实验操作技术规范编写.docx
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实验操作技术规范编写
细胞生物学实验操作规范
目录
一、显微操作技术：
3
二、细胞培养技术：
3
第一章细胞培养基础3
1.细胞培养基本概念：
3
2.细胞培养的环境3
3.细胞培养设施和基本条件4
无菌操作技术要领5
4.培养用品的清洗与消毒6
第二章细胞培养液11
第一节水与平衡盐溶液12
第二节细胞培养基的基本要求12
第三节天然细胞培养基13
第四节干粉培养基的配制18
第五节无血清技术及其培养基18
第六节其他细胞培养用液21
第三章细胞培养的基本方法23
第一节培养细胞的细胞生物学23
第二节细胞分离技术30
第三节细胞的冻存与复苏32
第四节细胞计数及活力测定35
第五节培养物的污染及防止36
三、制片技术：
40
1.载玻片和盖玻片的使用40
2.切片技术（徒手切片）：
41
3.压片技术：
42
4.涂片技术：
42
5.滴片技术：
43
6.装片技术44
四、染色技术44
一、线粒体和液泡系的超活染色与观察44
二、DNA-Feulgen染色46
三、台盼蓝染色47
四、DAPI染色47
五、参考文献47
一、显微操作技术：
二、细胞培养技术：
第一章细胞培养基础
1.细胞培养基本概念：
细胞培养是指从体内组织取出细胞模拟体内环境，在无菌、适当温度及酸碱度和一定营养条件下，使其生长繁殖，并维持其结构和功能的一种培养技术。
细胞培养的培养物为单个细胞或细胞群。
在医学遗传学研究中应用最广泛的是外周血淋巴细胞、皮肤成纤维细胞和各种能在体外长期生长的细胞系。
外周血淋巴细胞培养具有时间短、技术简便、可重复取材等优点，它在临床染色体分析中使用最广泛。
体外培养细胞株可在培养过程中发生自发的或在外界作用下的转化，成为永久细胞系，也可直接建成永久细胞系，永久细胞系能在体外无限制制的传代和生长。
永久细胞系通常具有非整倍体细胞和各个细胞的核型不完全相同特征。
但细胞克隆的细胞系其这一特征可以不明显。
2.细胞培养的环境
细胞在体外培养中所需的条件与体内细胞基本相同。
1、无污染环境
培养环境无毒和无菌是保证细胞生存的首要条件。
当细胞放置于体外培养时，与体内相比细胞丢失了对微生物和有毒物的防御能力，一旦被污染或自身代谢物质积累等，可导致细胞死亡。
因此在进行培养中，保持细胞生存环境无污染、代谢物及时清除等，是维持细胞生存的基本条件。
2、恒定的温度
维持培养细胞旺盛生长，必须有恒定适宜的温度。
人体细胞培养的标准温度为36.5℃±0.5℃，偏离这一温度范围，细胞的正常代谢会受到影响，甚至死亡。
培养细胞对低温的耐受力较对高温强，温度上升不超过39℃时，细胞代谢与温度成正比；人体细胞在39-40℃1小时，即能受到一定损伤，但仍有可能恢复；在40-41℃1小时，细胞会普遍受到损伤，仅小半数有可能恢复；41-42℃1小时，细胞受到严重损伤，大部分细胞死亡，个别细胞仍有恢复可能；当温度在43℃以上1小时，细胞全部死亡。
3、气体环境
气体是人体细胞培养生存必需条件之一，所需气体主要有氧气和二氧化碳。
氧气参与三羧酸循环，产生供给细胞生长增殖的能量和合成细胞生长所需用的各种成分。
开放培养时一般把细胞置于95%空气加5%二氧化碳混合气体环境中。
