基因工程原理教案.docx

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基因工程原理教案

《基因工程原理》教案

（二O一二年修订稿）

安徽大学生命科学学院

第一章绪论

重点：

基因工程的概念和内容，基因工程技术在现代生物技术中的地位和作用。

难点：

基因工程与遗传工程的区别。

（一）前言

生物工程主要有基因工程、细胞工程、酶工程、发酵工程等4个部分。

（二）什么是基因、基因工程

应用酶学的方法，在体外将目的基因与载体DNA结合成一具有自我复制能力的DNA分子（复制子、重组体），继而通过转化或转染宿主细胞、筛选出含有目的基因的转化子细胞，再进行扩增、提取获得大量同一DNA分子拷贝或其表达产物。

（三）基因工程的主要内容

⏹目的基因的制备

⏹载体的选择和制备

⏹DNA分子的体外连接

⏹将外源DNA导入宿主细胞

⏹目的基因的筛选和鉴定

（四）基因工程的历史及我国开展基因工程的现状

第二章基因工程的基本操作技术

重点：

PCR技术和基因定点诱变技术。

包括PCR技术的原理，反向PCR与染色体步移，不对称PCR与DNA序列测定，PCR与RAPD，RT-PCR与RNA分析；基因定点诱变的原理，盒式诱变，寡核苷酸引物诱变和PCR诱变。

难点：

酶学测序的原理和程序，基因化学合成的原理和程序。

（一）凝胶电泳技术

在生理条件下，核酸分子中的磷酸基团是离子化的，所以DNA和RNA实际上呈多聚阴离子状态（Polyanions）。

将DNA、RNA放到电场中，它就会由负极→正极移动。

Ø琼脂糖凝胶电泳

Ø聚丙烯酰胺凝胶电泳

Ø脉冲场凝胶电泳

ØRNA电泳

（二）细菌转化技术

▪转化作用就是一种基因型细胞（感受态细菌）从周围介质中吸收来自另一种基因型细胞的DNA,进而使原来细胞的遗传基因和遗传性发生相应变化的现象。

▪提供转化DNA的菌株叫做供体菌株，而接受转化DNA的寄主菌株则称做受体菌株。

常见转化方法有原生质体转化法；化学转化法；电穿孔法

（三）核酸杂交技术

▪所依据的原理是，带有互补的特定核苷酸序列的单链DNA或RNA，当它们混合在一起时，其相应的同源区段将会退火形成双链的结构。

▪Southernblot；Northernblotting；斑点印迹杂交和狭线印迹杂交；菌落原位杂交

注意比较

（四）DNA序列分析技术

（四）DNA测序分析

▪DNA链末端合成终止法：

DNA聚合酶能够用单链DNA作为模板，合成准确的DNA互补链；②该酶能够用2'，3'--双脱氧核苷三磷酸作底物并将其聚合到新生寡核苷酸链的3'-末端，从而终止其延伸反应。

在DNA测序反应中，加入模板DNA，引物（特异性引物，如T7，T3，M13等），DNA聚合酶，dA，dT，dG，dC和一种ddNTP。

常用Klenow大片段，无5'→3'外切酶活性。

▪Maxam-Gilbert化学修饰法（哈佛大学）：

该方法的基本原理是用化学试剂处理具有末端放射性标记的DNA片段，造成碱基的特异性切割并产生一组具有不同长度的DNA链降解产物，经凝胶电泳分离和放射自显影之后，可直接读出待测DNA片段的核苷酸序列。

