纯化水方法学验证报告.docx

纯化水方法学验证报告.docx

《纯化水方法学验证报告.docx》由会员分享，可在线阅读，更多相关《纯化水方法学验证报告.docx（35页珍藏版）》请在冰豆网上搜索。

纯化水方法学验证报告

纯化水微生物限度检查方法学验证报告

1适用范围

本验证报告适用于纯化水微生物限度检查法的验证。

2目的

建立该产品的微生物限度检查方法，并对其有效性进行评价，确保试验方法的完整性，保证检验结果的可靠性。

3概述

3.1通过验证以确认所采用的方法适合于纯化水的需氧菌总数测定和控制菌检查。

根据样品特性制订检验方法和检验条件，按制定的方法进行试验，根据验证结果判断是否符合验证标准。

若符合，按验证的方法和条件进行纯化水的微生物限度检查；若不符合，重新建立制订检验方法和检验条件，再进行验证，直至验证结果符合设立的验证标准。

4验证所需要的仪器设备及文件

4.1验证需用仪器设备

器具名称

规格型号

检定日期

检定单位

有效期

隔水培养箱

GH-500

立式压力蒸汽灭菌锅

LDZM-80KCS

电热鼓风干燥箱

101-2EBS

生化培养箱

SPX-150

霉菌培养箱

MJP-160

4.2验证所需要的文件及存放地方

资料名称

存放地点

《GH-500型隔水培养箱操作维护保养SOP》

《LDZM-80KCS蒸汽灭菌器操作维护保养SOP》

《101-2EBS电热鼓风干燥箱操作维护保养SOP》

《SPX-150型生化培养箱操作维护保养SOP》

《MJP-160型霉菌培养箱操作维护保养SOP》

5可接受的限度范围标准

5.1纯化水微生物限度检查质量标准

项目

标准规定

需氧菌总数

≤100CFU/ml

大肠埃希菌

1ml中不得检出

沙门菌

10ml中不得检出

金黄色葡萄球菌

1ml中不得检出

铜绿假单胞菌

1ml中不得检出

5.2计数方法适用性试验结果判断

在3次独立的平行试验中,采用薄膜过滤法,若菌液对照组生长菌落符合要求，阴性对照组无菌落生长且试验组菌落数减去供试品对照组菌落数的值与菌液对照组菌落数的比值应在0.5~2范围内；若各试验菌的回收试验均符合要求，照所用的供试液制备方法及计数方法进行该供试品的需氧菌总数计数。

5.3控制菌检查方法验证结果判断

在3次独立的平行试验中，采用薄膜过滤法,若阳性对照组检出试验菌（检出试验菌判断如下5.3.15.3.25.3.35.3.4），阴性对照组未检出试验菌且实验组检出试验菌（检出试验菌判断如下5.3.15.3.25.3.35.3.4）按此供试液制备法和控制菌检查法进行供试品的该控制菌检查；若试验组未检出试验菌，应采用其他方法消除供试品的抑菌活性，并重新进行验证。

5.3.1大肠埃希菌检查方法适用性试验结果判断

若麦康凯琼脂培养基平板上有菌落生长，应进行分离、纯化及适宜的鉴定试验，确证是否为大肠埃希菌；若麦康凯琼脂培养基平板上没有菌落生长，或虽有菌落生长但鉴定结果为阴性，判供试品未检出大肠杆菌。

5.3.2沙门氏菌检查方法适用性试验结果判断

若木糖赖氨酸脱氧胆酸盐琼脂培养基平板上有疑似菌落生长，且三糖铁琼脂培养基的斜面为红色、底层为黄色，或斜面黄色、底层黄色或黑色，应进一步进行适宜的鉴定试验，确证是否为沙门菌。