二氧化碳既是细胞代谢产物，也是细胞生长繁殖所需成分，它在细胞培养中的主要作用在于维持培养基的PH值。
大多数细胞的适宜PH为7.2-7.4，偏离这一范围对细胞培养将产生有害的影响。
但细胞耐酸性比耐碱性大一些，在偏酸环境中更利于细胞生长。
有资料显示，原代羊水细胞培养PH6.8时最适。
细胞培养液PH浓度的调节最常用的为加NaHCO3的方法，因为NaHCO3可供CO2，但二氧化碳易于逸出，故最适用于封闭培养，而羟乙基哌嗪乙硫磺酸（HEPES）因其对细胞无毒性，也起缓冲作用，有防止PH迅速变化的特性而用于开放细胞培养技术中，其最大优点是在开放式培养或细胞观察时能维持较恒定的PH值。
4、细胞培养基
培养是既是培养细胞中供给细胞营养和促使细胞生殖增殖的基础物质，也是培养细胞生长和繁殖的生存环境。
培养基的种类很多，按其物质状态分为半固体培养基和液体培养基两类；按其来源分为合成培养基和天然培养基。
（1）合成培养基：
合成培养基是根据细胞所需物质的种类和数量严格配制而成的。
内含碳水化合物、氨基酸、脂类、无机盐、维生素、微量无素和细胞生长因子等。
单独使用细胞虽有生存但不能很好的生长增殖。
（2）天然培养基：
使用最普遍的天然培养基是血清，基本以小牛血清最普遍。
血清由于含有多种细胞生长因子、促粘附因子及其多种活性物质。
与合成培养基合用，能使细胞顺利增殖生长。
常见使用最为5-20%。
3.细胞培养设施和基本条件
1、实验室设计
细胞培养是一种无菌操作技术，要求工作环境和条件必须保证无微生物污染和不受其它有害因素的影响。
细胞培养室和设计原则是防止微生物污染和有害因素影响，要求工作环境清洁、空气清新，干燥和无烟尘。
细胞培养工作包括：
工作液配制、无菌操作（采样）、温育、无菌处理，细胞和用品贮存等。
细胞培养室的设计实施原则一般是无菌操作区设在室内较少走动的内侧，常规操作和封闭培养于一室，而洗刷消毒在另一室。
2、常用设施及设备
（1）超净工作台：
也称净化工作台，分为侧流式、直流式和外流式三大类。
（2）无菌操作间：
一般由更衣间、缓冲间和操作间三部分组成。
操作间放置净化工作台及二氧化碳培养箱、离心机、倒置显微镜等。
缓冲间可放置电冰箱、冷藏器及消毒好的无菌物品等。
无菌操作技术要领：
由于体外培养的细胞缺乏机体抗感染功能，所以在每一步操作中要尽量做到最大限度无菌操作，防止污染。
1.培养前准备
穿好灭菌的工作服，根据实验内容的要求，准备好已消毒干燥的所需用品，清点无误后按方便使用的原则布置在超净工作台内。
2.超净工作台消毒
在进行实验操作前，打开紫外线杀菌灯照射消毒20~30min，然后关闭紫外灯，打开风机，流入的空气是经过除菌板过滤的空气。
为防止培养细胞和培养液等受到紫外线照射，消毒前应预先放在带盖容器内或在消毒后放入。
3.洗手
洗净双手，然后用0.2%新洁尔灭或用75%乙醇擦拭。
4.火焰消毒
在超净工作台中操作时，首先要点燃酒精灯，此后一切操作如安装吸管橡皮球、打开或加盖瓶塞、使用玻璃吸管等都要经过火焰并在靠近火焰处进行。
5.操作
进行培养操作时动作要准确敏捷。
不能用手触及器皿的消毒部分。
酒精灯置于超净工作台中央。
培养液等不要过早开瓶，打开的培养液和培养用瓶等应保持斜立或平放，长时间开口直立则易增加落菌机会。
吸取各种用液的吸管均不要混用，以减少感染的机会。
（3）操作间：