▪DNA杂交测序法（SBH-Sequencingbyhybridization）：

如果一段较短的DNA探针能与较长的DNA片段杂交，并形成完全的双链结构，我们就推测在靶DNA上存在着相应的互补序列，这就是DNA杂交测序法的基本原理。

用一组已知系列的寡核苷酸短序列做为探针，同某一较长的靶DNA分子杂交，从而测定其序列。

（五）基因的化学合成

（六）PCR技术

▪PCR反应体系的设立

▪PCR反应程序设计

▪引物设计原理

▪PCR技术应用

（七）基因定点诱变技术

使已克隆基因或DNA片段中的任何一个特定碱基发生取代、插入或缺失变化的过程叫作基因的定点诱变，是基因工程和蛋白质工程的重要手段。

▪盒式诱变（cassettemutagenesis）包括盒式取代诱变和混合寡核苷酸诱变两种方式。

▪寡核苷酸引物诱变应用化学合成的含有突变碱基的寡核苷酸短片段做引物，进行DNA复制，使寡核苷酸引物成为新合成的DNA子链的一个部分

▪PCR诱变：

重组PCR定点诱变、大引物诱变

（八）DNA与蛋白质相互作用

▪凝胶阻滞实验（Gelretardationassay），又称DNA迁移率变化试验（DNAmobilityshiftassay，DMSA）：

DNA与蛋白质结合后分子量变大，改变了迁移率，由此判断DNA是否与蛋白质发生结合

▪DNaseI印迹试验（DNaseIfootprinting）用于检测与蛋白结合的DNA序列的部位及特性，形象地展示出一种特殊的蛋白质因子同特定DNA片段之间的结合区域。

▪甲基化干扰实验：

根据DMS（硫酸二甲酯）能够使G残基甲基化，而六氢吡啶又能够特异切割甲基化的G残基这一原理。

这种技术可以检测靶DNA中特异G残基的优先甲基化对于此后的蛋白质结合作用究竟会有什么效应，从而更加详细地揭示DNA与蛋白质之间相互作用的模式。

DMS化学干扰的主要局限性时，它只能使G残基甲基化，但仍不愧为足迹实验的一种有效的补充手段，可以鉴定足迹区段中DNA与蛋白质相互作用的精确位置。

第三章基因工程的工具酶

重点：

限制性内切酶、DNA连接酶和DNA聚合酶的生化特征、作用原理和应用领域。

包括Ⅱ型限制性内切酶，T4DNA连接酶，大肠杆菌DNA连接酶，大肠杆菌DNA聚合酶I，Klenow酶，T4DNA聚合酶，T7DNA聚合酶，反转录酶，TaqDNA聚合酶，PfuDNA聚合酶和反转录酶。

T4多核苷酸激酶、碱性磷酸酶和末端转移酶的作用原理和应用领域。

难点：

切口转移与核苷酸标记技术

（一）限制性内切酶和甲基化酶

⏹在DNA双链的特异性识别序列部位，切割DNA分子，产生链的断裂。

两个单链断裂部位在DNA分子上的分布，通常不是彼此直接相对的因此，断裂的结果形成的DNA片断，也往往具有互补的单链延伸末端。

（二）DNA连接酶

⏹能够将DNA链上彼此相邻的3’-羟基（OH）和5’-磷酸基团（-P），在NAD+或ATP供能的作用下，形成磷酸二酯键。

⏹只能连接切口（nick），不能连接缺口（gap）。

而且被连接的DNA链必需是双螺旋DNA分子的一部分。

（三）DNA聚合酶

1、E.coliPolI的特点

（1）具两种外切酶活性和DNA聚合酶活性，在蛋白酶作用下，该酶分裂成两个大小不同的片段，其中小片段具5’→3’外切酶活性，大片段具3’→5’外切酶活性和聚合酶活性（大片段亦称为Klenow片段）。

