生化技术原理复习重点.docx
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生化技术原理复习重点
⏹第三节 细胞的破碎
欲提取存在于细胞内的物质时，必须把细胞破碎。
⏹动物——细胞膜较脆弱极易破损，在组织绞碎或提取时就破坏了。
⏹植物和微生物——细胞壁较牢固，需要在提取前进行专门的破细胞操作。
一、机械破碎
1．研磨法
1）用研磨棒研碎组织，可加入一定量的石英砂（45-50μm）。
2）匀浆器处理
优点：
较温和，适宜实验室应用
注意：
加石英砂时，对有效成分有吸附作用
细菌和植物组织的细胞破碎均可用此法
2．组织捣碎器法
剧烈的破碎细胞方法。
在转速8000-10000r／min下处理30-45秒，细胞能完全破碎。
注意：
1）加入石英砂；
2）必须保持低温，以防温度升高引起有效成分变性；
3）时间不易太长。
3.超声波法
⏹它是借助声波的振动力破碎细胞壁和细胞器的有效方法。
⏹加石英砂则可缩短时间。
⏹为防止产生过多的热量，用间歇处理和降低温度的方法。
4．压榨法
⏹此法是一种温和、彻底破碎细胞的方法。
⏹用1.77×108-3.54×108Pa的压力迫使几十毫升细胞悬液通过一个小孔（＜细胞直径的孔），致使其被挤破、压碎。
5．冻融法
将细胞置低温下冰冻一定时间，然后取出置室温下（或40℃左右）迅速融化。
如此反复冻融多次，细胞可在形成冰粒和增高剩余胞液盐浓度的同时，发生溶胀、破碎。
二、溶胀和自溶
1.溶胀
⏹细胞膜为天然的半透膜，低浓度的稀盐溶液中，由于存在渗透压差，溶剂分子大量进入细胞，引起细胞膜发生胀破的现象称溶胀。
⏹例如，红血球置清水中会迅速溶胀破裂并释放出血红素。
2.自溶
⏹细胞结构在本身所具有的各种水解酶如蛋白酶和酯酶等作用下，发生溶解的现象称自溶。
⏹特别小心操作，水解酶不仅可使细胞壁、细胞膜破坏，也可把有效成分在自溶时分解。
三、化学处理
用脂溶性的溶剂（如丙酮、氯仿、甲苯）或表面活性剂（SDS）处理细胞时，可把细胞壁、细胞膜的结构部分溶解，进而使细胞释放出各种酶类等物质，并导致整个细胞破碎。
四、生物酶降解
⏹生物酶（如溶菌酶）有降解细菌细胞壁的功能。
用此法处理细菌细胞时，先是细胞壁消解，随之而来的是因渗透压差引起的细胞膜破裂，最后导致细胞完全破碎。
⏹例如，从某些细菌细胞提取质粒DNA时，不少方法都采用加溶菌酶（来自蛋清）破细胞壁的步骤。
细胞破碎后：
降低温度，尽快纯化，避免氧化、吸附、污染
第六节纯化方案的设计与评价
⏹纯化方案——指在纯化过程中几种纯化方法有机的联合应用的总称。
⏹它是成功地达到纯化目的的前提。
纯化方案合理，就能事半功倍。
⏹一、纯化方案的设计
1.选择纯化方法
依据：
抽提液中有效成分和杂质之间理化性质的差异性
⏹沉淀法—溶解度的差异
⏹离子交换层析法—电荷差异
⏹凝胶过滤法—分子量差异
⏹亲和层析—配体亲和力差异
讨论纯化效果：
高活性、高回收率、高纯度、方便快速、经济
2.可选择多种纯化方案时，纯化方法的排布应遵循的原则
1）先选用粗放、快速、有利于缩小样品体积和后工序处理的方法。
2）精确、费时间和需样品量少的方法应当后选用。
注意：
一个纯化方案中，切忌一种方法重复使用。
否则，不但不能提高纯化倍数，反而会降低回收率。
二、纯化方案的评价