普通培养箱、离心机、水浴锅、定时钟、普通天平及日常分析处理物品。
（4）洗刷消毒间：
烤箱、消毒锅、蒸馏水处理器及酸缸等。
（5）分析间：
显微镜、计算机及打印机等。
3、培养器皿
细胞培养以玻璃器皿为主，常准备最需使用量的三倍。
器皿应选择透明度好、无毒、中性硬度玻璃制品。
常用的玻璃器皿有下面几种。
（1）液体储存瓶：
用于储存各种配制好的培养液、血清等液体，常以500ml、250ml、100ml生理盐水瓶或血浆瓶代替。
（2）培养瓶：
根据培养细胞种类要求不同培养瓶的形态各异，用于细胞传代培养的细胞要求瓶壁厚簿均匀，便于细胞贴壁生长和观察，瓶口要大小一致，口径一般不小于1cm，允许吸管伸入瓶内任何部位，规格有200ml、100ml、50ml、25ml、10ml等几种。
用于外周血培养的常用10ml普通圆瓶。
两种培养瓶均要求选用优质玻璃制成。
（3）培养皿：
用于开放式培养及其它用途。
分直径30mm、60mm、120mm等几种。
（4）吸管：
常用的有长吸管和短吸管两类，长吸管也称刻度吸管。
其改良后管上部有球型刻度称改良吸管，刻度吸管用于移动液体。
常用1ml和10ml两种。
短吸管也叫滴管，分弯头和直头两种。
（5）离心管：
离心管是细胞培养中使用最广泛的器皿，根据用途不同形态各样，常用于细胞培养的离心管有大腹式尖底离心管和普通尖底离心管两类。
前者分别为50ml、30ml、15ml；后者则多为10ml和5ml。
（6）其它：
如三角烧瓶、烧杯、量筒、漏斗、注射器等。
4.培养用品的清洗与消毒
目前我国细胞培养器皿主要仍使用能反复使用的玻璃器皿，清洗的主要目的为清除杂质和微生物，使在器皿内不残留任何影响细胞生长的成份。
因而在组织细胞培养中清洗和消毒是一项极为重要的环节。
（一）清洗
在组织细胞培养中，体外细胞对任何有害物质都非常敏感。
微生物产品附带杂物，上次细胞残留物及非营养成分的化学物质，均能影响培养细胞的生长。
因此对新使用和重新使用的培养器皿都要严格彻底的清洗，且要根据器皿的组成材料不同，选择不同的清洗方法。
1、玻璃器皿的清洗
组织细胞培养中，使用量最大的是玻璃器皿，故工作最最大的是玻璃器皿的清洗。
一般玻璃器皿的清洗包括浸泡、刷洗、浸酸和冲洗四个步骤。
清洗后的玻璃器皿仅要求干净透明无油迹，而且不能残留任何物质。
（1）浸泡：
初次使用和培养使用后的玻璃器皿均需先用清水浸泡，以使附着物软化或被溶解掉。
新的初次使用的玻璃器皿，在生产及运输过程中，玻璃表面带有大量的干固的灰尘，且玻璃表面常呈碱性及带有一些对细胞有害的物质等。
新瓶使用前应先用自来水简单刷洗，然后用稀盐酸液浸泡过夜，以中和其中的碱性物质。
再次使用的玻璃器皿则常附有大量刚使用过的蛋白质，干固后不易洗掉，故用后要立即浸入水中，且要求完全浸入，不能留有气泡或浮在液面上。
（2）刷洗：
浸泡后的玻璃器皿一般要用毛刷沾洗涤剂刷洗，以除去器皿表面附着较牢的杂质。
刷洗要适度，过度会损害器皿表面光泽度。
（3）浸酸：
清洁液是由重铬酸钾、浓硫酸和蒸馏水按一定比例配制而成，其处理过程称为浸酸。
清洁液对玻璃器皿无腐蚀作用，而其强氧化作用可除掉刷洗不掉的微量杂质。
清洁液去污能力很强。
是清洗过程中关键的一环。
浸泡时器皿要充满清洁液，勿留气泡或器皿露出清洁液面。
浸泡时间一般为过夜，不应少于6小时。
清洁液可根据需要，配制成不同的强度，常用的下列三种：
