硕士学位论文H2O2预处理对不同品种水稻Cd耐性的影响白晓娟.docx

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硕士学位论文H2O2预处理对不同品种水稻Cd耐性的影响白晓娟

硕士学位论文

H2O2预处理对不同品种水稻Cd耐性的影响

白晓娟

指导教师

葛滢教授

专业名称

环境科学

研究方向

环境污染控制与生物修复

答辩日期

二○○九年十二月

EFFECTSOFH2O2PRETREATMENTONCdTOLERANCEOFDIFFENENTRICECULTIVARS

by

BaiXiaojuan

Supervisedby

ProfessorGeYing

ATHESISSubmittedto

NanjingAgriculturalUniversity

InPartialFulfillmentoftheRequirements

for

MasterDegreeofScience

CompletedDecember,2009

CommencementDecember,2009

原创性声明

本人郑重声明：

所呈交的学位论文，是本人在导师的指导下，独立进行研究工作所取得的成果。

除文中已经注明引用的内容外，本论文不包含任何其他个人或集体已经发表或撰写过的作品成果。

对本文的研究做出重要贡献的个人和集体，均已在文中以明确方式标明。

本人完全意识到本声明的法律结果由本人承担。

学位论文作者（需亲笔）签名：

年月日

学位论文版权使用授权书

本学位论文作者完全了解学校有关保留、使用学位论文的规定，同意学校保留并向国家有关部门或机构送交论文的复印件和电子版，允许论文被查阅和借阅。

本人授权南京农业大学可以将本学位论文的全部或部分内容编入有关数据库进行检索，可以采用影印、缩印或扫描等复制手段保存和汇编学位论文。

保密□，在年解密后适用本授权书。

本学位论文属于不保密□。

（请在以上方框内打“√”）

学位论文作者（需亲笔）签名：

年月日

导师（需亲笔）签名：

年月日

H2O2预处理对不同品种水稻Cd耐性的影响

本研究得到以下项目资助：

国家自然科学基金（30700479）“镉胁迫下水稻谷胱甘肽硫转移酶（GST）解毒机制研究”

图表目录

H2O2预处理对不同品种水稻Cd耐性的影响

摘要

本文以耐性不同的两个水稻品种N07-63和N07-6为材料，采用水培实验研究了镉（Cd）胁迫下过氧化氢（H2O2）预处理对两种水稻耐Cd性和吸收转运Cd的影响及品种间的差异。

比较了两品种不同处理下丙二醛（MDA）、还原型谷胱甘肽（GSH）、非蛋白巯基（NPT）、植物络合素（PCs）以及谷胱甘肽硫转移酶（GST）的变化情况；并对水稻N07-6不同处理下的根部粗酶提取液进行了蛋白分离鉴定。

主要结果如下：

1．H2O2预处理增强水稻耐性生理指标及种间差异

50μMCd胁迫明显抑制了水稻生长，降低了株高、根长、地上部和根部干重，MDA含量增加（即增强了膜脂过氧化作用）。

品种间差异显著，敏感品种N07-6生物量降幅均比耐性品种N07-63大，前者MDA含量增加更多。

与单一Cd处理相比，H2O2预处理后使水稻生物量增加，N07-63生长明显优于N07-6，前者MDA含量恢复到对照水平。

H2O2单独预处理除使株高有所减少外，对水稻无显著影响。

Cd处理下，N07-63地下部Cd含量高于N07-6，但地上部Cd含量及Cd的转移率却明显小于后者。

H2O2预处理促进了N07-63地下部Cd吸收，地上部Cd含量没有变化，N07-6根部Cd含量却减少，但此时两个品种的Cd转移率均比Cd单一处理减小，品种间有显著差异，N07-63的Cd转移率明显小于N07-6。

Cd处理诱导了水稻NPT、GSH、PCs的合成，增强了GST的活性，而且存在显著的种间差异，N07-63根部的巯基物质含量和GST活性增加幅度大于N07-6。

在H2O2预处理后，水稻根部GSH、NPT、PCs含量、GST活性进一步提高，N07-63增幅更大，耐性提高更多。

以上可以看出，H2O2预处理提高Cd耐性存在种间差异，对于耐性品种N07-63，H2O2预处理缓解Cd毒害的效应更加明显，这与该品种水稻根部具有更多的巯基物质（GSH、NPT、PCs），更高的解毒酶GST活性和更少的Cd转运等特点密切相关。