如果平板上没有菌落生长，或虽有菌落生长但鉴定结果为阴性，或三糖铁琼脂培养基的斜面未见红色、底层未见黄色；或斜面黄色、底层未见黄色或黑色，判供试品未检出沙门菌。

5.3.3金黄色葡萄球菌检查方法适用性试验结果判断

若甘露醇氯化钠琼脂培养基平板上有黄色菌落或外周有黄色环的白色菌落生长，应进行分离、纯化及适宜的鉴定试验，确证是否为金黄色葡萄球菌；若平板上没有与上述形态特征相符或疑似的菌落生长，或虽有相符或疑似的菌落生长但鉴定结果为阴性，判供试品未检出金黄色葡萄球菌。

5.3.4铜绿假单胞菌检查方法适用性试验结果判断

若溴化十六烷基三甲铵琼脂培养基平板上有菌落生长，且氧化酶试验阳性，应进一步进行适宜的鉴定试验，确证是否为铜绿假单胞菌。

如果平板上没有菌落生长，或虽有菌落生长但鉴定结果为阴性，或氧化酶试验阴性，判供试品未检出铜绿假单胞菌。

6验证依据

USP40药典通则

7培养基

采用符合美国药典规定的干燥培养基（见表1），按照厂家提供的使用说明书进行配制和灭菌，并按要求写好XYK/REC-QC040培养基配制使用记录、XYK/REC-QC022仪器使用记录，参照USP40药典通则61、USP40药典通则62进行培养基适应性检查试验，并按要求写好培养基适应性检查记录。

（见表2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13）

表1培养基信息概况

名称

配置批号

允许PH值范围

灭菌前PH值

灭菌后PH值

PH7.0氯化钠蛋白胨缓冲液

胰酪大豆胨琼脂培养基

R2A琼脂培养基

麦康凯琼脂培养基

胰酪大豆胨液体培养基

麦康凯液体培养基

木糖赖氨酸脱氧胆酸盐琼脂培养基

沙氏葡萄糖琼脂培养基

RV沙门菌增菌液体培养基

沙氏葡萄糖液体培养基

三糖铁琼脂培养基

甘露醇氯化钠琼脂培养基

溴化十六烷基三甲铵琼脂培养基

胰酪大豆胨琼脂对照培养基

麦康凯液体对照培养基

沙氏葡萄糖琼脂对照培养基

R2A琼脂对照培养基

麦康凯琼脂对照培养基

胰酪大豆胨液体对照培养基

木糖赖氨酸脱氧胆酸盐琼脂对照培养基

RV沙门菌增菌液对照培养基

沙氏葡萄糖液体对照培养基

三糖铁琼脂对照培养基

甘露醇氯化钠琼脂对照培养基

溴化十六烷基三甲铵琼脂对照培养基

8.1培养基适用性检查

8.1.1菌液制备及菌落计数（参照9菌种）

8.1.2.1胰酪大豆胨液体培养基适用性检查（结果见表2）

接种不大于100cfu的金黄色葡萄球菌、铜绿假单胞菌、枯草芽孢杆菌、大肠埃希菌、乙型副伤寒沙门菌至胰酪大豆胨液体培养基中，至30~35℃培养18-24小时，每一试验菌株平行制备2管；同时，用相应的对照培养基替代被检培养基进行上述试验。

被检液体培养基管与对照培养基管比较，试验菌应生长良好。

表2胰酪大豆胨液体培养基适用性检查结果

菌株名称

菌液编号

培养条件

菌株稀释级

胰酪大豆胨液体培养基

生长状况

结论

金黄色葡萄球菌

验证用培养基（A）

对照培养基（B）

铜绿假单胞菌

验证用培养基（A）

对照培养基（B）

枯草芽孢杆菌

验证用培养基（A）

对照培养基（B）

大肠埃希菌

验证用培养基（A）

对照培养基（B）

乙型副伤寒沙门菌

验证用培养基（A）

对照培养基（B）

结论：

检验人：

检验日期：

复核人：

复核日期：

8.1.2.2沙氏葡萄糖液体培养基适用性检查（结果见表3）

接种不大于100cfu的白色念珠菌至沙氏葡萄糖液体培养基中，至20~25℃培养2-3天，每一试验菌株平行制备2管；同时，用相应的对照培养基替代被检培养基进行上述试验。