重铬酸钾（g）浓硫酸（ml）蒸馏水（ml）
（A）强清洁液631000200000
（B）次强清洗液1202001000
（C）弱清洁液100100100
清洁液配制时应注意安全，须穿戴耐酸手套和围裙，并要保护好面部及身体裸露部分。
配制过程中可使重铬酸钾溶于水中，然后慢慢加浓硫酸。
并不停的用玻璃棒搅拌，使产生的热量挥发。
配制溶液应选择塑料制品。
配成后清洁液一般为棕红色。
（4）冲洗：
玻璃器皿在使用后，刷洗及浸泡后都必须用水充分冲洗。
使之尽量不留污染或洁液的残迹。
冲洗最好用洗涤装置，既省力，效果又好。
如用手工操作，则需流水冲洗十次以上，每天水须灌满及倒干净，最好用蒸馏水清洗3-5次，晾干备用。
2、胶塞的清洗
细胞培养中所用的橡胶制品主要是瓶塞。
新购置的瓶塞带有大量滑石粉及杂质，应先用自来水冲洗，再做常规处理，常规清洗方法是：
每次用后立即置入水中浸泡，然后用2%NaOH或洗衣粉煮沸10-20分钟，以除掉培养中的蛋白质。
自来水冲洗后，再用1%稀盐酸浸泡30分钟或蒸馏水冲洗后再煮沸10-20分钟，晾干备用。
3、塑料制品的清洗
塑料制品现多是采用无毒并已经特殊处理的包装，打开包装即可用，多为一次性物品。
必要时用2%NaOH浸泡过夜，用自来水充分冲洗，再用5%盐酸溶液浸泡30分钟，最后用自来水和蒸馏水冲洗干净，晾干备用。
（二）消毒
细胞培养的最大危险是发生培养物的细菌，真菌和病毒等微生物的污染，污染主要是由于操作者的疏忽而引起，常见的原因有操作间或周围空间的不洁，培养器皿和培养液消毒不合格或不彻底，由于有关培养的每个环节的失误均能导致培养失败，故细胞培养的每个环节都应严格遵守操作常规，防止发生污染。
消毒方法分为三类：
（A）物理灭菌法（紫外线、湿热、过渣等）（B）化学灭菌法（各种化学消毒剂）（C）抗生素
物理灭菌法：
（1）紫外线消毒：
用于空气，操作台表面和不能使用其它法进行消毒和培养器皿。
紫外线直接照射方便、效果好，经一定的时间照射后，可以消灭空气中大部分细菌，培养室紫外线灯应距地面不超过2.5米，且消毒进物品不宜相互遮档，照射不到的地方起不到消毒作用。
紫外线可产生臭氧，污染空气，试剂及培养液都有不良影响，对人皮肤也有伤害，不宜近照射及同时进行实验操作。
超净工作台工作原理：
鼓风机驱动空气通过高效过滤器得以净化，净化的空气被徐徐吹过台面空间而将其中的尘埃、细菌甚至病毒颗粒带走，使工作区构成无菌环境。
根据气流在超净工作台的流动方向不同，可将超净工作台分为侧流式、直流式和外流式三种类型。
超净台的使用与保养：
超净台的平均风速保持在0.32-0.48米/秒为宜，过大、过小均不利于保持净化度；使用前最好开启超净台内紫外灯照射10－30分钟，然后让超净台预工作10－15分钟，以除去臭氧和使用工作台面空间呈净化状态；使用完毕后，要用70%酒精将台面和台内四周擦拭干净，以保证超净台无菌。
还要定期用福尔马林熏蒸超净台。
（2）温热消毒：
即高压蒸气消毒，是一种使用最广泛、效果最好的消毒方法。
布类衣物、玻璃器皿、金属器械、胶塞、某些培养液体都可以使用该方法灭菌。
原理是通过高温高压和蒸汽良好的穿透力，使菌体蛋白质凝固变性而死亡。
温热消毒时，消毒物品不能装得过满，以防止消毒器内气体阻塞而发生危险，保证其内气体的流通。