2．H2O2预处理提高水稻根部的耐性蛋白表达

通过对水稻敏感品种N07-6根部粗酶提取液进行蛋白分离，通过质谱鉴定电泳中的蛋白条带，将其与蛋白数据库比对的结果表明，Cd胁迫之前的H2O2预处理能够增加蛋白表达量，它们分别是：

谷胱甘肽还原酶（Glutathionereductase，GR）、二磷酸核苷激酶（Nucleosidediphosphatekinase，NDPK）、硫氧还蛋白（Thioredoxin，Trx）。

它们是维持细胞氧化还原状态及调控正常代谢的重要蛋白酶类，有利于降低Cd胁迫所造成的氧化损伤，所以可以推测，H2O2预处理还可以通过提高相关蛋白的表达而增加水稻耐Cd性。

关键词：

镉；过氧化氢；水稻；耐性

EffectofH2O2PretreatmentonCdToleranceofDifferentRiceCultivars

ABSTRACT

Inthisthesis,tworicecultivars（N07-6andN07-63）withdifferentCdtolerancewereselectedtostudytheeffectofH2O2pretreatmentonCdtoleranceandtranslocationwithintheseedlings.VariationsofthecontentsofMDA,reducedglutathione（GSH）,non-proteinthiols（NPT）,phytochelatins（PCs）andtheactivityofglutathioneS-transferase（GST）inthetwocultivarswerecomparedamongthedifferenttreatments.CrudeectractsofrootsfromN07-6underdifferenttreatmentswereseparatedandanalyzedusingproteomicmethods.Themainresultsareasfollows:

1.EnhancementofphysiologicalpropertiesbyH2O2pretreatmentanddifferencebetweenricecultivars

50μMCdexposuresignificantlyinhibitedthericegrowth,reducedplantheight,rootlength,dryweightsofshootsandroots,andincreasedMDAcontents（enhancinglipidperoxidation）.Therewasasignificantdifferencebetweencultivars.N07-6showedgreaterdeclinethanN07-63inthebiomass,andtheMDAlevelintheformercultivarwashigher.ComparedtoCd-stressedonly,additionofH2O2increasedthebiomassofrice,andN07-63growedbetterthanN07-6,byreducingMDAinN07-63tothelevelofCK.TheH2O2pretreatmentalonehadnosignificanteffectsonriceexceptthattheshootheightwasreduced.

AfterCdexposure,comparedwithN07-6,N07-63accumulatedmoreCdintheroots,butCdinshootsandCdtranslocationratiowerelowerthanthatofN07-6.TheH2O2pretreatmentenhancedCduptakeinrootsofN07-63,butCdinshootsandrootsofN07-6werereduced.Meanwhile,S/Rratiosoftwocultivarsdeclined,andtherewasasignificantdifferencebetweenthetwocultivars.N07-63hadaclearlylowerCdtranslocation.

CadmiuminducedproductionsofNPT,GSH,PCsandenhancedGSTactivitiesinthetwocultivars.Theincreasesof-SHamountandGSTactivityintherootofN07-63weresignificantlyhigherthanthoseofN07-6.ThepretreatmentofH2O2furtherincreasedthecontentsofGSH,NPTandPCsandtheGSTactivitiesinriceroot.N07-63hadlargerincreasesforthoseparameters,suggestingitsCdtolerancewasenhancedfurther.

Theabove-mentionedresultsdemonstratedthattheCdtoleranceenhancementfollowingH2O2pretreatmentwasdifferentbetweenthetwocultivars.FortheN07-63,theCdtoxicityalleviationbyH2O2pretreatmentwasmoreobvious.Thismayberelatedtothehigheramountof–SHcontainingcompounds（GSH,NPT,PCs）andhigheractivitiesofdetoxificationenzymeGST,aswellaslowerCdtranslocationintherootofthetolerantricecultivar.