（2）聚合酶活性

5’→3’,要求3’-OH引物和模板DNA，其延续性受反应条件的影响

2、Klenow片段

由大肠杆菌DNA聚合酶经枯草杆菌蛋白酶的处理之后，产生出来的大片段分子。

仍具有5’→3’的聚合酶活性和3’→5’的外切酶活性，失去了全酶的5’→3’外切酶活性。

3、T4DNA聚合酶

从T4噬菌体感染的大肠杆菌培养物中纯化出的一种特殊的DNA聚合酶，具有5’→3’的聚合酶活性和3’→5’外切酶活性。

5’→3’聚合酶活性，1500nt/min,为PolI的两倍

3’→5’外切酶活性，可作用于ssDNA和dsDNA，其切除速度分别为40和4000nt/min

4、反转录酶

⏹许多RNA肿瘤病毒中分离到这种酶，最常用的是来源于鸟类骨髓母细胞瘤病毒的反转录酶（AMV）

⏹AMV具有α链和β链；α链具有聚合酶活性和RNaseH活性；β链具有以RNA-DNA杂交分子为底物的5’→3’脱氧核酸外切酶活性

5、T7DNA聚合酶

⏹1978年，S.Tabor从感染了T7噬菌体的大肠杆菌寄主细胞中纯化出来的一种聚合酶。

⏹加工形式的T7DNA聚合酶系：

T7噬菌体编码的基因5蛋白质，另一种是大肠杆菌编码的硫氧还蛋白。

⏹基因5蛋白质：

具有聚合酶活性和3’→5’外切酶活性；硫氧还蛋白：

增强基因5蛋白质与模板引物的结合力

⏹具有5’→3’的聚合酶活性和很高的单链及双链的3’→5’核酸外切酶活性。

（四）DNA和RNA修饰酶

1、末端脱氧核苷酸转移酶与同聚物加尾

⏹末端脱氧核苷酸转移酶（terminaldeoxynucleotidyltransferase），从小牛胸腺中纯化出来的一种小分子量的碱性蛋白质，在二甲胂酸缓冲液中，能催化脱氧核苷三磷酸进行5’→3’方向的聚合作用，逐个地将脱氧核苷酸分子加到线性DNA分子的3’-OH末端。

2、T4多核苷酸激酶

⏹由T4噬菌体的pseT基因编码的一种蛋白质，最初从T4噬菌体感染的E.coli中分离出来。

作用：

催化γ-磷酸从ATP分子转移给DNA或者RNA的末端，不受底物分子链的长短限制。

3、来自于大肠杆菌（bacterialalkalinephosphataseBAP）或小牛肠（calfintestinalalkalinephosphataseCIP），

⏹用于脱去DNA（RNA）5’末端的磷酸基团，使5’-P成为5’-OH，该过程称核酸分子的脱磷酸作用。

当需要5’端同位素标记或为了避免DNA片段自身连接（或环化）时可进行脱磷酸反应。

（五）核酸外切酶

第四章原核生物基因工程的载体

重点：

大肠杆菌质粒载体，包括pBR322和pUC18/19载体构建原理和应用领域，蓝/白筛选，质粒DNA的制备和纯化；λ噬菌体载体，包括λgt10/11和λEMBL3/4载体构建原理和应用领域，λ重组噬菌体的筛选；M13噬菌体载体，M13mp18/19构建原理和应用领域，单链DNA的制备；粘粒载体pJB8构建原理和应用领域。

难点：

λ重组DNA的转移和筛选

（一）质粒

质粒是细菌细胞内携带的染色体外的DNA分子，是共价闭合的环状DNA分子（covalentclosedcircular，DNAcccDNA），大小在1~200kb，能独立进行复制。

1、氯化铯密度梯度离心

▪质粒DNA占总DNA的1%～2%；

▪在细胞裂解及DNA分离过程中，大分子量的细菌染色体易断裂成线性片断，而质粒DNA分子量小，结构紧密仍保持完整的状态；

▪染色剂溴化乙锭（EB）能掺入到DNA链的碱基中，导致链的解旋；而且形成的EB-DNA复合物中，EB含量越高，密度会越低。

2、碱变性法

▪根据共价闭合环状质粒DNA与线性染色体DNA片断之间，在拓扑学上的差异而发展出来的。

▪在pH值12.0～12.5范围内时，线性的DNA会被变性而共价闭合环状质粒DNA却不会被变性。

▪通过冷却或恢复中性pH值使之复性，线性染色体形成网状结构，而cccDNA可以准确迅速复性，通过离心去除线性染色体，获得含有cccDNA的上清液，最后用乙醇沉淀，获得质粒DNA

3、质粒载体必须具备的基本条件

▪具有复制起点

自我增殖的基本条件，一般具一个复制子。

协助维持细胞内含有10～20个左右的质粒拷贝

▪具有抗菌素抗性

▪理想的质粒载体具有两种抗菌素抗性基因。

以便为寄主细胞提供易于检测的表型性状做为选择信号，而且在有关的限制酶位点上插入外源DNA后形成的质粒有一个选择标记。

▪具有若干限制酶切单一位点（MCS）；

▪具有较小的分子量和较高的拷贝数。

低分子量的质粒易于操作，克隆外源片断后（不超过15kb）仍能有效的转化给受体细胞同时低分子量的质粒对限制酶具有多重识别位点的几率也较低；较高的拷贝数可获得大量的克隆基因