在加热升压之前，先要打开排气阀门排放消毒器内的冷空气，冷气空气排出后，关闭排气阀门，同时检验安全阀活动自如，继后开始升压，当达到所需压力时，开始计算消毒时间。
消毒过程中，操作者不能离开工作岗位，要定时检查压力及安全，防止消毒及意外事件发生。
注意事项：
1）.保证灭菌锅内有水；
2）.物品不要超过消毒筒体积的80％，物品之间要留有空隙，液体容器应该在瓶塞上插入一个5#或者7#针头，或者在玻璃塞和瓶口间夹一个纸条，以平衡内外的气压；
3）.水沸腾后，应该排气15分钟；
4）.将需要的压力维持一定的时间。
5）.排气要缓慢进行，尤其有液体存在时
不同压力蒸汽所达到的温度
压力（磅）温度（℃）
5108.4
10115.2
15121.0
20126.0
25130.4
30134.5
（3）过滤除菌
原理：
将液体或者气体用具有微孔的薄膜过滤，使大于孔径的细菌等微生物颗粒被阻留，从而达到除菌的目的。
适用：
用于遇热容易发生变性而失效的试剂或者培养用液，如人工培养基、小牛血清、胰蛋白酶等。
分类：
负压过滤和正压过滤。
正压过滤具有流速高、过滤快、不易污染。
避免形成气泡等优点。
滤膜直径25mm的针头滤器，适合过滤100ml以下的少量液体。
化学方法消毒：
利用化学消毒剂来对那些物理方法难以奏效的物品、场地、皮肤等进行消毒。
常用的有乳酸、甲醛、环氧乙烷、乙醇、氯己定、戊二醛、碘伏等。
此外市场上适用的化学消毒剂，如“84”等，均可以用于地面、台面的消毒。
化学消毒法操作简单、方便有效。
1.乳酸
使用方法：
关闭门窗，将乳酸（0.03-0.04ml/m3）放入甘锅中加热熏蒸，时间30分钟。
2.甲醛（methylaldehyde）
甲醛是广谱灭菌剂，水溶液和气体对于各种细菌、芽孢和真菌都有杀灭作用。
使用方法：
1）.多聚甲醛加热法。
将多聚甲醛研成粉末，均匀铺开在金属板上，加热到150℃以上就会产生甲醛气体。
用量10-20g/M2，时间12-24h
2）.福尔马林加热法：
将40％的甲醛溶液（福尔马林）在蒸发皿中加热蒸发。
用量25ml/M2，时间12-24h
3.氧化法：
将高锰酸钾（或者漂白粉）放入一个平皿内，倒入甲醛溶液，即可释放出甲醛气体。
甲醛溶液的用量：
40ml/M2，高锰酸钾30g/M2，时间12-24h
甲醛熏蒸注意事项：
甲醛气体的穿透力差，熏蒸前应该暴露物体表面，打开橱门，摊开或者挂起物品。
温度18℃，湿度70％。
甲醛对人有害，应该等气体散净后再进入室内工作。
3.环氧乙烷（ethypeneoxide）
具有广泛的杀菌作用，不损害物品，穿透力将。
用途：
消毒塑料制品以及不耐高温、不耐潮湿的物品。
（塑料培养瓶、培养板、布料等）
方法：
将物品放置于灭菌袋中，充入环氧乙烷气体，10分钟后，再充满一次。
于25-30℃维持12h。
注意：
环氧乙烷易燃易爆，有毒，注意防火。
不可用于空气消毒。
4.煤酚皂溶液
2％溶液刷洗地面、桌凳墙壁、天花板。
5.乙醇（ethanol）
广泛应用的消毒剂，效果可靠，对其他灭菌剂如戊二醛、碘伏、氯己定等有增效或者协同作用。
挥发性好，常用于需要快速发挥作用而不必长时间等待的消毒。
手、手术野、台面、物体表面等等。
先将手用肥皂和流水洗3次，用70-75％乙醇浸泡5分钟。
操作中手或者器械等触及怀疑有污染的物品后，用酒精棉球擦拭消毒。
动物的体表用碘酒消毒后，用70％的酒精消毒2-3次，每次20-30秒钟。
