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细胞培养知识

细胞培养基础知识

细胞培养基本条件

1、合适的细胞培养基

合适的细胞培养基是体外细胞生长增殖的最重要的条件之一，培养基不仅提供细胞营养和促使细胞生长增殖的基础物质，而且还提供培养细胞生长和繁殖的生存环境。

2、优质血清

目前，大多数合成培养基都需要添加血清。

血清是细胞培养液中最重要的成分之一，含有细胞生长所需的多种生长因子及其它营养成分。

3、无菌无毒细胞培养环境

无菌无毒的操作环境和培养环境是保证细胞在体外培养成功的首要条件。

在体外培养的细胞由于缺乏对微生物和有毒物的防御能力，一旦被微生物或有毒物质污染，或者自身代谢物质积累，可导致细胞中毒死亡。

因此，在体外培养细胞时，必须保持细胞生存环境无菌无毒，及时清除细胞代谢产物。

4、恒定的细胞生长温度

维持培养细胞旺盛生长，必须有恒定适宜的温度。

5、合适的气体环境

气体是哺乳动物细胞培养生存必需条件之一，所需气体主要有氧气和二氧化碳。

细胞培养基种类与基本成分

细胞培养基的种类很多，按其来源分为合成培养基和天然培养基（目前使用的培养基绝大部分是合成培养基），按其物质状态分为干粉培养基和液体培养基两类。

干粉培养基需由实验者自己配制并灭菌，液体培养基由专业商家提供，用户可直接使用，非常方便。

1、合成培养基的主要成分有：

氨基酸、碳水化合物、无机盐、维生素及其它辅助物质：

氨基酸

氨基酸是组成蛋白质的基本单位。

不同种类的细胞对氨基酸的要求各异，但有几种氨基酸细胞自身不能合成，必须依靠培养液提供，这几种氨基酸称为必需氨基酸。

其中谷氨酰胺是细胞合成核酸和蛋白质必需的氨基酸，在缺少谷氨酰胺时，细胞生长不良而死亡。

因此，各种培养液中都有较大量的谷氨酰胺。

但是，由于谷氨酰胺在溶液中很不稳定，应置于-20℃冰箱中保存，在使用前加入培养液内。

已含谷氨酰胺的培养液在4℃冰箱中储存2周以上时，还应重新加入原来量的谷氨酰胺。

碳水化合物

碳水化合物是细胞生长主要能量来源，其中有的是合成蛋白质和核酸的成分。

主要有葡萄糖、核糖、脱氧核糖、丙酮酸钠和醋酸等。

无机盐

培养液中无机盐的主要功能是帮助细胞维持渗透压平衡。

此外，通过提供钠，钾和钙离子，帮助细胞调节细胞膜功能。

培养液的渗透压是一个非常重要的因素,细胞通常可耐受260mOsm/kg～320mOsm/kg。

标准培养液的渗透压在此范围内波动。

特别注意：

向培养液中加入其它物质有可能会明显改变培养液的渗透压，特别是溶于强酸或强碱中的物质。

向培养液中添加HEPES时需按以下方法调节钠离子浓度。

缓冲系统

大多数细胞所需pH在-。

但是，细胞培养最适pH值随培养的细胞种类不同而不同。

成纤维细胞喜欢较高pH-,而传代转化细胞系则需要偏酸pH-。

由于多数培养液靠碳酸氢钠（NaHCO3）与CO2体系进行缓冲，因此，气相中的CO2浓度应与培养液中碳酸氢钠浓度相平衡。

如果气相或培养箱空气中CO2浓度设定在5％，培养液中NaHCO3的加入量为1.97g/L；如果CO2浓度维持在10％，培养液中NaHCO3的加入量为3.95g/L。

