氨氧化菌的分离及其氨氧化条件优化毕业作品.docx

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氨氧化菌的分离及其氨氧化条件优化毕业作品

毕-设

业-计

（20__届）

氨氧化菌的分离及其氨氧化条件优化

所在学院

专业班级生物工程

学生姓名学号

指导教师职称

完成日期年月

目　录

摘要：

从舟山近海南美白对虾养殖池塘底泥样品中筛选到一株具有氨氧化功能的细菌，命名为AOB-1。

菌株AOB-1好氧，革兰氏阴性，球状；菌落呈淡黄色、干燥、针尖状。

16SrDNA序列分析表明，该菌株与NitrosomonaseutrophaC91T的相似性为100%，氨氧化功能基因-氨单加氧酶（amoA）比对也表明，该菌株与NitrosomonaseutrophaC91T的相似性为98%。

在30℃，100r/min时，25mL-200mL培养基装量范围内装液量越少氨氧化率越高；最适pH值为8，pH值大于或小于8时，氨氧化效率都明显受影响；氨氮浓度在1mg/L-200mg/L的范围内，氨氧化速率随氨浓度的升高而加快，在200mg/L-1200mg/L的范围内氨氧化速率基本保持不变，但当氨氮浓度高达2000mg/L时，其活性受到明显的抑制。

因此，AOB-1菌株不仅对养殖水体，而且对高浓度氨氮废水的处理也具有潜在的应用价值。

关键词：

氨氧化细菌；亚硝化单胞菌；鉴定；氨单加氧酶基因

Abstract:

Astrainofammoniaoxidizingbacterial,AOB-1,wasisolatedfromthesedimentofcoastalPenaeusvannameirearingpondinZhouShan,ZhejiangProvince.Itisaerobic,gram-negative,spherical;andthesinglecolonyislightyellow,dryandneedletip-like.Its16SrRNAgeneshows100%similaritywiththatofNitrosomonaseutrophaC91Tanditis98%similarwithNitrosomonaseutrophaC91Tinammoniamonooxygenase（amoA）.Ammoniaoxidationrateishigherwithmoremediainflasksintherangeof25mL-200mLmediaat30℃,100r/min.TheoptimumpHis8forammoniaoxidation.Therateofammoniaoxidationrisedwiththeincreaseofammoniumconcentrationintherageof1mg/L-200mg/L,remainedsameintherageof200mg/L-1200mg/L,andwassignificantlyinhibitedwhentheammoniaconcentrationupto2000mg/L.Therefore,strainAOB-1isnotonlyusefulinthetreatingofaquaculturewastewater,butalsohasthepotentialapplicationinthefieldofindustrialwastewaterwhichhashighammoniumconcentration.

Keywords:

Ammoniaoxidizingbacteria;Nitrosomonas;Identification;Ammoniamonooxygenase.

1引言

随着我国经济的迅速发展和城市化进程的加快，大量的工农业废水、生活废水排入天然水体中，造成水体富营养化速度加快，污染现象严重。

根据环境监测总站的报道，我国大部分地表水和城市河道受到了不同程度的污染，氮素污染是引起水体污染的重要原因之一，而氮素废水的超标排放是水体富营养化的主要原因。

水体的富营养化对人体的健康和水中生物都是非常有害的，因此去除废水中的氮素显得尤为重要。

氮主要以NH4+、NO2—、NO3—等形式对水体造成污染，对氮素污染的治理方法有很多，而最经济且对环境友好的方法当推生物脱氮了。

传统生物脱氮是由好氧条件下的硝化作用与厌氧条件下的反硝化作用完成的。

由于生物脱氮技术在很多方面都有无可比拟的优势，如可操作性强、投资少、见效快、无二次污染、废水达标排放可靠性强等优点，所以目前对废水中氮素的处理主要采用生物脱氮法。