是对组成纯化方案的每一个纯化方法的评价。
⏹对纯化过程的每一步收集的溶液都进行有效成分的含量测定，并将比活力（活力单位数/毫克蛋白）、纯化倍数（每步的比活力/抽提液的比活力）和回收率（每步总比活力/抽提液的总活力×100%）计算出来。
⏹纯化倍数的大小，回收率的高低，就能初步确定每个纯化方法的应用价值。
⏹一般认为：
凡是纯化倍数大，回收率高的纯化方法是有应用价值的。
但是，在纯化过程中，随着纯化倍数的提高，有效成分的含量是逐渐降低的。
第七节有效成分纯度和性质的分析
有效成分的纯度和性质测试与分析：
1.鉴定纯度的方法：
电泳、免疫分析、薄层层析和薄膜层析
2.鉴定含量的方法：
光谱法和气相层析
3.测定有效成分分子量的方法：
凝胶过滤和电泳法
4.测定核酸序列的方法：
化学直读法、酶解直读法
5.测定蛋白质序列的方法：
与Endman降解法相结合的薄膜层析
第二章沉淀法
一、盐析法
原理：
是蛋白质在稀盐溶液中，溶解度会随盐浓度的增高而上升（盐溶），但当盐浓度增高到一定数值时，其溶解度又逐渐下降，直至蛋白质析出（盐析）。
原因：
盐浓度增高到一定数值时，使水活度降低，导致蛋白质分子表面电荷逐渐被中和，水化膜逐渐被破坏，最终引起蛋白质分子间相互聚集并从溶液中析出。
一般操作步骤（蛋白质分级沉淀时常用）
⏹1）选择一定浓度范围的盐溶液（如0-25％饱和度硫酸铵），使部分杂质呈“盐析”（沉淀）状态，有效成分呈“盐溶”（溶解）状态。
⏹2）经离心后得到上清液，再选择一定浓度范围的盐溶液（如25％-60％饱和度的盐溶液），使有效成分等物质呈盐析状态，而另一部分杂质呈盐溶状态，用离心法收集的沉淀物即为初步纯化的有效成分物质。
1.盐的分级沉淀
⏹
（1）盐类的选择
常选用：
硫酸铵
优点：
a.溶解度大，对温度不敏感，当水温25℃时，硫酸铵的饱和溶解度（即每升溶剂可溶解盐的克数）为769克。
当水的温为0℃时，其饱和溶解度679克。
⏹b.分级效果好，有些抽提液经过加入适量硫酸铵的一次性可除杂蛋白75%以上
⏹c.有稳定蛋白质结构的作用，将2-3mol/L硫酸铵盐析的蛋白质置低温下保存一年，其性质没有变化
⏹d.价格低廉，废液可肥田
缺点：
即得到的样品欲继续纯化时，需花一定时间脱盐
（2）硫酸铵盐析的操作
①固体加入法：
在溶液中逐步加入固体硫酸铵，加到一定饱和度时，蛋白质可沉淀出来。
注意：
控制加入的速度，在搅拌下、以少量多次方式缓慢地加入，待先加的硫酸铵溶解后再加入少量的硫酸铵。
②饱和溶液加入法
⏹是使蛋白质脱水沉淀比较温和的方法
⏹蛋白质溶液中逐步加入预先调好pH的饱和硫酸铵溶液，不同饱和度所需的硫酸铵量可用计算：
⏹
V＝需加入硫酸铵溶液的体积（毫升）；V0＝原来溶剂的体积（毫升）；S1＝原来溶液的百分饱和度；S2＝要求达到的百分饱和度；S3＝需要加入硫酸铵溶液的饱和度（一般用100%的）。
⏹优点：
比加入固体硫酸铵沉淀法温和。
⏹缺点：
对于大体积样品不适用。
因为硫酸铵溶液的大量加入，将导致样品溶液体积增加。
③透析盐析法
将盛蛋白质溶液的透析袋放入一定浓度的大体积盐溶液中，通过透析作用来改变蛋白质溶液中的盐浓度。
特点：
盐浓度是以连续的状态变化，可以避免盐浓度局部升高产生的不良影响，分离效果好。
缺点：
只用于要求较精确、样品体积小的试验。
2．盐析曲线的制作