2.IncreaseoftolerantproteinexpressionbyH2O2pretreatmentinriceroots

ProteinsincrudeextractsofrootsfromN07-6weresepratedbySDS-PAGE,andtheproteinbandswerecutoutforingeldigestions.TheresultingpeptideswereevaluatedbyMALDI-TOFmassspectrometry.Throughthecomparisonwithproteindatabase（SwissProt56.7）,weidentifiedthreeproteins:

Glutathionereductase（GR）,Nucleosidediphosphatekinase（NDPK）,Thioredoxin（Trx）.Theyareimportantproteinsforcellredoxstateandnormalmetabolism,whichcanreduceinjurycausedbyCd.WepresumedthatH2O2improvedCdtolerancebyboostingexpressionofcorrelatedproteins.

KEYWORDS:

Cd;H2O2;rice;tolerance

绪论

随着人类活动诸如工业“三废”排放，农药化肥使用，污水灌溉等行为的扩大化，土壤重金属污染已经成为全球性的环境与农产品安全生产问题。

据统计，目前被Cd、As、Pb等重金属污染的耕地面积已近2000万hm2，约占总耕地面积的1/5，造成的经济损失仅在粮食作物上每年达200亿元（顾继光和周启星，2002；曾咏梅等，2005）。

Cd是自然界中普遍存在的一种重金属，但由于其具有高移动性和强毒性，即使低浓度下对人体健康也能产生危害，Cd易被植物吸收并转移至地上可食用部位，进而通过食物链进入人体，所以它是毒性最强的重金属之一，1974年联合国环境规划局和国际劳动卫生重金属委员会将Cd定为重点环境污染物。

Cd对植物的毒害作用表现为抑制种子萌发，幼苗生长，叶片枯黄；造成膜质过氧化作用，干扰许多细胞内生理过程，扰动抗氧化系统，导致氧化胁迫。

在长期的逆境条件下，植物进化出了对Cd的耐性解毒机制，其中含有巯基物质（GSH、PCs）的络合作用及区室化作为重要的机制之一（Salt等，1995；Bricker等，2001），在分析植物对Cd胁迫的响应过程中被广泛研究（Aina等，2007）。

植物能产生与Cd有高度亲和力的巯基物质，包括高分子量物质PCs，低分子量物质GSH或结构简单的PC（Toppi等，1998），它们与Cd形成络合物后被转运到液泡沉积（Tommasini等，1998；Rea，1999），减轻自由态Cd2+对植物的伤害，有效减低了Cd的转运。

在这一过程中，作为植物体内重要的解毒酶，GST催化GSH与Cd胁迫产生的有毒物质结合，其可能表现出GPX功能直接清除膜脂过氧化产物，还可能与GSH一起结合、转运Cd并将其钝化（Marrs，1996；Edwards等，2000；Adamis等，2004；2007）。

H2O2是植物产生的活性氧物质（ROS）之一。

近年来，H2O2作为植物体内信号分子的论点已被提出，低浓度的H2O2能调控多种防御物质的表达（Polidoros和Scandalios，1999；Neill等，2002）如同环境胁迫驯化，使植物细胞预先经受适度的氧化胁迫驯化，进而提高其对环境胁迫的抵抗力（Prasad等，1994；Schreck等，1991）。

H2O2作为信号物质在提高作物对外界环境胁迫耐性的各种机制中有潜在的重要性。

已有很多研究表明，H2O2预处理能增强作物耐寒性（Akio等，2002；Wahid等，2007），耐盐性（Prasad等，1994a；Prasad等，1994b；Yu等，2002），耐热性（Akio等，2002；张立军等，2008）。

利用信号物质增强作物耐性以达到提高产量和质量的研究已经很受关注，而目前关于H2O2增强水稻耐Cd性的机制研究很少见报道。

缓解Cd对水稻的毒害和实现其安全生产的根本途径是控制土壤Cd污染。

对于Cd污染土壤，我们需要找到增强水稻Cd耐性同时又能限制Cd向稻米中转移的途径。

水稻是研究Cd毒害和耐性机制的模式植物，且苗期对Cd的吸收积累和全生育期对Cd的积累有较强的相关关系（余飞宇，2008），同时PCs、GSH是植物细胞内络合Cd，解除Cd毒性的重要物质，因此，探讨增强水稻苗期耐Cd性的机制对控制Cd污染研究具有重要意义。