而生物脱氮法主要受脱氮菌剂的活性、温度、pH和DO等因素的影响，其中脱氮菌剂是最重要的影响因子，它直接决定了生物脱氮作用的强度和代谢反应的特征。

而氨氧化菌的氨氧化能力是去除氨氮的主要因素，因此选育高效的氨氧化菌株，并研究其氨氧化作用的最佳条件，对于应用生物脱氮法去除氨氮具有重要的意义。

随着集约化和工厂养殖的发展，养殖水体中出现氨积累现象，对养殖动物产生毒害作用，严重时会造成大批死亡[1-4]。

因此，养殖水体中的氨浓度的控制成为高密度养殖的一个重要环节。

控制措施之一就是施用硝化细菌，将氨氧化成亚硝酸盐，然后再进一步氧化成对养殖动物无害的硝酸[5-6]。

高效的氨氧化菌和亚硝酸氧化菌的筛选和配伍是调控水体氨氮浓度的关键。

目前较常用的氨氧化菌属于化能自养细菌，生长十分缓慢，采用传统的细菌分离培养分析检测法研究AOB相当费时、繁琐[7-8]。

我们经过一年的时间，从舟山南美白对虾海水养殖池塘底泥样品中分离纯化得到一株具有较高氨氧化活性的菌株，通过16SrDNA和amoA功能基因序列比对对该菌株进行了鉴定，研究了其氨氧化特性。

氮素污染是引起水体富营养化的重要原因之一，因此污水的脱氮处理对于维持水体清洁以及防止富营养化都具有重要的作用，硝化-反硝化的工艺路线是目前废水脱氮处理的最主要工艺路线，该工艺的技术核心是硝化作用，其效率的高低往往决定着整个处理系统效率的高低[41]。

硝化作用中的氨氧化细菌可以将水体中的氨氮转为亚硝酸盐，再结合反硝化细菌转化为氮气溢出水体完成脱氮。

其中氨氧化细菌包括亚硝酸叶菌属（Nitrosolobus）、亚硝酸球菌属（Nitrosoccus）、亚硝酸螺菌属（Nitrosospira）和亚硝酸单孢菌属（Nitrosomonas）等。

一般将氨氧化细菌归为硝化杆菌科。

近年在硝化细菌系统发育研究中,基于16SrRNA寡聚核苷酸的序列比较分析最先为硝化细菌的系统发育多样性提供了框架。

自养亚硝化细菌为硝化杆菌科的两个生理亚群之一,在自然界氮循环链中起重要作用,能将氨态氮转化为亚硝酸盐氮,并从该氧化过程中获得能量,同化无机碳化合物如CO32-、HCO3-和CO2[5-8],合成细胞物质。

在细菌系统发育图谱中根据16SrDNA序列同源性分析[9-10],把亚硝化细菌生理亚群中的亚硝化单胞菌属归为紫色细菌群（Proteobacteria）的B亚群。

其它基于16SrDNA序列同源性分析或氨单加氧酶（Ammoniamonooxygenase,AMO）序列分析进行系统发育关系的研究表明,除海洋亚硝化球菌（Nitrosococcusoceanus）和嗜盐亚硝化球菌（Nitrosococcushalophilus）为紫色细菌群的C亚群（Gammasubdivisionorgammasubclass）外,亚硝化细菌各属构成紫色细菌群B亚群。

一般亚硝化细菌的最适酸碱度是从中性趋于弱碱性的区段。

亚硝化细菌的培养温度因菌源而异,范围较宽。

从中温环境下分离的菌株,最适生长温度为26-28℃,从高温环境下分离的菌株,40℃下生长良好。

一般亚硝化细菌最佳生长温度为35℃,亚硝化单胞菌在30-36℃生长最好。

欧洲亚硝化单胞菌（Nitrosomonaseuropaea）是研究得最详细的典型自养型氨氧化细菌。

除了亚硝化单胞菌属（Nitrosomonas）外,其它能把氨氧化成亚硝酸的细菌属包括亚硝化螺菌属（Nitrosospira）、亚硝化球菌属（Nitrosococcus）、亚硝化弧菌属（Nitrosovibrio）、亚硝化叶菌属（Nitrosolobus）、亚硝化胶团菌属（Nitrosogloea）、亚硝化囊菌属（Nitrosocystis）。