70％酒精可以用来消毒台面、桌面、仪器和物品的表面。
乙醇不能杀死芽孢；会使长期浸泡于酒精的橡胶和塑料制品变硬；取材的物品不宜用乙醇浸泡。
6.氯己定（hibitane）
1，6－双己烷，广谱杀菌剂。
毒性低，刺激性小，不产生耐药性，主要用于皮肤及创面的消毒。
0.02％的水溶液用于手部消毒（浸泡3分钟）及动物创面的消毒，0.5％乙醇溶液（70％配制）用于擦手消毒和动物取材时皮肤的消毒。
7.戊二醛（glutaraldehyde）
广谱高效的灭菌剂，具有水溶液稳定，对金属腐蚀性小，低毒安全等优点。
2％戊二醛碱性稀释液：
2％（v/v）的戊二醛水溶液中，加入0.3％（w/v）的NaCO3，pH＝7.5-8.5，另外加入0.5％亚硝酸钠可以防锈和增效。
对金属、温度计、橡皮、塑料管等浸泡30min就可灭菌，然后用水冲净。
8.碘伏与碘酊
碘伏（iodophor）：
PVP—I，快速杀死细菌、芽孢、真菌、病毒等。
用于手部消毒和手术野的消毒。
碘酊（碘酒）：
2％（w/v），用于手术皮肤消毒，消毒后需要用酒精脱碘。
抗生素消毒：
确切应记成抗生素灭菌，主要用于培养用液灭菌或预防培养物污染。
可用于细胞培养的消毒灭菌方法很多，但每种方法都有一定的适应范围。
如常用的过滤除菌系统、紫外照射、电子杀菌灯、乳酸、甲醛熏蒸等手段消毒实验室空气；多用新洁而灭消毒实验室地面；常用干热、湿热消毒剂浸泡、紫外照射等方法消毒培养用器皿；采用高压蒸汽灭菌或过滤除菌方法消毒培养液。
第二章细胞培养液
现代生物技术均通过细胞作为载体来进行，无论是基因治疗、干细胞、克隆技术都在细胞内进行的。
细胞的生长需要一定的营养环境，用于维持细胞生长的营养基质称为培养基，即指所有用于各种目的的体外培养、保存细胞用的物质，就其本意上讲为人工模拟体内生长的营养环境，使细胞在此环境中有生长和繁殖的能力。
它是提供细胞营养和促进细胞生长增殖的物质基础。
细胞培养基其组成成分主要有：
水、氨基酸、维生素、碳水化合物、无机离子及其他一些入核酸降解物、激素等。
随着动物细胞大规模培养技术的迅速发展，作为细胞培养领域中最基本的原料－细胞培养基的用量也迅速增加，被广泛应用于细胞生物学科和医学研究的各个领域，如疫苗生产（人用疫苗如乙脑、狂犬、甲肝、乙肝、出血热、麻疹等，兽用疫苗如口蹄、马立克、伪狂犬等），基因药物生产（如EPO、TPA等），临床用单抗（如抗人肝癌单抗、抗人肺单抗、WT3）等。
第一节水与平衡盐溶液
1、培养用水：
体外培养的细胞对水质特别敏感，对水的纯度要求较高。
培养用水中如果含有一些杂质，即使含量极微，有时也会影响细胞的存活和生长，甚至导致细胞死亡。
用金属蒸馏器制备的蒸馏水，可能会含有某些金属离子，一般不作为培养用水。
配制培养用液应使用经石英玻璃蒸馏器三次蒸馏的三蒸水或超纯水净化装置制备的超纯水。
最好用龙头瓶贮存，存放时间一般不应超过2周。
2、缓冲溶液、生理盐水、平衡盐溶液：
稍后介绍。
第二节细胞培养基的基本要求
体外培养的细胞直接生活在培养基中，因此培养基应能满足细胞对营养成分、促生长因子、激素、渗透压、pH等诸多方面的要求。
一、营养成分维持细胞生长的营养条件一般包括以下几个方面：
1、氨基酸：
是细胞合成蛋白质的原料。
所有细胞都需要12种必须氨基酸：
缬氨酸、亮、异亮、苏、赖、色、苯丙、蛋、组、酪、精氨酸、胱氨酸。