水稻对Cd的耐性在品种间存在着一定的差异，这就为筛选耐Cd性品种在Cd污染土壤上经济有效地生产安全农产品提供了可能性。

本试验采用水培法研究了H2O2（100μM）预处理对耐性不同的两种水稻耐Cd性及吸收转运Cd的影响，旨在阐明水稻解除Cd毒害的机理，揭示H2O2作为信号物质在增强Cd耐性中的作用及品种间差异。

本研究包括以下两大部分：

1．H2O2预处理下不同水稻耐Cd性提高的相关机制研究及品种间差异：

（1）H2O2预处理对Cd胁迫下两种水稻生长的影响；

（2）H2O2预处理对两种水稻吸收转运Cd的影响。

（3）H2O2预处理对Cd胁迫下两种水稻体内膜脂过氧化（MDA）的影响；（4）H2O2预处理对Cd胁迫下两种水稻巯基物质和GST活性的影响，旨在为探索缓解水稻Cd毒害、减少Cd转运的途径提供依据。

2．H2O2预处理对水稻根部蛋白表达的影响：

运用蛋白质组学的方法，分离鉴定水稻幼苗根部粗提液中表达量增加的蛋白，为H2O2作为信号分子调控相关蛋白的表达提供理论依据。

整个试验技术路线为：

不同耐性的水稻品种N07-63和N07-6

水稻种植：

晒种，NaClO消毒，浸种，催芽，培养

水稻处理：

对照；100μmol/LH2O2（24h）；50μmol/LCd（1周）；

100μmol/LH2O2（24h）＋50μmol/LCd（1周）

水稻根部蛋白分离、鉴定水稻生理指标测定

生长情况膜脂过氧化程度巯基物质含量GST活性Cd的吸收和转运

第一章文献综述

1.Cd污染现状

Cd元素（密度8.6g/cm3）在1817年由德国人从不纯的氧化锌样品中发现，具有很强的毒性（Méndez-Armenta和Ríos，2007）。

在联合国环境规划署1984年提出的12种具有全球性意义的危险化学物质中,Cd就被列在首位，因其在土壤-植物系统中的高度移动性和对作物的高度毒害性，被视为重金属污染中最具有危害性的一种（Vázquez等，2006；王琴儿等，2007）。

虽然Cd是植物的非必需元素，但其生物累计系数在植物体内很高，可能超过许多必需元素（Kabata-Pendias，2001）。

Cd被植物根部吸收后向可食部位转运（Clemens，2001），然后通过食物链进入人体内，有文章指出，对植物没有毒害的Cd浓度可以危害到人类和动物健康，所以，在食物链层次Cd是重要的有毒金属之一（Jackson和Alloway，1992）。

据统计，人体中90%的Cd来自食物，其中70%的Cd来自于植物性食物即农副产品摄取（Wagner，1993；Obata和Umebayashi，1997）。

Cd在动物体内尤其是肾，肝，生殖器官中累积，人体内Cd含量增加能导致肾衰竭，而且食物中低Cd水平关系到肾功能障碍，与Cd有关的疾病还包括肺水肿、肝损害、高血压、骨痛病（Yeung和Hsu，2005；Basta等，1998），国际癌症研究机构（IARC）在1993年将Cd归为人类致癌物（Waalkes，2000；Michael，2000）。

因而环境中Cd污染已引起各国政府和科学研究者的极大关注。

首次Cd危害人类健康事件是1938年工人暴露于存在Cd的环境后肺发生的损害。

1948年，Friberg报告了在蓄电池工厂工人的肺气肿。

二战后，日本发生的痛痛病让人们对Cd更加关注（Nordberg，2004）。

Cd的来源除自然环境外，人类活动是释放Cd的主要途径，据统计，人类来源Cd的释放量每年在30000t（李兆君等，2004）。

电镀，塑料品制造，采矿，合金，含Cd电池等工业程序产生的废物都能使Cd进入环境（Adriano，2001；Cordero等，2004），Cd还被用作发光表面，橡胶硬化，杀真菌剂等（Adriano，2001）。

