分子生物学检测技术概述.docx
《分子生物学检测技术概述.docx》由会员分享，可在线阅读，更多相关《分子生物学检测技术概述.docx（12页珍藏版）》请在冰豆网上搜索。
分子生物学检测技术概述
分子生物学检测技术
分子生物学诊断技术是现代分子生物学与分子遗传学取得巨大进步的结晶，是在人们对基因的结构以及基因的表达和调控等生命本质问题的认识日益加深的基础上产生的。
近年来，分子生物学诊断技术的方法学研究取得了很大进展，先后建立了限制性内切酶酶谱分析、核酸分子杂交、限制性片段长度多态性连锁分析等方法。
1985年由美国Cetus公司人类遗传学研究室Mullis等创立并随后迅速发展起来的DNA体外扩增技术（PolymeraseChainReaction,PCR），以及90年代发展起来的DNA芯片技术（DNAChip），又将分子生物学诊断技术提高到一个崭新的阶段。
一、核酸分子杂交
（一）概述：
具有一定互补序列的核苷酸单链在液相或固相中按碱基互补配对原则缔合成异质双链的过程叫核酸分子杂交。
应用该技术可对特定DNA或RNA序列进行定性或定量检测。
到目前为止，分子杂交技术在基因诊断中仍占重要地位，它按反应支持物可分为固相杂交和液相杂交两种，前者应用较广，有Southern印迹杂交、点杂交、夹心杂交（三明治杂交）、原位杂交和寡核苷酸探针技术等。
核酸分子杂交主要涉及两个方面：
待测的DNA或RNA，以及用于检测的DNA或RNA探针。
探针标记的好坏决定检测的敏感性。
1、Southern印迹杂交
是最经典和应用最广泛的杂交方法。
根据基因探针与待测DNA限制酶酶解片段杂交的带谱，可以直接确定宿主基因的缺陷所在或病原体的存在状态。
2、Northern印迹杂交
基本原理与Southern印迹杂交相同，不同的是它检测mRNA而不是DNA，因此可分析和了解基因的表达状态。
由于mRNA比DNA更易受到各种因素的降解，所以整个操作过程须特别小心。
3、斑点杂交
将待测DNA或细胞裂解物变性后直接点在硝酸纤维素膜上（无需限制酶酶解），与探针进行杂交反应。
该技术对于基因拷贝数多的样品很适合，具有简捷快速的特点，一次可做大批量样品的筛查，适于流行病学调查和感染性疾病外源性致病基因的检测。
目前斑点杂交技术在各实验室中得到较普及的应用。
该技术可用来分析待测核酸片段中是否存在与探针同源的序列，同时还可半定量反映样品中的模板含量。
其原理包括将提取的核酸片段变性后转移并固定于支持膜上，通过预杂交以除去非特异位点，然后以标记探针进行杂交。
标记物有多种，以同位素标记的探针杂交后，可通过放射自显影分析结果，而以非同位素（如生物素、地高辛等）标记的探针杂交后，需加入对应的酶标记物（如亲和素、地高辛抗体），再经过显色反应后，利用光密度扫描仪进行量化检测。
本方法特异性可靠，但灵敏度偏低，而且操作复杂，因此大大限制了该技术的普及应用。
4、分支链DNA（bDNA）技术
近几年，bDNA作为核酸直接量化检测技术已广泛应用于HBV、HCV和HIV等的研究。
该方法主要是通过将磷酸化的捕获探针以共价键的形式结合在固相载体上，然后依次加入待测核酸和悬挂有多个支链的信号探针进行杂交，每个支链DNA都结合有放大信号的分子（如碱性磷酸酶），最后通过利用化学发光检测核酸的含量。
bDNA技术是目前核酸直接量化检测技术中灵敏度最高的方法之一。
但该方法成本较高，不利于其普及应用。
5、原位杂交
直接在组织切片或细胞涂片上进行杂交反应。
该技术可检出细胞中单拷贝mRNA，估算病毒在宿主细胞中复制和转录的程度，对于病毒感染（特别是具有长潜伏期的病毒感染）和其它退行性疾病的诊断很有用。
6、液相杂交
液相杂交酶免疫法量化检测核酸扩增产物这种方法同固相杂交量化检测核酸扩增产物原理大致相同，只是将反应体系换为液相环境。
应用液相杂交量化检测维生素D结合蛋白基因，在PCR扩增时通过掺入法使产物上挂有地高辛分子，再通过液相杂交与标记有生物素的探针结合后，被包被有链亲和素的酶标微孔板捕获，利用辣根酶标记的地高辛抗体使酶反应底物（OPD或TMB）显色。