用盐析法沉淀欲分离样品时所需盐浓度范围要通过实验确定。
具体步骤：
⏹取一定体积已测含量的蛋白质或酶待分离溶液，调节pH至稳定范围，分6-10次加入不同量的硫酸铵：
第一次加硫酸铵到溶液出现微弱混浊状态时，静置一段时间，离心或过滤即得到第一个分级沉淀部分。
接着以同样的操作加硫酸铵到上清液或过滤液中，则得到第二个分级沉淀部分。
⏹如此连续进行，便可得到6-10个分级沉淀部分。
然后将每个分级沉淀部分分别重新溶解于一定体积的适宜pH的缓冲液中，根据其蛋白质或酶含量和相对应的硫酸铵浓度之间的关系作图，即可得到典型盐析曲线。
⏹在此曲线基础上，参照分级试验方法，可找出有利于提高收得率和纯化倍数的精细盐析范围。
3.盐析的影响因子
（1）盐析常数（Ka）
蛋白质在溶液中的溶解度和该溶液的盐浓度的关系为：
溶解度（S，以mg/ml表示）的对数值与溶液中盐的浓度（M）成反比例关系，可用公式表示：
lgS＝β-Ka·M
式中β表示有效成分在水中溶解度的对数值；M表示克分子浓度；Ka表示有效成分在特定条件下的数值，即表示有效成分的溶解度降低的速率是随着盐浓度的增加而增加的。
Ka值大，则意味着有效成分溶解度降低的速率快。
因此，对一种有效成分而言，Ka值越大，分级范围越窄。
盐析效果就越好。
某一蛋白质的Ka值：
与蛋白质本身的性质有关
与溶液的pH、温度和盐的种类等有关
（2）盐的分级范围的差异性
当分离两种以上蛋白质时，若每一种蛋白质的Ka值都很大，而且盐析范围（盐离子强度）差异明显，则分离效果好；若Ka值很大，但盐析范围差异较小，则分离效果不好。
（3）pH和盐浓度
⏹溶解度与pH和盐浓度有密切关系。
当这两种因子变动时，溶解度将发生明显的变化。
⏹选择适当pH的盐溶液，可提高对有效成分的盐析效果。
⏹另外，硫酸铵水溶液显酸性，为防止其对某些蛋白质的破坏，应及时用氨水调pH至中性或视有效成分的pH而定。
（4）蛋白质的纯度和浓度
⏹蛋白质存在的形式和浓度不同，盐析范围和溶解度也不同。
⏹在混合的蛋白质溶液中，不同分子间的相互作用会发生共沉淀现象。
蛋白浓度越高，这种现象越明显，盐析分离效果则越差。
⏹因此，一般控制样品液蛋白浓度在0.2％-2％为宜。
（5）其它
⏹在溶液中加1mmo1/L的EDTA-Na2盐，以除去沉淀剂中带入的金属离子。
⏹或控制加硫酸铵沉淀的时间，一般二小时左右。
4．脱盐
常用方法：
凝胶过滤法和透析法
具体操作：
是把待脱盐溶液装入有一定孔径的透析袋，扎紧袋口（袋内留适当的空间）。
漂在水或适当的透析液中。
要防止透析液从袋口进入，以免引起透析袋胀裂。
盐离子和小分子物质将穿过半透膜由高向低进行扩散渗透，而蛋白质等则留在袋内。
不断更新透析液，若用温和搅动的办法则效果较好；为了避免蛋白质或酶类破坏，在低温下进行。
透析时注意：
（1）透析袋的处理
新的透析袋用蒸馏水洗净，无漏洞时，即可使用。
除去透析袋中所含盐类时，处理方法：
将透析袋置500毫升含1mmo1/LEDTA-Na2的2％碳酸氢钠溶液中煮沸10分钟，用干净镊子或戴橡皮手套取出，蒸馏水煮沸、漂洗后，可使用。
用过的透析袋同样处理后，能重复使用。
保存：
泡在蒸馏水中置低温（4℃）或泡在70％的乙醇中保存。
（2）选用适当的透析液
一般选用：
低离子强度的中性缓冲液
对含有辅基的酶透析时，在透析液中宜加入适量的辅基或保护辅基的试剂。