（二）噬菌体载体

1、λ噬菌体的基因组结构

（1）cos位点

▪线性双链DNA分子两端各有一条12nt组成的彼此完全互补的5’突出单链

▪注入宿主后，粘性末端互补形成双链区，成为cos位点。

2、插入式载体

▪λ噬菌体载体相对于质粒载体来说，克隆片段较大，所以一般用于cDNA文库或基因组文库的构建。

3、λ替换型载体（取代型载体）

外源DNA取代噬菌体染色体中对于噬菌体的感染和复制非必要的片段（~20kb）

高感染效率（109转化株/ug载体DNA，比质粒高100倍）

替换型噬菌体λ是使用最广泛的载体。

4、体外包装

●λ重组体DNA分子的转染作用

●由于λ噬菌体包装时，当DNA的长度短于野生型的75%或超过105%时，噬菌体的活性就急剧下降。

因此只包装它的野生型DNA（48KB）的75%～105%左右的ＤＮＡ，要求λ载体DNA和外源DNA长度上限是51kb，必需基因为28kb，外源极限在23kb。

（三）噬菌粒

•由质粒载体和单链噬菌体载体结合而成的新型的载体系列。

•具有质粒的复制起点、选择性标记、多克隆位点等，方便DNA的操作，可在细胞内稳定存在；

•具有单链噬菌体的复制起点，在辅助噬菌体帮助下，可进行噬菌体的繁殖，产生单链的子代噬菌体。

（四）柯斯质粒载体（Cosmidvector）

•cosmid载体带有质粒的复制起点、克隆位点、选择性标记

•λ噬菌体用于包装的cos末端

•载体在体外重组后，可利用噬菌体体外包装的特性进行体外包装，利用噬菌体感染的方式将重组DNA导入受体细胞。

但它不会产生子代噬菌体，而是以质粒DNA的形式存在于细胞内。

（五）单链DNA噬菌体载体M13、f1、fd

⏹M13是一种含单链（+）DNA（ssDNA）的丝状大肠杆菌噬菌体，其基因组大小为6.4kb。

这类载体主要用来获得大量的单链ＤＮＡ片段，这种单链ＤＮＡ片段在遗传学研究中主要用来测定ＤＮＡ序列（sanger双脱氧法）、基因的定点突变研究、异源双链DNA的分析等。

⏹M13噬菌体载体的寄主菌：

由于M13噬菌体通过F因子编码的菌毛进入宿主细胞，故只能用雄性细菌来增殖病毒。

注意比较载体的特点：

（六）人工染色体

随着脉冲电泳技术的发展以及基因组研究的日益深入，对可插入大片段DNA的克隆载体——人工染色体的研究取得了迅速的发展

所谓人工染色体——是一类能在生物细胞中独立“稳定存在和遗传的人工重组DNA分子”