细胞培养瓶盖不应拧得太紧，以保证气体交换。

HEPES是一种非离子缓冲液，在pH-范围内具有较好的缓冲能力，但是非常昂贵，在高浓度时对一些细胞可能有毒。

HEPES缓冲液可与低水平的碳酸钠（0.34g/L）共用，以抵消因额外加入HEPES引起的渗透压增加。

在这种培养条件下，细胞培养瓶的盖子应拧紧，以防止培养液中所需的少量碳酸盐散入空气中。

大多数培养液中含有酚红作为pH指示剂，酸性培养液呈橙黄色，碱性培养液呈深红色。

维生素

在细胞培养中，尽管血清是维生素重要来源，但是许多培养基中添加了各种维生素以适合更多的细胞系生长。

其它成分

在一些较为复杂的培养液中还包括其它一些成分。

如在杂交瘤技术中常用的DMEM培养液，使用时还需要补加丙酮酸钠和2-巯基乙醇（2-Mercaptoethanol，2-Me）。

2-Me对细胞生长有很重要的作用。

有人认为它相当于胎牛血清，有直接刺激细胞增殖作用。

2-Me的活性部分是硫氢基，其中一个重要作用是使血清中含硫的化合物还原成谷胱甘肽，能诱导细胞的增殖，为非特异性的激活作用。

同时避免过氧化物对培养细胞的损害。

另一个重要作用是促进分裂原的反应和DNA合成，增加植物凝集素（PHA）对淋巴细胞的转化作用，已广泛应用于杂交瘤技术，另外，也开始用于一些难以培养的细胞。

2-Me是一种小分子还原剂，极易氧化。

分子量为，纯的2-Me是一种无色有刺激味的液体，比重为，常用终浓度为5×10-5M。

常配制成0.1M的储存液，用时每升培养液加。

液体培养基保存：

液体培养基应于4℃冰箱避光保存，实验前放入37℃预热。

未加血清液体培养基有效期为12个月。

液体培养基中的L-谷氨酰胺会随着储存时间的延长而慢慢分解。

如果细胞生长不良，可以再添加适量L-谷氨酰胺。

干粉培养基保存：

4℃冰箱避光保存，有效期36个月。

血清

细胞培养液中添加的血清有牛血清、马血清、人血清等，其中牛血清是最常用的血清，分为胎牛血清和新生小牛血清。

胎牛血清是从母牛破腹取出的胎牛中分离出的血清，价格昂贵。

新生小牛血清是从刚出生的尚未哺乳的小牛中分离出来的血清，如厂家能做到这一点，新生小牛血清的质量与胎牛血清的质量相差不大。

如小牛出生后已哺乳，从这种小牛中取出的血清中可能含有较多的生物活性物质，其质量明显不如前两种。

血清的质量，种类及使用的浓度都有可能影响细胞的生长，而不同批次的血清支持细胞生长的能力也不同，尤其是对克隆细胞的生长，某些批次血清可能含有毒性或抑制细胞生长的物质。