为了防止微生物生长，透析应在4℃进行或在透析液中添加0.02％叠氮化钠。
（3）掌握透析时间
搅拌下进行，样品液与透析液体积之比以1:
10较好，一般三小时。
在静止状态下过夜进行时，则比例应扩大到1:
20以上。
盐脱是否彻底，要经常检查：
除去硫酸铵，可用10%氯化钡检查
除去氯化钠，可用10％硝酸银检查
透析液中检测不出现硫酸钡或氯化银沉淀，即透析完成。
第三章吸附层析
2．吸附剂的性质
⏹商品吸附剂购得即可使用。
⏹当吸附剂混有某些杂质或者颗粒不均匀时，
使用前应处理：
先过筛，除去大的颗粒，或者采用悬浮法，除去细小颗粒，然后用酸、碱等溶液浸泡，接着用沸水煮，清水洗，再用有机溶液如甲醇处理，这样即可得到既无杂质，颗粒又均一的吸附剂。
（1）羟基磷灰石
[Ca5（PO4）3OH]（简称HA）分离磷酸蛋白质。
优点：
HA的吸附容量高，稳定性好（在T＜85℃，pH5.05-10.0均可使用）
应用：
制备及纯化蛋白质、酶、核酸、病毒；分离RNA、双链DNA，单链DNA和杂型双链DNA-RNA等。
⏹HA的Ca2+基团和生物分子表面的负电荷基团的相互反应，在用HA分离生物分子过程中起着重要的作用。
⏹而HA的PO43-基团与生物分子表面的阳电荷基团的相互反应，则仅起着次要的作用。
⏹注意：
⏹1）HA系干粉时，要先在蒸馏水中浸泡，使其膨胀度（水化后所占有的体积）达到2-3ml/g后，再按1:
6体积加入缓冲液（如0.01mol/LNaP，pH6.8）悬浮，以除去细小颗粒。
⏹2）HA悬浮液须用旋涡振荡器混合，若用磁棒或玻棒搅拌时，HA的晶体结构会受破坏。
⏹3）忌用柠檬酸缓冲液和pH＜5.5的缓冲液。
⏹4）就操作容量来说，一般细颗粒HA比粗的大。
而从分辨率比较，粗颗粒HA也没有细的好。
但是用细颗粒HA层析时，柱子直径应大些才能达到满意的流速。
⏹当用过的HA层析柱再生时，要先挖去顶部的一层HA，然后用一倍床体积的1mo1/LNaCl溶液洗涤，接着用4倍床体积的平衡液洗涤平衡，如此处理后即可使用。
五、层析柱的制备与层析操作
柱层析的设备：
层析柱、部分收集器、磁力搅拌器和恒流泵、检测仪
1.层析柱
是下端有细口并带有筛板的玻管。
柱的直径与其长度之比，一般为1:
10-1:
40。
采用极细吸剂装柱时，宜用比例大的层析柱。
反之，则宜用比例小的层析柱
优点：
节省时间和提高分辨率
⏹2.吸附剂的用量
⏹由其自身的操作容量和分离物中各成分的性质决定的。
当操作容量高时，吸附剂用量少。
⏹一般吸附剂的用量为被分离样品的30-50倍。
若样品中各成分的性质相似难以分开时，则吸附剂用量应增大，有时大于100倍。
3.装柱
装柱前要先将层析柱垂直固定在支架上。
分类：
干装法和湿装法两种。
干装法——直接加吸附剂到柱中，然后倒入溶剂，此法不易将气泡排尽。
湿装法——先加适量溶剂到柱内，排走其中的空气，然后把预先用溶剂浸泡好的吸附剂搅匀，随即将此悬浮液连续倾入到柱中，待其自然沉降至柱高的1/4-1/3时打开柱下端出口，让溶剂慢慢流出，使柱上端悬浮液徐徐下降至需要的高度。
⏹4.上样和洗脱
⏹经过平衡的层析柱，当平衡液流到与固定相表面一致位置时，用滴管轻轻地把分离样品的溶液加到固定相表面，要尽量不要冲动基质。
加入样品液的体积一般应小于床体积的1/2（当加入的样品量相同时，体积越小越有利于提高分辨率）。