v酵母人工染色体载体（yeastartificialchromosome,YAC，1000kb）

酵母染色体DNA自主复制顺序（ARS）

酵母染色体的着丝粒顺序（CEN）

酵母染色体的端粒顺序（TEL）

v细菌人工染色体（bacterialartificialchromosome,BAC，300kb）

v哺乳类人工染色体（MAC）

vP1衍生人工染色体

第五章基因的分离、重组和鉴定

基因的克隆，实质上包含着待研究的目的基因的分离与鉴定两个主要内容，克隆步骤包括四个步骤

⏹用于基因克隆的DNA材料的选择，及DNA分子的片段化

⏹外源DNA片段与载体分子的体外连接反应

⏹将人工重组的DNA分子导入他们能够进行正常复制的寄主细胞的程序

⏹对重组体分子的转化子克隆进行筛选

一、基因组DNA的片段化

1、利用限制酶片段化基因组DNA

（1）鸟枪法（shotgunapproch）

（2）随机片段法

构建基因文库时，最好采用随机片段化的办法制备克隆片段机械切割法、限制酶局部消化法

二、外源DNA片段同载体分子的重组

v主要依赖于核酸内切酶与连接酶的作用，选择外源DNA同载体

三、重组子分子导入受体细胞的途径

v原核生物的转化与转染：

常用大肠杆菌K12突变体菌株（丧失限制体系）

四重组子分子的选择与鉴定

1、遗传检测法

2、物理检测法

3、菌落或噬菌斑杂交筛选法

4、免疫化学检测法

5、蛋白质筛选法

6、转译筛选法

第六章基因克隆的策略

从生物有机体中克隆某一特定DNA片段（或基因）的实验程序

1、cDNA基因克隆（cDNA文库）

2、基因组DNA克隆（DNA文库）

3、基因定位克隆

（一）cDNAlibraries的构建

（二）基因组DNA克隆

v基因文库（genelibrary）：

用重组DNA技术将某种生物细胞的总DNA或染色体DNA的所有片段随机地连接在载体上，然后转移到适当的宿主细胞中通过细胞增殖而构成各个片段的克隆。

当制备的克隆数目多到可以把某种生物的全部基因都包含在内的情况下，这一组克隆的总体就称为某种生物的基因文库。

（三）克隆基因的分离

1、应用核酸探针

⏹可以将基因文库或者cDNA文库转移至硝酸纤维素膜后，用特异性的探针同噬菌斑或者菌落进行杂交，可以筛选出阳性克隆

2、应用差别杂交或扣除杂交法

⏹差别杂交（differentialhybridization），又称差别筛选（differentialscreening）适用于分离经特殊处理而被诱发表达的mRNA的cDNA。

⏹扣除杂交（subtractivehybridization），又叫扣除cDNA克隆（subtractivecDNAcloning），通过构建扣除文库得以实现。

⏹抑制性扣除杂交：

以抑制PCR为基础的DNA扣除杂交方法

3、应用mRNA差别显示技术（DDRT-PCR）

⏹一般用20种随机引物和12种3’-端锚定引物组成的全部240组引物对PCR扩增后，所产生的大约20000条条带，基本涵盖了在一定的发育阶段某种类型细胞中所表达的全部的mRNA。

4、cDNA差式分析法（RDA）

5、表达序列标签法（ESTs）

⏹ESTs（ExpressedSequencetags）是从已建好的cDNA库中随机取出一个克隆，从5’末端或3’末端对插入的cDNA片段进行一轮单向自动测序，所获得的约60-500bp的一段cDNA序列。

6、基因表达系列分析法（SAGE）

⏹分离每个转录本的特定位置的较短的单一的序列标签（约9-14个碱基对，SequenceTag，ST），含有确定一个独特转录物的足够信息量。

7、应用表达文库

⏹当没有可用的核苷酸序列供作筛选基因文库的探针时，将cDNA克隆在表达载体上，再导入大肠杆菌寄主细胞然后通过对蛋白质产物的鉴定，分离克隆的真核目的基因。

8、酵母双杂交体系

⏹有效的分离能与已知的靶蛋白质相互作用的蛋白质的编码基因。

第七章克隆化基因在E.coli中表达和重组表达子的筛选

重点：

大肠杆菌表达载体的构建原理，pTrcHisA/B/C，pGEM-3Z/pGEM-11Zf，pET-34/38，pBV220；外源基因在E.coli中的表达部位，表达蛋白质的策略，克隆化基因在宿主细胞表达的因素影响。

难点：

包涵体的形成机制和融合表达

（一）克隆化基因表达的基本条件

为了实现克隆化的真核基因在大肠杆菌中高效表达，必须满足其表达的基本要求，包括：

1将克隆的真核基因插入到大肠杆菌启动子附近。

最好是强启动子，这样可使克隆基因得到最大限度的转录。

目前常用的强启动子有以下几种：

（1）大肠杆菌lac操纵子的lac启动子；

（2）大肠杆菌trp操纵子的trp启动子；

（3）λ噬菌体的PL启动子；

（4）T7噬菌体启动子。

2克隆基因具有较强的核糖体结合位点（SD序列）。

3克隆基因具有正确的插入取向。

因为任何基因的DNA分子只有一条具有编码蛋白质的功能（编码链）。

4考虑到外源蛋白质在大肠杆菌中存在的不稳定性（易被大肠杆菌产生的蛋白酶所降解），最好将克隆（小）基因置于能形成融合蛋白的基因片段之后。

（二）适用于原核细胞表达的载体

（三）如何提高克隆化基因的表达水平

克隆化基因在宿主细胞的表达量受多种因素的影响，主要有

（1）启动子的强度，

（2）DNA转录起始序列，（3）密码子的使用习惯，（4）mRNA分子的二级结构，（5）转录的终止，（6）表达质粒的拷贝数及其稳定性，（7）宿主细胞的生理状态等。

（四）表达子的筛选鉴定

第八章基因工程技术应用实例

▪介绍教学团队的科研成果，帮助同学系统归纳基因工程技术，培养同学的科研思路。