土壤生境中常见的是亚硝化单胞菌属、亚硝化球菌属、亚硝化叶菌属、硝化螺菌属。

海洋生境中常见的是亚硝化单胞菌属、亚硝化球菌属、亚硝化螺菌属。

盐湖生境中则有亚硝化单胞菌属。

自养硝化作用在自然界生物硝化过程中占主导地位,但在某些环境中,真菌、放线菌、异养细菌等异养硝化微生物进行化能有机营养,能将氨、羟胺或有机氮化合物如肟等氧化成亚硝酸和硝酸。

实际上,一个世纪以前就有关于异养硝化微生物及其异养硝化作用的报道,近几十年研究者相继不同类型生境发现和分离了多种具有硝化活性的异养微生物（包括细菌、放线菌、真菌）。

其中,异养硝化细菌有反硝化假单胞菌、铜绿假单胞菌、荧光假单胞菌、产碱杆菌、节杆菌、粪产碱菌、PB16假单胞菌以及一些新发现的菌种（或属）。

氨氧化细菌是化能自养细菌，具有繁殖速率慢，世代周期长等特点，因此在污水处理中要保持硝化细菌的较好生长，需要较长的时间，难以高效地应用。

本章的研究内容包括了氨氧化活性影响因子分析，氨氧化活力维持，了解其生长状况，为水体富营养化中氮素的去除提供了数据支持。

2材料与方法

3样品来源

舟山近海南美白对虾高位养殖池塘表层底泥。

3.1培养基、试剂及使用方法

a.富集培养基

硫酸铵（NH4）2SO40.30g

磷酸二氢钠NaH2PO40.25g

硫酸镁MgSO4•7H2O0.01g

磷酸氢二钾K2HPO40.75g

硫酸锰MnSO40.03g

碳酸钙CaCO35.00g

蒸馏水H2O1.00L

pH＝7.5

纯化培养基：

硫酸铵（NH4）2SO40.30g

磷酸二氢钠NaH2PO40.25g

硫酸镁MgSO4•7H2O0.01g

磷酸氢二钾K2HPO40.75g

硫酸锰MnSO40.03g

碳酸钙CaCO35.00g

蒸馏水H2O1.00L

纯化琼脂15.00g

pH=7.5

b.试剂：

（1）GriessI：

磺铵酸0.5g加入150mL30%的醋酸中。

（2）GriessII：

0.5ga-萘铵加入50mL水沸后加入150mL30%的醋酸。

（3）NaOH溶液：

1mol/L。

（4）HCl溶液：

1mol/L。

（5）对氨基苯磺酰胺（NH2SO2C6H4NH2）溶液

称取5.0g对氨基苯磺酰胺溶于350mL1:

6（V:

V）盐酸中，用蒸馏水稀释至500cm3，储于棕色瓶中。

有效期2个月。

（6）二盐酸-1-奈乙二胺（C10H7NHCH2CH2NH2·2HCl）溶液（ρ=1.0g/dm3）

称取0.5g二盐酸-1-奈乙二胺，用少量蒸馏水溶解后，稀释至500mL，储于棕色试剂瓶中，低温保存（如出现棕色时应重配）。

（7）溴酸钾-溴化钾氧化剂贮备溶液

称取2.8g溴酸钾（KBrO3）和20.0g溴化钾（KBr）溶于1000mL无氨蒸馏水中低温保存，此溶液有效期一年。

（8）次溴酸钠氧化剂使用溶液

吸取溴酸钾-溴化钾氧化剂贮备溶液1.0cm3于棕色瓶中，加入49mL蒸馏水，加入3.0mL1:

1（V/V）盐酸，迅速盖上瓶盖，混匀，置于暗处5min，加入50mL氢氧化钠溶液（ρ=400g/L），混匀。

此溶液在35℃以下可稳定8h，临用前配置。

（9）氨标准贮备溶液

称取0.5349g一级氯化铵（NH4Cl，预先在100℃烘1h，置于干燥器内冷却），用少量蒸馏水溶解后，转移至1000mL量瓶中，稀释至标线，加1.0mL三氯甲烷，混匀。

此溶液1.00mL含10.00μmolNH3-N冷藏，有效期6个月。

（10）氨标准使用溶液

吸取1.00mL氨标准贮备溶液于200mL容量瓶中，稀释至标线，混匀。

此溶液1.00mL含0.0500μmolNH3-N，当天有效。

（11）显色剂（水杨酸-酒石酸钾钠溶液）

称取50g水杨酸[C6H4（OH）COOH]，加入约100mL水，再加入160mL氢氧化钠溶液（2mol/L），搅拌使之完全溶解；再称取50g酒石酸钾钠（KNaC4H6O6·4H2O），溶于水中，与上述溶液合并移入1000mL容量瓶中，加水稀释至标线。

贮存于加橡胶塞的棕色玻璃瓶中，此溶液可稳定1个月。

（12）次氯酸钠使用液，ρ（有效氯）=3.5g/L，c（游离碱）=0.75mol/L

取经标定的次氯酸钠，用水和氢氧化钠溶液（2mol/L）稀释成含有效氯浓度3.5g/L，游离碱浓度0.75mol/L（以NaOH计）的次氯酸钠使用液，存放于棕色滴瓶中，本试剂可稳定一个月。

（13）亚硝基铁氰化钠溶液，ρ=10g/L

称取0.1g亚硝基铁氰化钠{Na2[Fe（CN）5NO]·2H2O}置于10mL具塞比色管中，加水至标线。

本试剂可稳定一个月。

（14）酒石酸钾钠溶液，ρ=500g/L

称取50.0g酒石酸钾钠（KNaC4H6O6·4H2O）溶于100mL水中，加热煮沸以驱除氨，充分冷却后稀释至100mL。

c.DNA提取方法（传统法）：

（1）1.5mlEP管收集菌体8000r/min,5min,（10000r/min,2min）,收好的菌体可置于-20度保存，把培养基吸干。

（2）加1*TEpH=8.0500ul混匀弹匀

（3）加入20ul溶菌酶（50mg/ml）至终浓度为2mg/L上下轻轻摇匀（破壁）,置于37℃热水中观察粘稠度的变化每3-5min摇一次约30-40min

（4）加20%SDS57.8ul至终浓度为2%,60℃水浴约20min（时间可以自己掌握）至透明每5-10min摇一次.观察粘稠度增加则破壁效果好.

（5）加入等体积（578ul）的酚:

氯仿:

异戊醇（V比25:

24:

1）混匀萃取上下颠倒至乳浊状

（6）4℃12000r/min离心10min

（7）用剪子剪去尖端的枪头吸取上清夜至另一EP管中（DNA溶于上层水相中）加入与上清夜等体积的酚:

氯仿:

异戊醇,混匀

（8）12000r/min离心10min

重复5-6步至蛋白除去较完全

（9）去上清夜加等体积的氯仿:

异戊醇（24:

1）混匀至乳浊状12000r/min离心10min

（10）取上清夜,加3mol/L醋酸钠1/20体积:

即15ul,再加入预冷的异戊醇（2倍体积）600ul或（100乙醇）轻轻混匀，4℃12000r/min离心10min

（11）离心后轻轻倒掉溶液,DNA贴在管壁上,倒扣于纸上吸干加70%酒精离心8min（洗脱）

（12）倒去溶液,风干,待管内酒精完全风干时（若未风干则点样时会漂样）,加相应体积的纯水或1×TE溶解DNA

3.2氨氧化细菌的富集与分离

取养殖池塘表层底泥样品10g接于内装100mL培养基的250mL三角瓶中，在30℃，100r/min摇床中培养，并采用格里斯试剂检验NO2−是否生成，确定所富集细菌是否具有氨氧化功能。

当格里斯试剂的显色反应呈现阳性时，按1%接种量将富集液转接到新的培养基中继续富集，一般转接一次需要10天。

如此重复多次。

取最后一次转接的富集培养液，梯度稀释，涂布琼脂平板，平板用封口膜封住，于30℃的培养箱中培养至菌落出现。

取30-300个菌落的平板，无菌条件下挑取所有单菌落接于装有氨氧化细菌液体培养基的试管内，于30℃、100r/min转速条件下培养。

测定氨氧化能力，选取氨氧化能力最强的菌株作为研究的出发菌株。

3.3菌株的鉴定

将纯化菌株进行革兰氏染色[12]，用光学显微镜观察细胞形态、大小。

按LemarchandK.等的方法提取细菌DNA[18]。

利用特异性引物对amoA-F和amoA-R扩增氨氧化过程的关键酶—氨单加氧酶基因[19]，同时，用引物对27F和1541R扩增16SrDNA。

产物送上海生工测序，测序结果在NCBI上BLAST进行比对分析。

3.4氨氧化活性影响因子分析

3.4.1溶氧量

往250mL三角瓶中分别装入体积为25、50、100、200mL的液体培养基，其中NH4+-N浓度均为100mg/L，pH为7.2，按照1%的接种量加入AOB-1种子液（30℃,100r/min培养7天，MPN计数法得到氨氧化细菌的菌数约为6.4×106个/mL，下同），在30℃条件下100r/min摇床培养。

3.4.2pH值

分别配制起始pH值分别为5、6、7、8、9、10的培养基，其中NH4+-N浓度均为100mg/L，各分装100mL入250mL三角摇瓶中，接种1mLAOB-1种子液，在30℃条件下100r/min摇床培养。

3.4.3起始氨氮浓度

在保持培养基其他营养盐不变的情况下，分别配置NH4+-N浓度为1、10、50、100、200、300、400、800、1200、2000mg/L的培养基，调节pH值为7.2。

往装有100mL培养基的三角摇瓶里分别接种AOB-1种子液1mL，在30℃条件下100r/min摇床培养。

3.5分析方法

亚硝酸盐：

N-（1-奈基）-乙二胺光度法[27]；氨氮：

次溴酸钠氧化法[28]；细菌计数：

MPN计数法[29]。

4结果与讨论

4.1菌株的鉴定

4.1.1菌落菌体形态鉴定

经8次富集后，将富集液涂布于平板，初筛得到6个阳性菌株，试管复筛中得到一株氨氧化能力最强的菌株，命名为AOB-1。

菌落呈白色小圆点状，菌落中间逐渐呈淡黄色，直径1mm左右，边缘不光滑，且不易挑取。

显微镜油镜观察，如图1，菌体大小0.6-0.8μm×1.0-1.6μm，革兰氏阴性，菌体为椭球状，好氧，液体培养物容易形成絮状物。

图1菌株AOB-1油镜下照片

Fig.1ThepictureofAOB-1underoilimmersionlens

4.1.2分子鉴定

3.1.2.1功能基因鉴定

用引物对amoA-F和amoA-R扩增菌株AOB-1的功能基因组DNA，得到一个近500bp的片段（如图2），与预期的氨单加氧酶基因片段491bp相符，进一步将该片段的测序结果在NCBI上BLAST比对，发现与NitromonaseutrophaC91T的氨单加氧酶序列（AJ298713）相似性为98%（如表1）。