被检液体培养基管与对照培养基管比较，试验菌应生长良好。

表3沙氏葡萄糖液体培养基适用性检查结果

菌株名称

菌液编号

培养条件

菌株稀释级

沙氏葡萄糖液体培养基

生长状况

结论

白色念珠菌

验证用培养基（A）

对照培养基（B）

结论：

检验人：

检验日期：

复核人：

复核日期：

8.1.2.3R2A琼脂培养基（结果见表4）

取不大于100cfu的铜绿假胞杆菌液及枯草芽孢杆菌液各1ml，分别注入无菌平皿中，立即倾入R2A琼脂样品培养基，每一试验菌株平行制备2个平皿，混匀，凝固，置30~35℃培养120小时，计数。

同时，用相应的对照培养基替代被检培养基进行上述试验。

被检固体培养基上的菌落平均数与对照培养基上的菌落平均数的比值应在0.5~2范围内，且菌落形态大小应与对照培养基上的菌落一致。

表4R2A琼脂培养基计数适用性检查结果

菌种类型

样品培养基（A）

对照培养基（B）

A/B（%）

菌落形态对比

皿1

皿2

平均A

皿1

皿2

平均B

铜绿假胞杆菌

枯草芽孢杆菌

结论：

检验人：

检验日期：

复核人：

复核日期：

8.1.2.4麦康凯液体培养基适用性检查（结果见表5）

促生长能力：

分别接种不大于100cfu的大肠埃希菌于被检培养基和对照培养基中，每株试验菌平行制备2个培养管，至42~44℃培养24小时以下。

与对照管相比较，被检试验菌应生长良好。

抑制能力：

接种不大于100cfu的金黄色葡萄球菌于被检培养基中，至42~44℃培养48小时以上，试验菌应不得生长。

表5麦康凯液体培养基适用性检查结果

培养条件

试验菌液名称

培养基

菌液编号

菌液稀释级

结果

大肠埃希菌

验证用培养基

麦康凯液体培养基

对照培养基

麦康凯液体培养基

金黄色葡萄球菌

验证用培养基

麦康凯液体培养基

对照培养基

麦康凯液体培养基

结论：

检验人：

检验日期：

复核人：

复核日期：

8.1.2.5麦康凯琼脂培养基适用性检查（结果见表6）

促生长能力：

用涂布法分别接种不大于100cfu的大肠埃希菌于被检培养基和对照培养基平板上，每株试验菌平行制备2个平皿，至30~35℃培养18小时以下。

被检培养基与对照培养基上生长的菌落大小、形态特征应一致。

指示能力：

用涂布法分别接种不大于100cfu的大肠埃希菌于被检培养基和对照培养基平板上，至30~35℃培养18小时以下，被检培养基上菌落大小、形态特征、指示剂反应情况等应与对照培养基一致。

表6麦康凯琼脂培养基适用性检查结果

培养条件

试验菌液

名称

培养基

菌液编号

菌液稀释级

结果

大肠埃

希菌

验证用培养基

麦康凯琼脂培养基

对照培养基

麦康凯琼脂培养基

结论：

检验人：

检验日期：

复核人：

复核日期：

8.1.2.6RV沙门菌增菌液体培养基适用性检查（结果见表7）

促生长能力：

分别接种不大于100cfu的乙型副伤寒沙门菌于被检培养基和对照培养基中，每株试验菌平行制备2个培养管，30-35℃培养不大于18小时，与对照管相比较，被检试验菌应生长良好。