因此，在购买大量血清之前，必须对血清支持细胞生长能力进行检测，然后再大量购买质量好的同一批号的血清，并注意以下几点：

（1）需要长期保存的血清必须储存于-20℃–70℃低温冰箱中。

4℃冰箱中保存时间切勿超过1个月。

由于血清结冰时体积会增加约10％，因此，血清在冻入低温冰箱前，必须预留一定体积空间，否则易发生污染或玻璃瓶冻裂。

（2）一般厂商提供的血清为无菌，无需再过滤除菌。

如发现血清有悬浮物，则可将血清加入培养液内一起过滤，切勿直接过滤血清。

（3）瓶装血清解冻需采用逐步解冻法：

-20℃至-70℃低温冰箱中的血清放入4℃冰箱中溶解1天。

然后移入室温，待全部溶解后再分装。

在溶解过程中需不断轻轻摇晃均匀（小心勿造成气泡），使温度与成分均一，减少沉淀的发生。

切勿直接将血清从-20℃进入37℃解冻，这样因温度改变太大，容易造成蛋白质凝集而出现沉淀。

（4）热灭活是指56℃,30分钟加热已完全解冻的血清。

加热过程中须规则摇晃均匀。

此热处理的目的是使血清中的补体成分（complement）灭活。

除非必须，一般不建议作此热处理，因为热处理会造成血清沉淀物显着增多，而且还会影响血清的质量。

补体参与反应有：

细胞毒作用,平滑肌细胞收缩,肥大细胞和血小板释放组胺,增强吞噬作用,促进淋巴细胞和巨噬细胞发生化学趋化和活化。

（5）切勿将血清在37℃放置太久，否则血清会变得浑浊，同时血清中的有效成分会破会而影响血清质量。

（6）血清中的沉淀物絮状物：

主要是血清中的脂蛋白变性及解冻后血清中纤维蛋白造成，这些絮状物不会影响血清本身的质量。

可用离心3000rpm,5分钟去除，也可不用处理。

显微镜下“小黑点”：

经过热处理过的血清，沉淀物的形成会显着增多。

有些沉淀物在显微镜下观察象“小黑点”，常误认为血清受污染。

一般情况下，此小黑点不会影响细胞生长，但如果怀疑血清质量，则应立即停止使用，更换另一批号的血清。

细胞培养环境

1、实验室设计

细胞培养是一种无菌操作技术，要求工作环境和条件必须保证无微生物污染和不受其它有害因素的影响。

细胞培养室和设计原则是防止微生物污染和有害因素影响，要求工作环境清洁、空气清新，干燥和无烟尘。

细胞培养室的设计原则一般是无菌操作区设在室内较少走动的内侧，常规操作和封闭培养于一室，而洗刷消毒在另一室。

2、常用设施及设备

（1）超净工作台：

也称净化工作台，分为侧流式、直流式和外流式三大类。

（2）无菌操作间：

一般由更衣间、缓冲间和操作间三部分组成。

操作间放置净化工作台及二氧化碳培养箱、离心机、倒置显微镜等。

缓冲间可放置电冰箱、冷藏器及消毒好的无菌物品等。

（3）操作间：

普通培养箱、离心机、水浴锅、定时钟、普通天平及日常分析处理物

（4）洗刷消毒间：

烤箱、消毒锅、蒸馏水处理器及酸缸等。

（5）分析间：

显微镜、计算机及打印机等。

3、培养器皿

常用细胞培养器皿有培养瓶、培养板、培养皿等。

常准备量是使用量的三倍。

器皿应选择透明度好、无毒、利于细胞粘附和生长的材料，常用一次性聚苯乙烯材料制品或中性硬度玻璃制品。

常用的器皿有下面几种。

（1）液体储存瓶：

用于储存各种配制好的培养液、血清等液体，常用规格有500ml、250ml、100ml等几种。

（2）培养瓶：

根据培养细胞种类要求不同培养瓶的形态各异，用于细胞传代培养的细胞要求瓶壁厚簿均匀，便于细胞贴壁生长和观察，瓶口要大小一致，口径一般不小于1cm，允许吸管伸入瓶内任何部位，规格有200ml、100ml、50ml、25ml、10ml等几种。

（3）培养皿：

用于开放式培养及其它用途。

分直径30mm、60mm、120mm等几种。

（4）吸管：

常用的有长吸管和短吸管两类，长吸管也称刻度吸管。

其改良后管上部有球型刻度称改良吸管，刻度吸管用于移动液体。

常用1ml和10ml两种。

短吸管也叫滴管，分弯头和直头两种。

（5）离心管：

离心管是细胞培养中使用最广泛的器皿，根据用途不同形态各样，常用于细胞培养的离心管有大腹式尖底离心管和普通尖底离心管两类。

前者分别为50ml、30ml、15ml；后者则多为10ml和5ml。

（6）其它：

如三角烧瓶、烧杯、量筒、漏斗、注射器等。

4、细胞培养温度

维持培养细胞旺盛生长，必须有恒定而适宜的温度。

不同种类的细胞对培养温度要求也不同。

人体细胞培养的标准温度为℃±0.5℃，偏离这一温度范围，细胞的正常代谢会受到影响，甚至死亡。

培养细胞对低温的耐受力较对高温强，温度上升不超过39℃时，细胞代谢与温度成正比；人体细胞在39-40℃1小时，即能受到一定损伤，但仍有可能恢复；在40-41℃1小时，细胞会普遍受到损伤，仅小半数有可能恢复；41-42℃1小时，细胞受到严重损伤，大部分细胞死亡，个别细胞仍有恢复可能；当温度在43℃以上1小时，细胞全部死亡。

相反，温度不低于0℃时，对细胞代谢虽有影响，但并无伤害作用；把细胞放入25－35℃时，细胞仍能生存和生长，但速度减慢；放在4℃数小时后，再回到37℃培养，细胞仍能继续生长。

