNY2b-8（图1D，板A，D-F）。

发芽后不久，＃3-5苗有窄和弯曲，或者杯形或者勺形，暗绿色phenocopyingAGO1突变的等位基因的子叶（图1D，面g-ⅰ）。

模仿ago1-1和其他严重的自生能力AGO1等位基因的突变，复筛的极重度的转化体与未膨胀的子叶里，35S-FNY2b初级转化取得〜10％，（图1D，板B，C），（Bohmert等人1998;Kidner和Martienssen2004;数据未显示）。

严重的35S-FNY2b线真叶出现后不久就死了。

在对比35S-FNY2b线，仅0.6％的35S-的Q2b转基因株系（七1208）表现出明显的发育异常（数据未显示）。

表型差异由FNY2b和Q2b表达引起，与他们的表达水平有关。

多数的35S-Q2b和35S-FNY2b有可比性的转录水平（图1B;补充图S1A），但只<5％的含有几乎检测不到Q2B蛋白质。

此外，大多数被检测的这些线的Q2b蛋白截断对比至少80％的35S-FNY2b，这表示全长FNY2b有较高水平（图1B;补充图。

S1A）。

避免两种蛋白质的抗体亲和力不同，我们调查了2b中蛋白在转基因植物里表达35S-FNY2b-3HA和35S-Q2b-3HA，Q2B-3HA90％的蛋白质出现截短，几乎检测不到，而FNY2b-3HA是完整而稳定的。

（图，S1B，C）。

miRNA的抑制和siRNA指导切割的mRNA靶病毒的表达使拟南芥发育异常

mRNA的表达与异常调节有关的抑制器有miRNA或靶向siRNA（Kasschau等人，2003;Chapman等，2004;Dunoyer等人。

2004年）。

我们比较了几个miRNA或siRNA指导的mRNA在CMV2b和WT之间表达水平的转基因植物。

植物表达P1/HC-能抑制芜菁花叶病毒（Mlotshwa等，2005）和ago1-27，AGO1的弱等位基因，作为对照（图2A）。

以前的报告确定NAC1，PHB，PHV，ARF8和AGO1分别为miR164，mir165，miR167和miR168的目标（Kidner和2004年Martienssen;Vaucheret等人。

2004年;过等。

2005年）。

图2A示出了所有的35S-FNY2b可区分的表型，积聚的这些miRNA制导mRNA的表达水平比类似的P1/HC-Pro的植物增强几倍或更高。

更多的NAC1积累和AGO1中ago1-27裂解活性的丧失（Vaucheret等人的AGO1转录。

2004年）。

DCL1报道显示，有全长形式（6.2kb），和其他两个短链（4.5〜含5-DCL1序列和2.5kb的kb基因的mRNA含有3'-DCL1序列），并且仅全长形式由MIR162（Xie等人，2003）的目标。

数字图2A表明，全长DCL1水平也上调2-3倍于35S-FNY2b植物（线路＃3-5），但不是在线路＃8。

At2g49770被引导内源性TA-siRNA480/255，一反式作用的siRNA其产生是通过分子调相发起另一种miRNA的指导初级转录切割的At2g27400（Allen等人，2005年）。

相对于目标miRNA的影响，35S-FNY2b的表达对At4g29770比的影响很小。

类似的分析表明35S-Q2b＃31和＃33，只有＃33（弱发育异常）的大量累积会引导目标miRNA（图2A）。

我们的结果表明CMV2b的在体内抑制mRNA的核酸内切裂解游离的RNA。

小RNA和RNA*S积累的微小改变

接下来我们研究了mRNA靶向小RNA的表达水平（图2B，C）的分析。

增加测试miRNA的积累，相比P1/HC-Pro的植物的情况不，TA-siRNA480/255在35SS-FNY2b植物（线＃3-5）中是不一样的。

其中

表达转基因35S-Q2b＃33中，miRNA（图2B）的水平稍微升高。

相反，野生拟南芥里，miRNAs与前导链siRNA、miRNA的*S和乘客链的siRNA（siRNA的*）的正常表达等于或低于小RNA的检测极限。

这大概是因为siRNA或miRNA*的乘客链是优先在RISC复合物中排除或迅速降解（琼斯罗兹等，2006）。

图2中，B和C显示所有测试的miRNA*s在增强积累，35S-FNY2b植物和35S-的Q2b＃33轻微的积累，如转基因植物中过表达发现的P1/HC-Pro，P19，和P21（图2B，C;查普曼等人。