抑制能力：

接种不大于100cfu的金黄色葡萄球菌于被检培养基中，30-35℃

培养不少于24小时，测试菌株应不得生长。

表7RV沙门菌增菌液体培养基适用性检查结果

培养条件

试验菌液名称

培养基

菌液编号

菌液稀释级

结果

乙型副伤寒沙门菌

验证用培养基

RV沙门菌增菌液体培养基

对照培养基

RV沙门菌增菌液体培养基

金黄色葡萄球菌

验证用培养基

RV沙门菌增菌液体培养基

对照培养基

RV沙门菌增菌液体培养基

结论：

检验人：

检验日期：

复核人：

复核日期：

8.1.2.7木糖赖氨酸脱氧胆酸盐琼脂培养基适用性检查（结果见表8）

促生长能力：

用涂布法分别接种不大于100cfu的乙型副伤寒沙门菌被检培养基和对照培养基平板上，每株试验菌平行制备2个平皿，至30~35℃培养18小时以下。

被检培养基与对照培养基上生长的菌落大小、形态特征应一致。

指示能力：

用涂布法分别接种不大于100cfu的乙型副伤寒沙门菌于被检培养基和对照培养基平板上，至30~35℃培养18小时以下，被检培养基上菌落大小、形态特征、指示剂反应情况等应与对照培养基一致。

表8木糖赖氨酸脱氧胆酸盐琼脂培养基适用性检查结果

培养条件

试验菌液名称

培养基

菌液编号

菌液稀释级

结果

乙型副伤寒沙门菌

验证用培养基

木糖赖氨酸脱氧胆酸盐琼脂培养基

对照培养基

木糖赖氨酸脱氧胆酸盐琼脂培养基

结论：

检验人：

检验日期：

复核人：

复核日期：

8.1.2.8三糖铁琼脂培养基适用性检查（结果见表9）

指示特性：

用涂布法分别接种不大于100cfu的乙型副伤寒沙门菌于被检培养基和对照培养基平板上，至30~35℃培养18小时以下，被检培养基上菌落大小、形态特征、指示剂反应情况等应与对照培养基一致。

表9三糖铁琼脂培养基适用性检查结果

培养条件

试验菌液名称

培养基

菌液编号

菌液稀释级

结果

乙型副伤寒沙门菌

验证用培养基

三糖铁琼脂培养基

对照培养基

三糖铁琼脂培养基

结论：

检验人：

检验日期：

复核人：

复核日期：

8.1.2.9甘露醇氯化钠琼脂培养基适用性检查（结果见表10）

促生长能力：

用涂布法分别接种不大于100cfu的金黄色葡萄球菌于被检培养基和对照培养基平板上，每株试验菌平行制备2个平皿，至30~35℃培养18小时以下。

被检培养基与对照培养基上生长的菌落大小、形态特征应一致。

指示特性：

用涂布法分别接种不大于100cfu的金黄色葡萄球菌于被检培养基和对照培养基平板上，至30~35℃培养18小时以下，被检培养基上菌落大小、形态特征、指示剂反应情况等应与对照培养基一致。

抑制能力：

接种不大于100cfu的大肠埃希菌于被检培养基中，至30~35℃培养72小时以上，试验菌应不得生长。

表10甘露醇氯化钠琼脂培养基适用性检查结果

培养条件

试验菌液

名称

培养基

菌液编号

菌液稀释级

结果

金黄色葡萄球菌

验证用培养基

甘露醇氯化钠琼脂培养基

对照培养基

甘露醇氯化钠琼脂培养基

大肠埃希菌

验证用培养基

甘露醇氯化钠琼脂培养基

对照培养基

甘露醇氯化钠琼脂培养基

结论：

8.1.3.0溴化十六烷基三甲铵琼脂培养基适用性检查（结果见表11）

促生长能力：

用涂布法分别接种不大于100cfu的铜绿假单胞菌于被检培养基和对照培养基平板上，每株试验菌平行制备2个平皿，至30~35℃培养18小时以下。

被检培养基与对照培养基上生长的菌落大小、形态特征应一致。

抑制能力：

接种不大于100cfu的大肠埃希菌于被检培养基中，至30~35℃培养72小时以上，试验菌应不得生长。

表11溴化十六烷基三甲铵琼脂培养基适用性检查结果

培养条件

试验菌液名称

培养基

菌液编号

菌液稀释级

结果

铜绿假单胞菌

验证用培养基

溴化十六烷基三甲铵琼脂培养基

对照培养基

溴化十六烷基三甲铵琼脂培养基

大肠埃希菌

验证用培养基

溴化十六烷基三甲铵琼脂培养基

对照培养基

溴化十六烷基三甲铵琼脂培养基

结论：

检验人：

检验日期：

复核人：

复核日期：

8.1.3.1胰酪大豆胨琼脂培养基适用性检查（结果见表12）

接种不大于100cfu的金黄色葡萄球菌、铜绿假单胞菌、枯草芽孢杆菌置胰酪大豆胨琼脂培养基，置30~35℃培养不超过3天，白色念珠菌及黑曲霉孢子悬液置胰酪大豆胨琼脂培养基，置30~35℃培养不超过5天；

