免疫学实验指导.docx

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免疫学实验指导

实验一免疫球蛋白的粗提（盐析法）

一、实验目的

1、学习免疫球蛋白的粗提方法

2、实践IgG分离纯化过程

3、了解分离纯化抗体的原理

二、实验原理

随着免疫学的发展和需要，免疫球蛋白的纯化和其成分的提纯成为必不可少的手段。

纯化的方法很多，有单一法，常用盐析法、凝胶柱层析、离子交换剂层析以及免疫亲和层析等技术对血清抗体进行分离纯化。

但大多数采用二步法以上相结合的方法，特别是以硫酸铵提纯为基础，再经过透析或层析柱的方法来提高免疫球蛋白及其各成分的纯度最为常用。

硫酸铵溶液能使蛋白质胶体脱水并中和其电荷而使之沉淀下来（称为盐析）。

不同浓度的硫酸铵盐析蛋白成分不同，利用这一原理提取所需的免疫球蛋白成分。

盐析只能粗提，为了获得纯化的免疫球蛋白成分，必须进一步采用层析的方法进行分离。

水膜与同性电荷的排斥作用是蛋白质胶体稳定的基础，在蛋白质胶体溶液中加入一定量的（NH4）2SO4或Na2SO4盐类，使溶液中大部分自由水分子转变为离子水化分子，降低蛋白质极性基团与水分子的相互作用，破坏蛋白质水膜，蛋白质溶解度也随之降低。