据报道，核酸扩增产物与特异性探针在液相中的杂交效率要高于在酶标微孔板上的结合，液相杂交的灵敏度通常是固相杂交的10～20倍，可以检测到pg水平。
二、聚合酶链反应（PCR）
PCR是近年来发展起来的一种快速的DNA片段扩增技术，它通过分别与双链目的DNA序列两个3’端互补的寡核苷酸引物，由TaqDNA聚合酶从5’到3’进行一系列DNA聚合反应，扩增出所需要的目的DNA。
由于每个循环中合成的引物延伸产物可作为下一循环中的模板，因而每次循环中靶DNA的拷贝数几乎呈几何级数增长，因此，20次PCR循环将产生约一百万倍（220）的扩增产物。
这种1985年由KaryMullis建立的方法最早在美国Cetus公司人类遗传学研究室应用于人-珠蛋白DNA的扩增及镰刀形红细胞贫血病的产前诊断。
随后迅速发展起来，将基因诊断提高到一个崭新的阶段。
PCR反应的设计和优化：
PCR技术自建立以来，几年内就成为一项广为应用的研究技术。
PCR之所以得到普及主要是因为它灵敏、特异、高效、简便。
按照最基本的定义，PCR只不过是在适宜的缓冲液中将样本DNA与寡核苷酸引物、脱氧核苷三磷酸及热稳定的TaqDNA聚合酶结合起来，然后反复加热和冷却若干小时，直到获得所需的扩增量。
但事实上，PCR是一个比较复杂、迄今尚未完全明了的生物化学反应。
在反应中各种反应成分之间的动态的相互作用决定着产物的质量。
尽管在多数情况下，反应的最终结果比较好，但如果要获得更好的结果，就有很多参数需要进一步探讨。
由于PCR的应用很广泛，因此，不可能有这样一套条件，它在任何情况下都能保证反应地成功进行。
但是，一般有一种标准反应，可以适用于大多数的DNA扩增反应，即使不能适应，它至少也确定了一个共同的起点，在此基础上可以作多种变化。
标准PCR的体积通常为50l或100l，除样品DNA外，还包括50mMKCl，10mMTris-HCl（Ph8.4，室温），1.5mMMgCl2，100g/ml明胶，0.25M的各种引物，200M的各种脱氧核苷酸（dATP，dCTP，dGTP和dTTP），以及2.5单位的TaqDNA聚合酶。
当然，样品DNA的类型是可变的，但通常都要具有102~105拷贝的模板（例如，0.1g人基因组DNA），通常还要加几滴矿物油，以密封反应，并防止反应体积的减小。
利用这些条件可扩增DNA的靶序列的范围很大。
当上述条件不能产生理想的结果时，即必须进行PCR的优化。
（一）PCR缓冲液的变化通常会影响扩增结果，特别是Mg2+离子，其浓度对扩增的专一性和扩增量有重大影响。
通常最适浓度为1.5mM左右（每种dNTP的浓度为200M时），但有时需采用不同的Mg2+浓度。
Mg2+浓度过高，通常会导致非特异性扩增产物的累积，而浓度过低时通常会降低扩增量。
最近证明少用或不用KCl和明胶对反应较为有利。
四种脱氧核苷酸的浓度通常每种都是50~200M。
过高的浓度会导致聚合酶将其错误掺入，因此应当避免。
浓度为50M和200M时，足以合成6.5g和25g的DNA。
由于脱氧核苷酸定量地与Mg2+结合，因此反应中的dNTP的含量将决定游离Mg2+的含量。
在标准反应中，4种脱氧核苷酸的最终浓度为0.8mM，因此原来的1.5mMMgCl2中剩下0.7mM未与dNTP结合。
所以，如果dNTP的浓度有很大的改变，MgCl2的浓度也必须随着改变。
TaqDNA聚合酶通常浓度为2.5单位/100L反应液。
对于含有序列非常复杂的DNA样品（如染色体组DNA）的扩增反应，TaqDNA聚合酶的最适浓度通常为1~4单位/100L。
浓度高于此水平时，将导致非特异性PCR产物增加。
（二）循环参数也是影响PCR反应的一个重要因素。
标准反应中，将样品快速加热至90~95℃，使双链DNA变性，再快速冷却至40~60℃，使引物退火结合到互补序列上，然后加热至70~75℃用TaqDNA聚合酶延伸退火引物。