⏹待样品液的液面流到固定相表面时，用滴管加入洗脱剂，并在柱上端与装有洗脱剂的贮液瓶连接开始洗脱。
⏹同时在柱下端与部分收集器接通，立即进行分级收集（按体积或时间分管收集），随后将收集的每管溶液进行浓度或活性测定。
根据测定结果，即可绘制出洗脱曲线（以管号或洗脱体积为横坐标，以每管溶液中样品的浓度或活性为纵坐标）。
⏹图中的A峰和B峰均呈对称形，二者没有重叠，这表明样品液中的组分已完全分开。
定性定量洗脱物的依据：
层析峰的面积（FEG）、峰高（BE）和半峰高宽度（HI）等参数
⏹洗脱液的流速必须控制。
如果太快，洗脱物在两相中的平衡过程不完全，如果太慢，洗脱物会扩散。
⏹由层析柱分离出的样品经浓缩或冻干处理后，可进行纯度测定。
如杂质含量仍大时，应该用其它方法继续纯化。
5.吸附剂的再生
⏹用过的吸附剂，经适当方法处理后，又恢复其性能的过程。
⏹一般不同吸附剂（或基质）的再生方法是不同的。
第四章离子交换层析
⏹离子交换层析是一种常用的层析方法
它是在以离子交换剂为固定相，液体为流动相的系统中进行的。
应用：
很多生化物质（例如氨基酸、多肽、蛋白质、糖类、核苷和有机酸等）的分析、制备、纯化，以及溶液的中和、脱色等。
第一节基本原理
离子交换剂是由基质、电荷基团和反离子构成的。
它在水中呈不溶解状态，能释放出反离子。
它将与溶液中的其它离子相互结合，结合后本身的理化性质仍保持不变。
离子交换剂与水溶液中离子的反应以离子交换方式进行，或者借助离子交换剂上电荷基团对溶液中离子的吸附作用进行。
这些过程都是可逆的。
假设以RA代表阳离子交换剂，它在溶液中解离出来的阳离子A+与溶液中的阳离子B+能发生可逆的交换反应。
平衡常数：
离子交换剂对溶液中不同离子具有不同的结合力，这种结合力的大小是由离子交换剂的选择性决定的。
即
离子交换剂与各种水合离子（离子在水溶液中发生水化作用形成的）的结合力：
⏹是与离子的电荷量成正比，而与水合离子半径的平方成反比。
⏹离子价数越高，结合力越大。
⏹在离子间电荷相同时，则离子的原子序数越高，水合离子半径越小，结合力亦越大。
在稀溶液中离子发生水化时，各种阴离子和阳离子结合力大小的排列次序如下：
⏹
一价离子：
Li+＜Na+＜K+＜Rb+＜Cs+
⏹（对阳离子交换剂）
二价离子：
Mg2+＜Ca2+＜Sr2+＜Ba2+
⏹（对阳离子交换剂）
一价阴离子：
F-＜Cl-＜Br-＜I-
⏹（对阴离子交换剂）
不同价阳离子：
Na+＜Ca2+＜Al3+＜Ti4+
⏹（对阳离于交换剂）
⏹对于呈两性离子的蛋白质等物质与离子交换剂的结合力，取决于它们的物理化学性质和在特定pH条件下呈现的离子状态。
⏹当pH低于等电点（pI）时，它们能被阳离子交换剂吸附；反之，当pH高于pI时，它们能被阴离子交换剂吸附。
⏹在相同的pH，且pI＞pH时，pI越高，碱性越强就越易被阳离子交换剂吸附。
第五章凝胶过滤
3．凝胶柱的鉴定
将蓝色葡聚糖-2000，或红色葡聚糖或细胞色素C或血红蛋白等配成2毫克/毫升的溶液过柱，观察色带是否均匀下降。
如均匀下降，则表明柱中凝胶是均匀的、柱中没有裂缝和气泡，否则重新装柱。
如鉴定时采用的是蛋白质类物质，有两个作用：
1）鉴定柱子；
2）克服柱子对某些分离物的不可逆吸附作用。
第六章亲和层析
（AffinityChromatography）