每一试验菌株平行制备2个平皿；同时，用相应的对照培养基替代被检培养基进行上述试验。

被检固体培养基上的菌落平均数与对照培养基上的菌落平均数的比值应在0.5~2范围内，且菌落形态大小应与对照培养基上的菌落一致。

表12胰酪大豆胨琼脂计数培养基适用性检查结果

培养条件

菌株名称

菌液编号

菌株稀释级

胰酪大豆胨琼脂培养基

菌落数（cfu）

A/B

结论

皿1

皿2

平均

金黄色葡萄球菌

验证用培养基（A）

对照培养基（B）

铜绿假单胞菌

验证用培养基（A）

对照培养基（B）

枯草芽孢杆菌

验证用培养基（A）

对照培养基（B）

白色念珠菌

验证用培养基（A）

对照培养基（B）

黑曲霉

验证用培养基（A）

对照培养基（B）

结论：

检验人：

检验日期：

复核人：

复核日期：

8.1.3.2沙氏葡萄糖琼脂培养基适用性检查（结果见表13）

接种不大于100cfu白色念珠菌菌液及黑曲霉孢子悬液至沙氏葡萄糖琼脂培养基，至20~25℃培养不超过5天，每一试验菌株平行制备2个平皿。

同时，用相应的对照培养基替代被检培养基进行上述试验。

被检固体培养基上的菌落平均数与对照培养基上的菌落平均数的比值应在0.5~2范围内，且菌落形态大小应与对照培养基上的菌落一致。

表13沙氏葡萄糖琼脂培养基适用性检查结果

培养条件

菌株名称

菌液编号

菌株稀释级

沙氏葡萄糖琼脂培养基

菌落数（cfu）

A/B

结论

皿1

皿2

平均

白色念珠菌

验证用培养基（A）

对照培养基（B）

黑曲霉

验证用培养基（A）

对照培养基（B）

结论：

检验人：

检验日期：

复核人：

复核日期：

9.菌种

采用符合来自认可的国内外菌种保藏机构的标准菌株，参照检定菌管理规程XYK/SMP-QC0015、USP40药典通则61、USP40药典通则62，进行菌种复苏、传代、保存、菌液制备、菌落计数及销毁，填写XYK/REC-QC031菌种接收XYK/REC-QC034菌种发放领用记录，XYK/REC-QC032菌种传代记录，YK/REC-QC035菌种计数检查记录，XYK/REC-QC036菌悬液制备和使用记录，XYK/REC-QC033菌种保存检查记录，XYK/REC-QC036菌种、培养基、菌悬液销毁记录。

表14菌种息概况

菌种名称

斜面编号

菌液编号

菌液制备日期

枯草芽孢杆菌

金黄色葡萄球菌

铜绿假单胞菌

大肠埃希菌

乙型副伤寒沙门菌

白色念珠菌

黑曲霉

9.1菌液制备

将金黄色葡萄球菌、铜绿假单胞菌、枯草芽孢杆菌、大肠埃希菌乙型副伤寒沙门菌分别接种于胰酪大豆胨液体培养基中或在胰酪大豆胨琼脂培养基上，30-35℃培养18〜24小时；将白色念珠菌、黑曲霉接种于沙氏葡萄糖琼脂培养基上或沙氏葡萄糖液体培养基中，20-25℃培养2〜3天。

取新鲜的大肠埃希菌、金黄色葡萄球菌、铜绿假单胞菌、枯草芽孢杆菌、白色念珠菌、乙型副伤寒沙门菌新鲜培养物，用pH7.0无菌氯化钠-蛋白胨缓冲液制成适宜浓度的菌悬液；取黑曲霉的新鲜培养物加入3~5ml含0.05%聚山梨酯80的pH7.0无菌氯化钠-蛋白胨缓冲液，将孢子洗脱。