在70~75℃下保温时间因被扩增的靶DNA长度而异。
（如果靶序列含约150个碱基或更短，就可以取消整个延伸过程。
聚合酶在较低温度时仍保持很强的活性，延伸过程有退火转变为变性时即可完成）。
过渡时间，即从一种温度转变到另一种温度所需要的时间，取决于所用设备的类型。
除了有特殊情况外，这种变温速率并不重要，因而应尽量加快过渡转换，从而缩短实验时间。
但是为了确保样品达到所需的温度，应该在扩增过程中测定样品的温度，以确定特定反应中的实际过渡时间。
用一根微探针温差电偶和一台数字式万用表即可达到这个目的。
变性时温度不够是导致PCR反应失败的一个常见原因，但过度变性也是不必要的，应尽可能保持聚合酶活性在整个反应过程中都达到最高水平。
退火时的温度取决于引物的长度和GC含量。
对GC含量约50%，长20个碱基的典型的寡核苷酸引物来说，通常用55℃作为起点温度，尽管较高的温度对提高引物的特异性是必要的，由于在反应的混合物中存在着极其过量的引物，杂交可以在瞬间内完成，因此，不需要长时间退火。
有时，引物只有12~15个碱基，退火温度需达40~45℃。
然而，这样短的引物在72℃的延伸温度下不可能保持退火状态。
利用聚合酶在较低温度时的部分活性将引物延伸几个碱基，使之稳定，就可以解决这个问题。
这可以通过在50~60℃时进行保温或将温度从40℃逐渐升高到72℃来实现。
简并引物与靶序列常常会发生多处错误配对，这可以采用类似方法解决。
在同一温度下使引物退火和延伸是可能的。
在55℃以上的温度同时退火和延伸，除了可将反应程序简化为两温度循环外，还可进一步提高反应的专一性。
（三）引物的优劣直接关系到PCR的特异性与成功与否。
现在对高效而专一性强的引物的选择仍然是凭经验。
没有一套规则能确保高效引物对的合成。
但是遵循某些原则，则有助于引物的设计。
（1）长度寡核苷酸引物长度为15~30bp，一般为20~27bp。
引物的有效长度：
Ln=2（G+C）+（A+T），Ln值不能大于38，因为>38时，最适延伸温度会超过TaqDNA聚合酶的最适温度（74℃），不能保证产物的特异性。
（2）G+C含量G+C含量一般为40%~60%。
其Tm值是寡核苷酸的解链温度，即在一定盐浓度条件下形成50%寡核苷酸双链的温度，有效启动温度一般高于Tm值5~10℃。
若按公式Tm=4（G+C）+2（A+T）估计引物Tm值，则有效引物的Tm为55~80℃，其Tm值最好接近72℃以使复性条件最佳。
（3）碱基的随机分布引物中四种碱基的分布最好是随机的，不要有聚嘌呤或聚嘧啶的存在。
尤其3’端不应超过3个连续的G或C，因这样会使引物在G+C富集序列区引发错误。
（4）引物自身引物自身之间存在互补序列，否则引物自身会折叠成发夹状结构或引物本身复性。
这种二级结构会因空间位阻而影响引物与模板的复性结合。
若用人工判断，引物自身不能有连续多于3个碱基互补。
（5）引物之间两引物之间不应有互补性，尤应避免3’端的互补重叠以防引物二聚体的形成。
一对引物间不应有4个连续碱基的同源性或互补性。
（6）引物的3’端引物的延伸是从3’端开始的，不能进行任何修饰。
3’端也不能有形成任何二级结构的可能，除在特殊的PCR（AS-PCR）反应中，引物3’端不能发生错配。
在标准反应体系中，用2UTaqDNA聚合酶和800mol/LdNTP（四种dNTP各200mol/L），以质粒（103拷贝）为模板，按95℃，25s；55℃，25s；72℃，1min的循环参数扩增HIV-1gag基因区的条件下，引物3’端错配对扩增产物的影响是有一定规律的。
A：
A错配使产量下降至1/20，A：
G和C：
C错配下降至1/100。
引物A：
模板G与引物G：
模板A错配对PCR影响是等同的。
表1
表1引物3’端错配对相应扩增效率的影响*
引物3’端碱基
T
C
G
A
模板3’端碱基
T
1.0
1.0
1.0
1.0
C
1.0
<0.01
1.0
1.0
G
1.0
1.0
1.0
<0.01
A
1.0
1.0
<0.01