概念：
亲和层析是利用配体和大分子相互作用时所固有的独特的生物学特性建立的一种吸附层析。
这种相互作用包括：
酶—底物、产物、抑制物、辅酶和变构调节剂
激素—结合蛋白、细胞受体
基因—核酸、阻遏蛋白
抗体—互补抗原
植物外源性凝集素—红细胞、淋巴细胞的表面抗原、某些糖和多糖
第一节基本原理
欲分离的大分产物质S和相对应的专一物质L（配体）以次级键结合，能生成一种可解离的络合物L-S。
其中的L又能与活化的基质M以共价键首先结合，而形成M-L-S复合物。
根据L-S之间能可逆地结合与解离的原理发展起来的层析方法称为亲和层析法（AffinityChromatography）。
（1）Hydrogenbond
（2）Hydrophobicinteraction
（3）Electrostaticinteraction
（4）Vanderwaalsinteraction
⏹亲和层析实质
⏹是把具有识别能力的配体L（对酶的配体可以是类似底物、抑制剂或辅基等）以共价键的方式固化到含有活化基团的基质M（如活化琼脂糖等）上，制成亲和吸附剂M-L，前者叫做固相载体，而固化后的配体仍保持束缚特异物质的能力。
⏹当把固相载体装入小层析柱后，让欲分离的样品液通过该柱。
样品中对配体有亲和力的物质S可借助静电引力、范德华力及结构互补效应等作用吸附到固相载体上，而无亲和力或非特异吸附的物质被缓冲液洗涤出来，形成第一个层析峰。
再改变缓冲液的pH值或增加离子强度或加入抑制剂等，可把物质S从固相载体上解离下来，形成了第二个层析蜂。
这样就可把有效成分与杂质分开。
⏹如果样品液中存在两个以上的物质与固相载体具有亲和力（其大小有差异）时，采用选择性缓冲液进行洗脱，也可将它们分离开。
用过的固相载体经再生处理后，可以重复使用。
⏹分类
1）特异性配体亲和层析法。
配体为复杂的生命大分子物质（如抗体、受体和酶的类似底物等），它具较强的吸附选择性和较大的结合力。
2）通用性配体亲和层析法。
配体为简单的小分于物质（如金属、染料以及氨基酸等），它成本低廉、且有较高的吸附容量，通过改善吸附和脱附条件可提高层析的分辨率。
⏹优点
1）亲和层析的分辨率高。
因为将琼脂糖基质装入上述的小层析柱中，不论加入何种样品液都只能得到一个层析峰；
2）操作步骤少，活力不易丧失。
⏹适用：
分离纯化蛋白质，核酸和激素等物质。
⏹缺点：
要分离一种物质必须找到适宜的配体，并将其制成固相载体。
第七章聚焦层析
⏹在等电点聚焦方法的基础上发展起来的
⏹依据：
等电点的差异和离子交换行为
⏹优点：
1）聚焦作用、浓缩样品和分辨率高；
2）操作过程不需要特殊实验设备；
3）是一种纯化制备蛋白质、核酸的好方法。
⏹第一节基本原理
⏹聚焦层析也是一种柱层析
⏹具有流动相和固定相
流动相—多缓冲剂
固定相—多缓冲交换剂
⏹一、多缓冲剂和多缓冲交换剂
1．多缓冲剂
⏹是由一系列精选的物质构成的，在一定范围的pH下具有相似的、较强的缓冲能力。
与普通的缓冲剂是不一样的。
⏹瑞典Pharmacia公司出售的多缓冲剂有polybuffer96和polybuffer74，分别在pH6-9和4-7具有较强的缓冲能力，如将它们混合，则缓冲能力的pH为4-9。
另外，pH8.0-10.5的两性电解质（pharmalyte）也具有多缓冲剂的性能。
⏹在实践中如何选用多缓冲剂?