图2菌株AOB-1氨单加氧酶的PCR产物凝胶电泳图

Fig.2ThegelelectrophoresisofammoniamonooxygenasePCRproductofstrainAOB-1

注：

M：

marker；泳道1-3：

分别为模板DNA原液、稀释10倍、稀释100倍的PCR产物

3.1.2.216srDNA鉴定

将菌株AOB-1的16SrDNA扩增产物的测序结果（ATCGAAAAACTGCGGCTGTTTAAATTCAGTCGACGGCAGCGGGGGCTTCGCGCCCGCCGGCGAGTGGCGAACGGGTGAGTAATACATCGGAACGTGTCCTTAAGTGGGGAATAACGCATCGAAAGATGTGCTAATACCGCATATCTCTCAGGAGGAAAGCAGGGGATCGAAAGACCTTGCGCTAAAGGAGCGGCTGATGTCTGATTAGCTAGTTGGTGGGGTAAAGGCTTACCAAGGCAACGATCAGTAGCTGGTCTGAGAGGACGACCAGCCACACTGGGACTGAGACACGGCCCAGACTCCTACGGGAGGCAGCAGTGGGGAATTTTGGACAATGGGCGAAAGCCTGATCCAGCCATGCCGCGTGAGTGAAGAAGGCCTTCGGGTTGTAAAGCTCTTTTAGTCGGAAAGAAAGAGTCATAGTAAATAGCTATGATTTATGACGGTACCGACAGAAAAAGCACCGGCTAACTACGTGCCAGCAGCCGCGGTAATACGTAGGGTGCGAGCGTTAATCGGAATTACTGGGCGTAAAGGGTGCGCAGGCGGCCTTGTAAGTCAGATGTGAAAGCCCCGGGCTTAACCTGGGAATTGCGTTTGAAACTACAAAGCTAGAGTGCAGCAGAGGGGAGTGGAATTCCATGTGTAGCAGTGAAATGCGTAGAGATGTGGAAGAACACCGATGGCGAAGGCAGCTCCCTGGGTTGACACTGACGCTCATGCACGAAAGCGTGGGGAGCAAACAGGATTAGATACCCTGGTAGTCCACGCCCTAAACTATGTCAACTAGTTGTCGGATCTAATTAAGGATTTGGTAACGTAGCTAACGCGTGAAGTTGACCGCCTGGGGAGTACGATCGCAAGATTAAAACTCAAAGGATTTGACGGGGACCCGCACAAGCGGTGGGTTATGTGGGATAATTCCGATGCAACGCGAAAACCTTACCCTACCCTGACCTGCTTGGGATCCAATGGAGAACTAAGACTGGCCCAAAGGGACTCAGACACAG）在NCBI上BLAST比对，发现与NitromonaseutrophaC91T的16SrDNA（AY123795）相似性为100%（如表1），故菌株AOB-1的分子鉴定结果为Nitromonaseutropha。

表1AOB-2NCBI数据库比对结果表

Table1thecomparisonresultsonNCBIdatabaseofAOB-2

基因

amoA

16srDNA

与Nitromonaseutropha相似度（%）

98

100

3.1.2.3AOB菌株分类学地位

图3.16srDNA细菌系统发育树

Fig.216srDNAbacteriasystemgrowthtrees

图3用贝叶斯分析法构建。

数值展示了进化枝分配可能性的百分比。

本文中获得的氨氧化菌株AOB-1，用方框标明。

分析分析中用到了16种氨氧化细菌菌株16srDNA序列。

分类地位如下：

phylum"Proteobacteria"

classBetaproteobacteria

orderNitrosomonadales

familyNitrosomonadaceae

genusNitrosomonas

specieseutropha

4.2菌株AOB-1氨氧化活性研究

4.2.1溶氧量

图4溶氧量对菌株AOB-1氨氧化速率的影响

Fig.4Effectofdissolvedoxygenonammoni