0.05
*完全配对产物量定为1.0
同等条件下，引物3’端第2位或第3、4位的错配对扩增量影响不大，但易出现非特异性扩增和引物二聚体。
改变反应成分的浓度与复性温度可影响上述结果。
因此，在设计PCR引物时，一定要优化各反应成分，同时，上述结论也提示，引物3’端尽量不用T，尤其应避免连续2个或2个以上的T。
对AS-PCR更应注意3’碱基错配的非特异性扩增。
引物的5’端引物的5’端限定着PCR产物的长度，它对扩增特异性影响不大。
因此，可以被修饰而不影响扩增的特异性。
引物5’端修饰包括：
加酶切位点；标记生物素、荧光、地高辛、Eu3+等；引入蛋白质结合DNA序列；引入突变位点、插入与缺失突变序列和引入一启动子序列等。
密码子的简并性如扩增编码区，引物3’端不要终止于密码子的第3位，因密码子的第3位易发生简并，会影响扩增特异性与效率。
引物的特异性引物与非特异扩增序列的同源性不要超过70%或有连续8个互补碱基同源。
避开产物的二级结构区某些引物无效的主要原因是引物重复区DNA二级结构的影响，选择扩增片段时最好避开二级结构区域。
用有关计算机软件可以预测估计mRNA的稳定二级结构，有助于选择模板。
实验表明，待测区域自由能（G）小于58.61kj/mol时，扩增往往不能成功。
若不能避开这一区域时，用7-deaza-2’-脱氧GTP取代dGTP对扩增的成功是有帮助的。
（四）由于PCR强大的扩增能力与检测敏感性，极微量的污染就可导致假阳性。
污染来源有标本间交叉污染；实验室质粒污染和PCR产物污染等，因此实验室的布局和条件必须符合国家有关规定要求。
预防的办法是隔离不同操作区，分装试剂，严格按规范操作，如戴一次性手套，避免反应液飞溅，用一次性吸头，离心管，最后加模板。
实验中设计合理的阴性对照和阳性对照，以监测反应中有无污染。
有关材料可用稀盐酸檫拭或浸泡，紫外线照射环境；丢弃可疑反应液，如果反应液较珍贵，则可以采用反应液中加消化DNA的酶或紫外线照射反应液；还有其它一些处理的方法：
如尿嘧啶DNA糖基化酶法，固相捕捉法，RNA酶特异PCR法等，不一一赘述。
（四）介绍几种特殊的PCR类型
1、定量PCR
（1）竞争性定量PCR：
采用内参照竞争性定量方法，其检测原量如前所述。
产物分析多采用探针杂交法，也有采用电泳法、HPLC和荧光法等。
该方法应用报道甚多，样品分析可实现自动化。
由于采用内参照的竞争性定量，克服了常规PCR扩增效率不稳定性的缺陷，各管间差异得以避免，因而在准确性方面优越于终点稀释法定量，是目前较理想的一种定量方法。
尽管如此，这种方法仍存在诸多不足，其主要表现在：
内参照制备较难，需经反复测试，实践中其与待检样本扩增效率很难达到完全相同。
内参照与待检样本相互作用，内参照与待检样本是否会形成二聚体尚有待深入研究。
定量原理从根本上说仍是采用基于标准曲线的类推法，单个标准品的点变异对定量结果影响较大。
荧光定量PCR：
这是新近才出现的一种定量PCR检测方法，可采用外参照的定量法，也可采用内参照的定量方法，后者是在竞争性PCR基础上的发展。
扩增后产物采用荧光显示，定量方法多样化，算法更为精确。
荧光定量PCR的基本特点是：
用产生荧光信号的指示剂显示扩增产物的量。
荧光信号通过荧光染料嵌入双链DNA，或双重标记的序列特异性荧光探针或能量信号转移探针等方法获得。
大大地提高了检测的灵敏度、特异性和精确性。
固相杂交酶免疫法检测核酸扩增产物该法将特异性探针包被于固相载体上（包被探针），通过杂交反应将标记有生物素的产物固定在酶标微孔板，再加入辣根酶标记的链亲和素，利用显色反应显示待测样品中核酸模板的情况。
这种方法灵敏度较高，特异性好，可以避免因PCR非特异扩增引起的假阳性，结果准确可靠，且成本不高，有利于推广和普及。
但由于PCR体系不同管之间不同的模板提取效率、逆转录效率和扩增效率等因素的影响，因而酶标结果并不能完全客观地表示模板含量，而且酶免疫显色反应的线性测定范围狭窄，也会影响真正的量化检测结果.