2004年;Mlotshwa等。

2005年）。

要注意的是随从链TA-siRNA480/255积累程度更大，它的引导链的积累略有下降。

花序组织中获得类似的结果。

干扰CMV2b的miRNA途径与使用P19miRNA途径的干扰机制不同，CMV2b的干扰的miRNA途径通过从所使用的P19不同的机制。

一种miRNA*植物中表达沉默抑制子P19、P21和P1/HC-Pro异常积聚的解释是，这些蛋白质劫持和稳的miRNA/miRNA*双链体，防止其装载到RISC复合物。

为了研究CMV2b的股份这一战略，我们测试，如果这抑制结合的小分子RNA，装载到RISC复合物。

为了研究CMV2b的股份这一战略，我们测试，如果这抑制结合的小分子RNA。

而P19约束小双链RNA，纯化重组FNY2b和绑定的Q2b既不是单链（SS）siRNA也不是在体外的siRNA双链体（图3A，和中间图）。

同样，CMV2b中，不像不结合SS的mRNAHYL1和HC-Pro（图3A，右图）。

图2，积累小RNA和它们的链和靶mRNA在转基因拟南芥植物表达CMV2B。

（A）的高分子量RNA的RNA印迹分析。

转基因系数列在上面。

印迹杂交用表示基因特异性探针。

阿非小RNA的目标mRNA（At2g24430）用作上样对照。

（B，C），低molecular-重量RNA印迹。

重复印迹杂交到寡核苷酸探针互补的小RNA，和它们的星股线表示。

在A-C各自泳道下面的数字是指相对于野生型的表达水平，对归一化后装载控制。

对于DCL1在A，只有全长成绩单（~6.2KB）由MIR162有针对性的，它的积累水平计算并显示如下。

进一步调查显示，如果2B阻止miRNA进入RISC，我们创建了双转基因植物表达35S-FNY2b在Flag-AGO1/ago1-36的背景下。

图3B示出了小RNA被容易地装入在RISC复合相比FNY2b表达的植物的WT。

此外，miR165*/miR165的免疫沉淀比率相比源自的转基因植物高（图3C）。

2B与AGO1在体内相互作用

干扰小RNA引导mRNA的核内切，但不与上游通路小RNA/小分子RNA*使我们

图3.CMV2b中由一个机构抑制RNA沉默不同于使用的P19。

（A）的SS和DS的siRNA绑定和ss的mRNA体外。

使用本机配合进行了分析页。

miRNA的和miRNA*（B）分析2bexpressing的RISC植物。

RNA是从花或升旗提取转基因植物的AGO1免疫沉淀（两个独立线，＃1和＃10）在一个携带35S-FNY2b旗AGO1/ago1-36背景（鲍​​姆贝格尔和2005年Baulcombe）和旗AGO1/ago1-36控制装置（旗AGO1/ago1-36）。

对于中间的面板，每个泳道含有与相关小RNA旗AGO10.2克花免疫沉淀。

（底部面板）输入和旗AGO1的免疫沉淀和FNY2b通过在相同的Western印迹测定法分析样品小RNA印迹。

甲交叉反应带（*）被用来作为上样对照。

（℃）miR165*的相对比率和miR165在旗AGO1免疫沉淀的增加35S-FNY2b过表达株系与那些从比较对照植物。

miR165*和miR165的平均信号值在35S-FNY2b水平计算相对于对照植物（旗AGO1/ago1-36），这里的比例任意分配1.标准误差值代表至少四个实验。

张等人。

3260基因与发育从genesdev.cshlp.org下载的2010年10月29日-发布冷泉港实验室出版社。

推测这种现象CMV2b可以抑制RISC的活性。

要检查是否有CMV2b和AGO1之间的互动，我们瞬时表达35S-6myc-AGO1以及35S-FNY2b-3HA或其他烟草控制蛋白质本塞姆氏。

图4A显示了抗体对6myc-AGO1特别是免疫共沉淀FNY2b-3HA，但不与P1/HC-Pro中，P19和P69中，所有这些都是标记3HA在它们的C-末端。

类似coimmuno-沉淀实验表明，FNY2b-3HA做不与6myc标记SDE3，SGS3和RDR6互动，所有这些都起到PTGS途径的作用，也有两个其他控制蛋白，ABI3（Zhang等人，2005年）和GFP（图4B）。