然后采用适宜的方法吸出孢子悬液至无菌试管内，用含0.05%聚山梨酯80的pH7.0无菌氯化钠-蛋白胨缓冲液制成适宜浓度的黑曲霉孢子悬液。

做活菌计数备用。

9.2、菌落计数

金黄色葡萄球菌、铜绿假单胞菌、枯草芽孢杆菌、大肠埃希菌、乙型副伤寒沙门菌：

取上述制备的备用菌液三个稀释级各1ml，分别注入平皿中，再在每皿中加入不高于45℃的胰酪大豆胨琼脂培养基约20ml，每株菌每稀释级平行测定两皿，30~35℃培养不超过3天，计数，选择菌落数小于100cfu的稀释级菌液试验（结果见表15）

白色念珠菌、黑曲霉菌液：

取上述制备的白色念珠菌菌液、黑曲霉孢子悬液备用的三个稀释级各1ml，分别注入平皿中，再在每皿中加入不高于45℃的胰酪大豆胨琼脂培养基约20ml，每株菌每稀释级平行测定两皿，30~35℃培养不超过5天，计数，选择菌落数小于100cfu的稀释级菌液试验（结果见表15）。

白色念珠菌、黑曲霉菌液：

取上述制备的白色念珠菌菌液、黑曲霉孢子悬液备用的三个稀释级各1ml，分别注入平皿中，再在每皿中加入不高于45℃的沙氏葡萄糖琼脂培养基约20ml，每株菌每稀释级平行测定两皿，20~25℃培养不超过5天，计数，选择菌落数小于100cfu的稀释级菌液试验（结果见表15）。

表15菌落计数结果表

试验菌名称

培养基名称

菌液编号

培养条件

菌液稀释级

选用稀释级

10-5

10-6

10-7

皿1

皿2

平均

皿1

皿2

平均

皿1

皿2

平均

金黄色葡萄球菌

胰酪大豆胨琼脂培养基

铜绿假单胞菌

胰酪大豆胨琼脂培养基

枯草芽孢杆菌

胰酪大豆胨琼脂培养基

大肠埃希菌

胰酪大豆胨琼脂培养基

白色念珠菌

胰酪大豆胨琼脂培养基

黑曲霉

胰酪大豆胨琼脂培养基

白色念珠菌

沙氏葡萄糖琼脂培养基

黑曲霉

沙氏葡萄糖琼脂培养基

乙型副伤寒沙门菌

胰酪大豆胨琼脂培养基

结论：

检验人：

日期：

复核人：

日期：

10.纯化水计数方法适用性试验

10.1供试品制备

取供试品10ml,加pH7.0无菌氯化钠-蛋白胨缓冲液至100ml.振摇混匀。

10.2接种和稀释

（1）试验组取1:

10的供试液（相当于1ml供试品）10ml，加至薄膜过滤器中，过滤并用冲洗液冲洗滤膜1次，每次100ml，在最后一次冲洗液中加入0.1ml（不大于1000cfu）菌悬液，过滤完后，将滤膜取出，菌面朝上贴于已凝固的培养基上。

铜绿假单胞菌、枯草芽孢杆菌贴于R2A琼脂培养基平板上

（2）供试品对照组取制备好的供试液，以稀释液代替菌液同试验组操作。

（3）菌液对照组取10ml稀释液加至薄膜过滤器中,分别加试验菌液0.1ml（不大于1000cfu），过滤并用稀释液冲洗滤膜3次，每次100ml，过滤完后，将滤膜取出，菌面朝上贴于已凝固的培养基上。

铜绿假单胞菌、枯草芽孢杆菌、贴于R2A琼脂培养基平板上；

（4）阴性对照组除用稀释液代替菌液外。

其他操作同菌液对照组。

10.3培养

测定需氧菌总数的R2A琼脂培养基置于30~35℃培养不少于5天

10