动态实时连续荧光监测免除了标本和产物的污染，且无复杂的产物后续处理过程，高效、快速。
由于方法学上的诸多优点，本方法已广泛应用于基因表达、点突变检测、抗病毒药物筛选及其他临床研究和病理研究等方面。
综上所述，定量PCR技术的发展具有以下趋势：
（1）从粗略定量、半定量到精确定量、绝对定量；
（2）从单纯外参照非竞争性定量到多种参照定量；（3）从扩增样本终点一次检测到扩增过程中动态连续检测进行定量；（4）检测方法也由手工、半自动发展到成套设备检测，且检测效率及自动化程度越来越高。
（五）此外，PCR还可应用于：
1、PCR检测突变
（1）已知点突变的检测
1.1增抗拒突变系统PCR（ARMS-PCR）和短串联重复PCR（STR-PCR）ARMS-PCR和STR-PCR在检测已知点突变中愈来愈受到重视，尤其是用来诊断特殊遗传疾病和癌症。
两种分析方法都包括利用可以辨别单碱基突变（ARMS-PCR）或者具有简单序列的不同数量的重复片段（STR-PCR）的引物进行专一性基因片段PCR扩增。
CGE和ESCE都可以分析在ARMS-PCR基因PCR扩增中的单碱基取代产物。
选择合适的多组PCR引物对可以同时对多个突变位点进行分析，Donohoe等利用多重ARMS-PCR扩增反应鉴定了阿朴脂蛋白E基因。
对于杂合子样品，STR-PCR有一定困难，这包括长等位基因低的扩增效率和PCR扩增受阻（如非转一性片段的扩增），这两种情况都会引起低的扩增条带。
1.2连接酶链式反应（LCR）LCR是一种点突检测反应接着进行信号扩增的技术，在基因突变诱发人体疾病的程序性分析中十分有用。
LCR反应中采用了两对互补寡核苷酸引物，如果引物的序列与目标序列能完全配对时，那么两对引物将与各自目标片段杂交，并连接；如果点突变出现在目标片段上时，将不能进行连接反庆，就不会出现连接产物。
1.3等位基因特异性扩增分析（ASA）
ASA是一种点突变的检测方法，两种寡核苷酸引物被用在PCR反应中。
如果点突变发生在目标片段上时，则无扩增产物出现。
1.4限制性片段长度多态性分析（PCR-RFLP）PCR-RFLP是一种广泛用于检测已知DNA点突变的方法，它可以检测大到几千个碱基对DNA片段。
该方法通过分析核酸限制性内切酶切割经目标模板PCR扩增的DNA片段上突变基因位点的有效性来分析DNA点突变。
（2）未知点突变的检测
2.1定量反转录PCR在疾病状况下，特殊基因的突变活性影响病理的表现状态。
定量反转录PCR（ORT-PCR）可以通过从mRNA合成的cDNA接着PCR定量扩增cDNA来估测基因的活性和表达。
2.2异源双链核酸分子多态性分析（HPA）
HPA广泛用于检测未知点突变。
这种技术包括等位基因DNA片段变性（PCR-扩增）和接下来单链DNA分子重新退火形成一个原生型和突变型的双链DNA（dsDNA）片段混合物。
这个组成是一个重聚的同源双链核酸分子（dsDNA）和新的异源双链核酸分子（dsDNA）的混合物。
异源双链核酸分子出现的错配现象归因于结构的变化。
在电泳过程中，异源双链核酸分子滞后于同源双链核酸分子。
HPA依赖于DNA复制中局部结构的变化，随着DNA片段长度和围绕配对区域GC含量的增加，灵敏度会降低。
2.3单链构象多态性（SSCP）SSCP也是一种分析未知点突变常用的方法。
它包括双链DNA片段的解离，每两个单链片段依靠其特定序列组成一种折叠构象。
SSCP分析的灵敏度依赖于是否突变影响到DNA的折叠和因此形成的单链DNA（ssDNA）分子在电泳中的移动速度。
2、PCR用于细菌核糖体分型
核糖体是细菌唯一的细胞器，是蛋白质合成的场所。
它由核蛋白和rRNA组成，其中rRNA在细菌的长期进化过程中变化不大，这表现在碱基组成、碱基序列、高级结构及功能等不同层次的保守性。