细胞代谢随温度降低而减慢。

当温度降至冰点以下时，细胞可因胞质结冰受损而死亡。

但是，如果向培养液中加入一定量的冷冻保护剂（二甲亚砜或甘油），可在深低温下如－80℃或－196℃（液氮）长期保存。

5、合适的气体环境

气体是哺乳动物细胞培养生存必需条件之一，所需气体主要有氧气和二氧化碳。

氧气参与三羧酸循环，产生供给细胞生长增殖的能量和合成细胞生长所需用的各种成分。

开放培养时一般把细胞置于95%空气加5%二氧化碳混合气体环境中。

二氧化碳既是细胞代谢产物，也是细胞生长繁殖所需成分，它在细胞培养中的主要作用在于维持培养基的pH值。

大多数细胞的适宜pH为，偏离这一范围对细胞培养将产生有害的影响。

但细胞耐酸性比耐碱性大一些，在偏酸环境中更利于细胞生长。

但有一些细胞也喜欢偏碱环境中生长，如成纤维细胞最适合pH是。

每种细胞都有其最适pH值。

细胞培养无菌操作基本技术

无菌操作技术分为三个部分：

工作环境及表面的处理，细胞培养所用玻璃及塑料制品的处理及培养液与培养细胞的处理。

工作环境的处理

使用层流超净工作台是最经济有效的手段。

超净工作台正常工作时，向下的气流可阻挡外界空气污染物进入超净台。

（1）实验前，无菌室及无菌操作台用紫外灯照射30-60分钟灭菌，用70%酒精擦拭无菌操作台面，并开启无菌操作台风机运转10分钟后，才可开始实验操作。

每次操作只处理一株细胞，以免造成细胞交叉污染。

实验结束后，将实验物品带出工作台。

如需要继续进行下一个实验，则用70%酒精擦拭无菌操作台面，再让无菌操作台风机运转10分钟后，才可进行下一个实验操作。

（2）无菌操作工作区域应保持清洁与宽敞，必要物品，如试管架、移液器或吸管头等可以暂时放置，其它实验用品用完后应及时移出，以利气体流通。

实验用品要用70%酒精擦拭后才能带入无菌操作台内。

实验操作应在操作台中央无菌区域内进行，勿在边缘非无菌区域操作。

（3）小心取出无菌实验用品，避免造成污染。

切勿碰触吸管与吸头头部或容器瓶口，不要在打开的容器正上方操作实验。

容器打开后，用手夹住瓶盖并握住瓶身，倾斜约45°角取用，尽量勿将瓶盖盖口朝上放在台面上。

（4）工作人员应注意自身的安全，必须穿戴实验衣与手套后才进行实验。

对于来自人源性或病毒感染的细胞株应特别小心，并选择适当等级的无菌操作台（至少两级）。

操作过程中，应避免引起气溶胶的产生，小心有毒性试剂，例如DMSO及TPA等，并避免尖锐物品伤人等。

（5）定期检查下列项目：

CO2钢瓶内的CO2压力；CO2培养箱内的CO2浓度、温度、及水盘是否有污染；无菌操作台内气流压力是否正常，定期更换紫外灯管及HEPA过滤器滤膜，预滤网﹙300小时/预滤网，3000小时/HEPA）。