此外还需要谷氨酰胺，它在细胞代谢过程中有重要作用，所含的氮是核酸中嘌令和嘧啶合成的来源，同样也是合成三、二、一磷酸酰苷所需要的基本物质。
体外培养的各种培养基内都含有必需氨基酸。
2、单糖：
培养中的细胞可以进行有氧与无氧酵解，六碳糖是主要能源。
此外六碳糖也是合成某些氨基酸、脂肪、核酸的原料。
细胞对葡萄糖的吸收能力最高，半乳糖最低。
体外培养动物细胞时，几乎所有的培养基或培养液中都以葡萄糖作为必含的能源物质。
3、维生素：
主要扮演辅酶、辅基的角色，必不可少。
生物素、叶酸、烟酰胺、泛酸、吡哆醇、核黄素、硫胺素、维生素B12都是培养基常有的成分。
4、无机离子与微量元素：
细胞生长除需要钠、钾、钙、镁、氮和磷等基本元素，还需要微量元素，如铁、锌、硒、铜、锰、钼、钒等。
二、促生长因子及激素已证实：
各种激素、生长因子对于维持细胞的功能、保持细胞的状态（分化或未分化）具有十分重要的作用。
有些激素对许多细胞生长有促生长作用，如胰岛素，它能促进细胞利用葡萄糖和氨基酸。
有些激素对某一类细胞有明显促进作用，如氢化可的松可促进表皮细胞的生长，泌乳素有促进乳腺上皮细胞生长作用等。
三、渗透压细胞必须生活在等渗环境中，大多数培养细胞对渗透压有一定耐受性。
人血浆渗透压290mOsm/kg,可视为培养人体细胞的理想渗透压。
鼠细胞渗透压在320mOsm/kg左右。
对于大多数哺乳动物细胞，渗透压在260－320mOsm/kg的范围都适宜。
四、pH气体也是细胞生存的必需条件之一，所需气体丰要是氧和二氧化碳。
氧参与三羧酸循环，产生能量供给细胞生长、增殖和合成各种成分。
一些细胞在缺氧情况下，借糖酵解也可获取能量，但多数细胞缺氧不能生存。
在开放培养时，一般置细胞于95％空气加5％二氧化碳的混合气体环境中培养。
二氧化碳既是细胞代谢产物，也是细胞所需成分，它主要与维持培养基的pH有直接关系。
动物细胞大多数需要轻微的碱性条件，pH值约在7．2~7．4℃在细胞生长过程中，随细胞数量的增多和代谢活动的加强，二氧化碳不断被释放，培养液变酸，PH值发生变化。
由于NaHCO3容易分解为二氧化碳，很不稳定，致使缓冲系统难以精确地控制。
故这一缓冲系统适合密闭培养。
HEPES结合碳酸氢钠使用，可提供更有效的缓冲体系，主要是防止pH值迅速变动，但最大缺点是在开放培养或观察时难以维持正常的pH值。
造成pH波动主要是代谢产生的CO2，在封闭式培养过程中CO2与水结合产生碳酸，培养基pH很快下降。
为解决这一问题，合成培养基中使用了NaHCO3-CO2缓冲系统，并采用开放培养，使细胞代谢产生的CO2及时溢出培养瓶，再通过稳定调节温箱中CO2浓度（5％），与培养基中的NaHCO3处于平衡状态。
五、无毒、无污染体外生长的细胞对微生物及一些有害有毒物质没有抵抗能力，因此培养基应达到无化学物质污染、无微生物污染（如细菌、真菌、支原体、病毒等）、无其他对细胞产生损伤作用的生物活性物质污染（如抗体、补体）。
对于天然培养基，污染主要来源于取材过程及生物材料本身，应当严格选材，严格操作。
对于合成培养基，污染主要来源于配制过程，配制所用的水，器皿应十分洁净，配制后应严格过滤除菌。
第三节天然细胞培养基
天然培养基是指来自动物体液或利用组织分
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