土壤Cd污染来源主要有以下几种（赵中秋等，2005）：

（1）矿产开采。

Cd的最早是分离锌矿时发现的，Cd往往与铅锌矿伴生。

（2）污水灌溉。

许多工业活动排出的废水含有包括Cd在内的部分重金属等污染物质。

一些水资源缺乏的地区将这些工业废水引入农田灌溉，导致了Cd在农田土壤的积累。

（3）各种土壤增肥物料。

作为肥料施入农田的一些污泥、煤泥、土壤改良剂等除含氮、磷及有机质外，还含有各种对作物和人类有害的重金属。

（4）含Cd磷肥。

商业磷肥中含有不同水平的Cd，长期施用磷肥则导致土壤中Cd的积累，进而增加了作物中Cd的质量分数。

因此在某些国家和地区，含Cd磷肥被认为是农业土壤污染的重要来源。

（5）大气沉降。

大气沉降也是土壤Cd来源的一个不可忽视的部分，目前也逐渐引起了人们的重视。

如今，随着工业“三废”排放量增加，化学肥料施用，污水灌溉，污泥农用更频繁，使Cd间接或直接地进入土壤，进一步对动植物和人类造成威胁（蒋先军等，2001）。

据不完全统计，在中国2×105hm2农田和14.6×108kg农产品被Cd污染（Gu和Zhou，2002；Li等，2003）。

2．Cd在土壤-植物系统中的迁移转化

目前Cd已成为影响食物安全和人体健康的重要污染物之一，国内外众多学者致力于作物可食部分Cd的积累控制的研究。

虽然作物可食部分对Cd的积累随植物种类不同而有差别，但很大程度上取决于植物对Cd的吸收效率，即土壤中的Cd向植物根部和地上部迁移转化的过程（赵中秋等，2005）。

2.1植物对土壤中Cd吸收的影响因素

植物吸收的Cd主要来源于土壤，土壤pH、Eh、有机质、其它金属元素等因素影响着Cd在土壤-植物系统中的迁移转化。

pH：

土壤中重金属的生物有效性及其对生物的毒性主要依赖于土壤中可溶性或可交换重金属的质量分数，而非这种重金属的总质量分数（Sauvé等，1996；Sauvé等，1998；Murray和Mcbride，2002）。

土壤pH值是土壤所有参数中影响Cd形态和有效性的最重要因素（Murray和Mcbride，2002；Singh和Kristen，1998），土壤中Cd的有效性即Cd在土壤中的化学形态和吸附解吸行为很大程度上受土壤pH的调节。

提高土壤pH值，土壤胶体负电荷增加，H+的竞争能力减弱，使重金属被结合得更牢固，多以难溶的氢氧化物或碳酸盐及磷酸盐的形式存在，Cd的有效性就大大降低了（Singh和Kristen，1998）。

Eh：

研究表明，土壤的Eh值在很大程度上影响着植物对一些微量重金属元素的吸收。

土壤中重金属元素可与硫化物形成沉淀，与有机质络合，被铁锰氧化物吸附，这些行为受到土壤氧化还原状况的调节。

Cd在氧化条件下（Eh值高）比在还原条件下（Eh值低）更容易由无效态转化为水溶态和交换态，这种转化在酸性条件下尤为明显。

pH值为4.5时，处于氧化状态的植物Cd含量是还原条件下的几十倍（Gambrell和Patrick，1987；Gambrell等，1991）。

随着Eh值的增大，土壤中水溶性Cd含量、水稻吸收Cd的总量及地上部Cd量随之增加（Reddy，1977）。

这可能是因为在还原状况下，Cd易与硫化物结合形成CdS沉淀，这是一种高度难溶性物质。

当土壤处于氧化状态，硫化物不稳定发生氧化，从而使Cd等重金属元素释放出来（刘文菊等，2000）。

有机质：

土壤中的有机质具有大量的功能团，对Cd等重金属离子的吸附能力远远高于其它任何矿质胶体，更重要的是，由有机质分解的小分子有机酸、腐殖酸等可与Cd