细胞培养所用玻璃及塑料制品的清洗与消毒

清洗

在组织细胞培养中，体外细胞对任何有害物质都非常敏感。

微生物产品附带杂物，上次细胞残留物及非营养成分的化学物质，均能影响培养细胞的生长。

因此对新使用玻璃器皿和重新使用的培养器皿都要严格彻底的清洗，且要根据器皿的组成材料不同，选择不同的清洗方法。

玻璃器皿的清洗

组织细胞培养中，使用量最大的是玻璃器皿，故工作最最大的是玻璃器皿的清洗。

一般玻璃器皿的清洗包括浸泡、刷洗、浸酸和冲洗四个步骤。

清洗后的玻璃器皿不仅要求干净透明无油迹，而且不能残留任何物质。

（1）浸泡：

初次使用和培养使用后的玻璃器皿均需先用清水浸泡，以使附着物软化或被溶液掉。

新的初次使用的玻璃器皿，在生产及运输过程中，玻璃表面带有大量的干固的灰尘，且玻璃表面常呈碱性及带有一些对细胞有害的物质等。

新瓶使用前应先用自来水简单刷洗，然后用稀盐酸液浸泡过夜，以中和其中的碱性物质。

再次使用的玻璃器皿则常附有大量刚使用过的蛋白质，干固后不易洗掉，故用后要立即浸入水中，且要求完全浸入，不能留有气泡或浮在液面上。

（2）刷洗：

浸泡后的玻璃器皿一般要用毛刷沾洗涤剂刷洗，以除去器皿表面附着较牢的杂质。

刷洗要适度，过度会损害器皿表面光泽度。

（3）浸酸：

清洁液是由重铬酸钾、浓硫酸和蒸馏水按一定比例配制而成，其处理过程称为浸酸。

清洁液对玻璃器皿无腐蚀作用，而其强氧化作用可除掉刷洗不掉的微量杂质。

清洁液去污能力很强。

是清洗过程中关键的一环。

浸泡时器皿要充满清洁液，勿留气泡或器皿露出清洁液面。

浸泡时间一般为过夜，不应少于6小时。

清洁液可根据需要，配制成不同的强度，常用的下列三种：

重铬酸钾（g）浓

硫酸（ml）蒸馏水（ml）比例如下

（A）强清洁液63∶1000∶200000

（B）次强清洗液120∶200∶1000

（C）弱清洁液100∶100∶100。

清洁液配制时应注意安全，须穿戴耐酸手套和围裙，并要保护好面部及身体裸露部分。

配制过程中可使重铬酸钾溶于水中，然后慢慢加浓硫酸。

并不停的用玻璃棒搅拌，使产生的热量挥发，配制过程中可使重铬酸钾溶于水中，然后慢慢加浓硫酸。

并不停的用玻璃棒搅拌，使产生的热量挥发，配制溶液应选择塑料制品。

配成后清洁液一般为棕红色。

（4）冲洗：

玻璃器皿在使用后，刷洗及浸泡后都必须用水充分冲洗。

使之尽量不留污染或洁液的残迹。

冲洗最好用洗涤装置。

即省力、效果又好。

如用手工操作，则需流水冲洗十次以上，每天水须灌满及倒干净，最好用蒸馏水清洗3-5次，晾干备用。

胶塞的清洗

细胞培养中所用的橡胶制品主要是瓶塞。

新购置的瓶塞带有大量滑石粉及杂质，应先用自来水冲洗，再做常规处理，常规清洗方法是：

每次用后立即置入水中浸泡，然后用2%NaOH或洗衣粉煮沸10-20分钟，以除掉培养中的蛋白质。

自来水冲洗后，再用1%稀盐酸浸泡30分钟或蒸馏水冲洗后再煮沸10-20分钟，晾干备用。

塑料制品的清洗

塑料自制品现多是采用无毒并已经特殊处理的包装，打开包装即可用，多为一次性物品。

必要时用2%NaOH浸泡过夜，用自来水充分冲洗，再用5%盐酸溶液浸泡30分钟，最后用自来水和蒸馏水冲洗干净，晾干备用。

消毒

细胞培养的最大危险是发生培养物的细菌，真菌和病毒等微生物的污染。

污染主要是由于操作者的疏忽而引起，常见的原因有操作间或周围空间的不洁，培养器皿和培养液消毒不合格或不彻底。

由于有关培养的每个环节的失误均能导致培养失败，故细胞培养的每个环节都应严格遵守操作常规，防止发生污染。

消毒方法分为三类：

物理灭菌法（紫外线、湿热、干烤、过滤等），化学灭菌法（各种化学消毒剂）和抗生素。

（1）紫外线消毒：

用于空气，操作台表面和不能使用其它法进行消毒和培养器皿。

紫外线直接照射方便、效果好，经一定的时间照射后，可以消灭空气中大部分细菌，培养室紫外线灯应距地面不超过2.5米，且消毒进物品不宜相互遮档，照射不到的地方起不到消毒作用。

紫外线可产生臭氧，污染空气，试剂及培养液都有不良影响，对人皮肤也有伤害，不宜近照射。

（2）温热消毒：

即高压蒸气消毒，是一种使用最广泛、效果最好的消毒方法。

温热消毒时，消毒物品不能装得过满，以防止消毒器内气体阻塞而千百万危险，保证其内气体的流通。

在加热升压之前，先要打开排气阀门排放消毒器内的冷空气，冷气空气排出后，关闭排气阀门，同时检验安全阀活动自如，继后开始升压，当达到所需压力时，开始记算消毒时间。

消毒过程中，操作者不能离开工作岗位，要定时检查压力及安全，防止消毒及表皮意外事件发生。

常用物品消毒压力及时间：

培养液、平衡盐溶液及其它需要灭菌的液体：

121℃,15磅,20分钟；布类、玻璃制品、金属器械等物品：

先121℃,15磅,20分钟，然后在烘箱中烘干；玻璃瓶：

干热灭菌170℃,4小时。

（3）化学消毒法：

最常见的是70%酒精及1‰的新洁而灭，前者主要用于操作者的皮肤，操作台表面及无菌室内的壁面处理。

后者则主要用器械的浸泡及皮肤和操作室壁面的擦试消毒。

化学消毒法操作简单、方便有效。

（4）抗生素消毒：

主要用于培养用液灭菌或预防培养物污染。