类似的互动结果与获得Q2B-3HA。

FNY2b之间特异性相互作用AGO1是由他们共定位进一步证实当共表达细胞核和细胞质灶本塞姆氏细胞（补充图S2）。

接下来，我们调查FNY2b/AGO1互动是否在拟南芥线窝藏35S-FNY-3HA和XVE-6myc-AGO1同样使用双转基因发生。

6myc-AGO1的诱导表达，抗体6myc-AGO1能免疫共沉淀FNY2b-3HA，但无法控制的蛋白质，如PHYB和一个交叉反应蛋白（图4C）。

此外，在感染了CMV（FNY）Flag-AGO1/ago1-36的2b病毒中（图4D，中图），但它的外套蛋白质不被FlagAGO1共免疫沉淀（图4D，底部面板）（图4D，上图），也表示特定FNY2b-AGO1的相互作用（图4D）。

图4.CMV2b的特定相互作用和AGO1体内。

（A，B），免疫共沉淀FNY2b和AGO1的瞬时表达在烟草本塞姆氏。

蛋白质是标签或者与6myc或3HA。

总粗蛋白提取物（输入）进行免疫沉淀（IP）与多克隆抗体以myc基因或MBP。

蛋白质印迹分析用的单克隆抗体myc基因到检测myc基因标记的蛋白（上图），和的单克隆抗体的HA以检测免疫共沉淀HA-标记的蛋白（下图）。

箭头（'）指示瞬时表达的蛋白质。

（C）的相互作用FNY2b和AGO1蛋白的拟南芥植物。

二周龄苗表达35FNY2b-3HA/XVE-1-6myc-AGO1分别与处理过夜50μMMG132在不存在（lanes1,3）或的$雌二醇存在（泳道2,4,5）（25μM）诱导6myc-AGO1表达。

总蛋白质提取物进行免疫沉淀（IP）的多克隆抗体myc基因或MBP。

西方的印迹与分​​析单克隆抗体myc基因检测6myc-AGO1（顶面板），和单克隆抗体HA来检测免疫共沉淀FNY2b-3HA（底部面板）。

种单克隆抗体PHYB用作负控制来检测PHYB的存在。

（D）的CMV-2b的编码抑制器被结合到在拟南芥中AGO1复杂在病毒感染的植物。

在开花期旗AGO1/ago1-36厂均采用缓冲区只（模拟）或感染CMVFNY应变。

蛋白提取物共有来自鲜花免疫沉淀（IP）与单克隆抗体标志。

蛋白质印迹用相同的抗体，以检测旗AGO1（顶面板），和多克隆抗体来FNY2b以检测共免疫沉淀进行分析FNY2b（中图）。

多克隆抗体对CMV的CP被用作阴性对照，以检测涂层的存在蛋白。

（A-D）在所有的面板，一个星号（*）表示交叉反应带中的输入级分，其作为阴性对照，因为这是不存在在IP级分。

双星号（**）表示蛋白A缀合的抗体的重链或轻链。

CMV2b中抑制AGO1介导的裂解。

CMV2B直接绑定到体外一个含PAZ模块的AGO1表面

如果FNY2b和AGO1直接或间接互动，我们可以在体外用下拉测定法测定检查各种纯化的蛋白。

图5A示出了maltose-binding蛋白（MBP）-AGO1，但不是MBP和MBP-AIP2（ABI3相互作用蛋白2），是能拉下6His-SUMO-FNY2b的。

本互动是特定的MBP-AGO1无法拉下其它控制蛋白质（图5B）。

进一步定义负责的特异性相互作用的蛋白质结构域，我们生成8个截短突变体AGO1（图5C，面板A，B）。

下拉分析表明，一个AGO1NT（氨基酸1-567）截短突变体与高亲和力下FNY2b相互作用，和一个AGO1CT（氨基酸533-1048）截短突变体在体外降低的亲和力与FNY2b相互作用，与免疫共沉淀的体内结果是一致的（图4B）。

ATAGO1，AaAGO和PfAGO序列分析比对，与IAGO和PfAGO的结构分析起来，发现AGO1（185-371）和AGO1（366-567）对应于一个AGOS的表面含PAZ模块的小RNA和它的靶mRNA结合槽，而AGO1（829-1048）对应于AGOS的PIWI盒。

总的来说，我们的结果表明，CMV2b中与AGO1上含PAZ所述的表面相互作用模块的RNA结合槽和部分PIWI盒（图5C，面板C，D）。

图5.CMV2B直接与AGO1的相互作用体外。

（一）在体外拉下来的6His-SUMO-测定，FNY2b具有三个诱饵蛋白：

MBP（M），MBP-AIP2（Al），和MBP-AGO1（AG）。

（左面板）的示意图，三诱饵蛋白。

（中图）的输入诱饵蛋白。

（右面板）的输入和输出的6His-