须根据聚焦层析的pH梯度范围来决定。
例如，聚焦层析的pH梯度范围是7-4时，可选用polybuffer74多缓冲剂。
⏹多缓冲剂在280nm处消光值较低，而在250nm处则较高。
因此，聚焦层析的洗脱监测应在280nm处进行。
⏹
一般多缓冲液是以液体形式提供（250m1分装，用时稀释至2-3升），宜贮存在3-8℃的暗处。
⏹2．多缓冲交换剂
⏹Pharmacia出售的多缓冲交换剂PBE94和PBE118是以Sepharose6B为基质，通过化学方法把带有多种电荷基团的配体与其偶联而制成的。
⏹优点：
缓冲能力相当强，在pH3-12的水溶液、盐溶液和有机溶剂中都稳定，有解离剂如8mol/L尿素时，也较稳定。
柱体积比较恒定，流速容易控制，既使流速较快时，也不会影响分辨率。
二、聚焦层析原理
⏹原理
三方面：
1）pH梯度溶液的形成
2）蛋白质的行为
3）聚焦效应
1．pH梯度溶液的形成
在离子交换层析中，pH梯度溶液的形成是靠梯度混合仪实现的。
当用阴离子交换剂层析时，制备pH由高到低呈线性变化的梯度溶液的方法是，在梯度仪的混合室中装高pH溶液，而在另一室装低pH极限溶液，打开层析柱的下端出口，让洗脱液连续不断地流过柱体。
这时从柱的上部到下部溶液的pH值是由高到低变化的。
在聚焦层析中，当洗脱液流进多缓冲交换剂时，由于交换剂带具有缓冲能力的电荷基团，故pH梯度溶液可以自动形成。
以阴离子PBE94作固定相，先用起始缓冲液平衡到pH9，再用含pH6的多缓冲剂作流动相，多缓冲剂中酸性最强的组分与碱性阴离子交换剂结合发生中和作用。
随着流动相的加入，柱内每点的pH值从高到低逐渐下降。
从层析柱顶部到底部就形成了pH6-9的梯度。
⏹聚焦层析柱中的pH梯度溶液是在淋洗过程中自动形成的，但是随着淋洗的进行，pH梯度会逐渐向下迁移，从底部流出液的pH却由9逐渐降至6，并最后恒定于此值，这时层析柱的pH梯度也就消失了。
2．蛋白质的行为
⏹蛋白质所带电荷取决于它的等电点（pI）和层析柱中的pH。
当柱中的pH随着洗脱剂移动，固定相中的pH值发生变化。
当蛋白质移动至环境pH>pI时，蛋白质带负电，并与阴离子交换剂结合。
蛋白质的环境pH再次随着洗脱液迁移，上述过程反复进行，蛋白质就在各自的等电点被洗下来，达到分离的目的。
不同蛋白质具有不同的等电点，它们在被离子交换剂结合以前，移动之距离是不
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