传统鉴别方法既费时又结果不清，利用细菌的rRNA分型技术可克服这些缺点，如果能选择一个相对可变且又保守的目标序列可能会加速杂交技术的广泛开展。
16SrRNA内所含的多态性位点较少，一些菌种可能含有相同或相似的序列，往往需测序才能鉴定，这就限制了它作为商业探针的广泛应用。
但另一方面，过度的可变性，诸如热休克蛋白（HSP65）也并不受欢迎，因为它的种特异性信号易变或不稳定。
而最近研究的16S～23SrRNA区间被认为是细菌鉴定的合适部位，它集保守性和可变性于一身，且片段小，重复性好。
PCR技术为快速而全面地分析多拷贝16S～23S区间开辟了全新的道路。
随着生物芯片的不断开发，若能把rRNA分型技术、PCR与生物芯片技术相结合，感染性疾病的诊断将迈上更高的台阶。
3、随机引物扩增多态性DNA
随机引物扩增多态性DNA（RandomAmplifiedPolymorphicDNAAnalysis,RAPD）是建立在聚合酶链反应基础上的新的检测基因组多态性的基因型分型方法。
采用不针对已知染色体的一条长约8～12个寡核苷酸片段为引物，在低退火温度下与基因组DNA两条链的多个非特异位点通过错配而复性，若相临退火处不大于kbp且位于不同股DNA，扩增反应即可发生，获得的基因组DNA指纹图可反映种系发育过程的相互联系及不同克隆间的差异。
该方法目前已广泛应用于细菌、真菌、支原体等微生物的分型中。
RAPD的一个显著的优点是可在模板DNA序列未知情况下任意设计引物，因而引物的选择成为RNPD分型成功的最主要的影响因素。
在较低的退火温度下，扩增产物取决于模板DNA退火位点的数目及出现的频率。
一些学者认为G＋C的含量是评价扩增效率最有价值的指标。
最佳引物长度依赖于模板DNA，理论上长的引物较短的引物具有更高的分辨力，一般RAPD选用8～12个寡核苷酸为引物。
RAPD反应中引物浓度随模板DNA浓度而定。
一般在RAPD反应中，10ngDNA与0.25μM引物可较稳定的产生预期的DNA片段。
若引物浓度低于0.05μM无扩增反应发生，若大于0.5μM引物与模板DNA比值过高将降低反应的特异性而产生更多的较小的淡染色条带。
RAPD反应中，结合相同或不同长度多个引物的扩增结果分析可提高RAPD的分辨力。
RAPD分型中为达到有效DNA扩增需要较低的退火温度（25℃～40℃），当退火温度超过40℃时，许多引物的扩增反应将被抑制。
尽管有研究显示某些短的引物可在55℃退火形成扩增产物，但大量研究显示，在65℃～80℃的退火温度下无扩增反应发生。
高温抑制了引物退火及后继的延伸反应。
循环次数对RAPD分析也有影响。
大量研究表明，RAPD较佳的循环为45次，小于30个循环将丢失一些条带，而在30～50个循环范围内，循环次数对条带的数目及相对强弱无影响。
与常规PCR相比，RAPD对扩增仪的要求较高。
许多研究显示，不同实验室使用相同的扩增方法得到的RAPD指纹图不同，表明不同的扩增仪对反应的影响，其中温度控制是一个重要因素。
此外，DNA扩增产物电泳时间的长短也对结果有所影响。
总之，模板及引物浓度是影响重复性的最重要因素。
为减少RAPD图谱的差异，模板浓度应控制在中等含量即大于10ng，引物浓度至少达到2.0μM。
由于RAPD采用较低的退火温度，退火处特异性较低，因而对实验条件的变化较常规PCR更为敏感。
严格控制实验条件是获得可靠结果的前提。
4、此外还有简并引物扩增法（扩增未知基因片段），巢居PCR（提高PCR敏感性、特异性，分析突变），复合PCR（同时检测多个突变或病原），反向PCR（扩增已知序列两侧地未知序列，致产物突变），单一特异引物PCR（扩增未知基因组DNA），等等。
三、基因芯片技术
DNA芯片技术是近年出现的DNA分析技术，其
升级会员 