蛋白质由于分子质量和携带的电荷不同，可在不同浓度的高盐溶液内分级析出。

33%（NH4）2SO4为沉淀IgG的最适饱和度。

二、实验材料与试剂配制

1．人全血清（购买商品）

2．硫酸铵饱和溶液

硫酸铵800g~850g

H2O1000ml

加热至绝大部分溶质溶解为止，趁热过滤，置室温过夜，然后以28％NH4OH调pH至7.0（不调pH值也可以）。

注：

硫酸铵以质量优者为佳，因次品中含有少量重金属对蛋白质巯基有影响。

如次品必须除去重金属，可在溶液中通入H2S，静置过夜后滤过，加热蒸发H2S即可。

3．0.01Mol/LpH7.4PBS液

A液：

0.10Mol/LNaH2PO4液

NaH2PO4·2H2O15.60g

加H2O至1000ml

B液：

0.10Mol/LNa2HPO4液

Na2HPO4·12H2O35.80g

加H2O至1000ml

取A液19ml，B液81ml加水至1000ml即可。

4．0.50Mol/L的HCl液和0.50Mol/L的NaOH液

三、实验步骤

1、取免疫血清0.25mL置于1.5ml离心管中，加0.25mL生理盐水/PBS

2、逐滴加入饱和（NH4）2SO40.5mL（此时为50%饱和度），4℃，静置20min，3000r/min离心20min

3、弃上清，取沉淀溶于1mL生理盐水/PBS中

4、逐滴加入饱和（NH4）2SO40.5mL（此时为33%饱和度），4℃，静置20min，3000r/min离心20min

5.重复步骤3～4，2次

6.取沉淀溶于0.5mL生理盐水中，-20摄氏度保存备用

四、注意事项

1、盐析时注意饱和硫酸铵加入血清中的速度和方式，边加边缓慢摇动，并避免产生气泡。

2、注意区别前后2次盐析所采用的饱和硫酸铵的终浓度。

五、实验报告

1、记录实验步骤结果

2、思考题：

分离纯化IgG时，为什么硫酸铵的饱和度先调至50%，然后调至33%？

加入硫酸铵溶液时，为什么要一滴滴地加？

实验二琼脂糖免疫电泳实验

一、实验目的

1、了解免疫电泳的原理和用途。

2、掌握免疫电泳的操作过程和方法。

3、掌握免疫电泳实验结果的分析方法，并对粗提的蛋白进行检测。

二、实验原理

免疫电泳为区带电泳与双向免疫扩散的结合。

先利用区带电泳技术将不同电荷和分子量的蛋白抗原在琼脂内分离，然后在与电泳方向平行的方向上开槽，加入抗血清。

37℃下使两者扩散，各区带蛋白在相应的位置与抗体反应形成弧形沉淀线。

免疫电泳原理见图。

三、实验材料和试剂配制

人全血清、粗提蛋白、兔抗人血清、琼脂糖、0.05mol/L巴比妥缓冲液（PH8.6）、电泳槽、电泳仪、载玻片、毛细管、塑料吸管

四、实验步骤

1、配制1.5％的琼脂糖，加热使之融化，（巴比妥缓冲液配制）

2、吸取4－5mL琼脂糖溶液，均匀涂布到载玻片上，注意要马上用吸管尖把琼脂表面整平，若有气泡立刻除去，并立即于中间横放一根毛细管，待凝，制成2mm的琼脂板。

3、打孔及开槽，挑去孔内的琼脂，槽内琼脂暂不挑出。

（打一个孔即可）。

于酒精灯上小心烘烤，使琼脂与玻璃板贴紧。

4、用微量加样器加入10－20uL的粗提蛋白和人全血清，不要溢出（可加入指示剂）。

5、把载玻片放到电泳槽中，倒入巴比妥缓冲液，琼脂板两端用滤纸与缓冲液搭桥，接通电源，电压10-12v/cm电泳1-2h。

6、样品中有蓝色染料，当蓝色接近另一端时，终止电泳，小心取出载玻片。

7、用刀片在胶体的中央，划两道平行线。

刀刻要深及底部，两道平行线间隔不可大于3mm。

用大头针挑去琼脂。

8、加入兔抗人血清，放入湿盒中，37℃下扩散24h。

9、观察实验结果

五、实验结果

观察沉淀弧的位置和条数，并画出沉淀弧。

五、注意事项

1、抗原与抗体浓度比例应适当，否则会使某些成分不出现沉淀线。

当蛋白质抗原浓度高于20g/L，应用缓冲液稀释后再进行电泳和扩散。

2、浇板时要求厚度均匀，无气泡。

3、打孔挖槽时要求外壁整齐，防止琼脂破裂。

4、扩散过程中需要在不同时间进行结果观察，做好记录。

5、每次电泳后应倒换正负电极或将两槽缓冲液混合后再使用

实验三酶联免疫吸附（ELISA）夹心法测乙肝表面抗原（HBsAg）

一、实验目的

1．熟悉ELISA的原理、夹心法。

2．了解免疫标记技术的原理。

二、实验原理

免疫酶技术是将抗原抗体反应的特异性与酶的高效催化作用有机结合的一种方法。

它以酶作为标记物，与抗体（或抗原）联结，与相应的抗原（或抗体）作用后，通过底物的颜色反应作抗原抗体的定性和定量，亦可用于组织中抗原或抗体的定位研究，即酶免疫组织化学技术。

目前应用最多的免疫酶技术是酶联免疫吸附实验（ELISA），它是将可溶性抗原（或抗体）吸附于固相载体上，加入酶标抗体（或抗原）与吸附在载体上的抗原（或抗体）结合，形成酶标记复合物，再加入酶底物时，即可显色。

颜色反应的深浅与相应的抗体或抗原量相关。

常用的酶有辣根过氧化物酶（HRP）和碱性磷酸酶（AP），相应的底物分别是邻苯二胺（OPD）和对硝基苯磷酸盐。

实验方法有间接法、夹心法和竞争法。

在本次实验中，采用多克隆抗-HBs包被反应板，加入待测标本，同时加入单克隆抗-HBs-HRP，如待测标本中含有HBsAg时就与包被抗-HBs、抗-HBs-HRP结合形成复合物，加入TMB底物产生显色反应，反之就无显色反应。

三、实验材料

1．乙肝病毒HBsAg酶联免疫诊断试剂盒（包含以下部分）。

　　预包被微孔条（用纯化的抗-HBs包被）。

　　酶联试剂（用HRP标记的抗HBs）。

　　HBsAg阳性对照。

　　HBsAg阴性对照。

　　洗涤液（浓缩液）。

　　显色剂A、B。

　　终止液（2mol/LH2SO4）。

2．微量加样器，混合振荡器，恒温箱，吸水纸，蒸馏水等。

四、实验方法

1．配液浓缩洗涤液用蒸馏水或去离子水25倍稀释使用。

2．编号将微孔条固定于支架，按序编号。

3．加样分别用加样器加待检血清和阴、阳性对照50μ1（1滴）于相应孔中，设空白对照孔（加50μ1洗涤液）。

4．加酶除空白对照外，每孔加酶联试剂50μl（1滴）。

5．温育振荡混匀，置37℃30min后取出。

6．洗涤甩去孔内液体，扣干，用洗涤液注满各孔，静置2s，甩干，重复5次后拍干。

7．显色每孔加显色剂A、B各50μl（1滴）振荡混匀，37℃暗置15min。

五、实验结果

1．在白色背景下观察各孔显色情况，有明显蓝色者为阳性，无色者为阴性。

六、注意事项

1．试剂盒应于4℃存放，在有效期内使用。

2．微孔条须密封防潮，从冷藏环境中取出时,应在室温中平衡至潮气尽干后方可开封启用，余者及时封存。

3．滴加试剂前应将瓶摇匀，使液体混匀。

滴加时瓶身应保持垂直，以使滴量准确，注意勿将试剂滴在孔壁上。

4．洗涤时各孔均须加满，防止孔口内有游离酶未能洗净。

5．待测标本不可用NaN3防腐。

所有样品都应按传染源处理。

实验四血涂片的制作及免疫细胞形态观察

　　一、目的要求

（一）掌握微量采血及血涂片的制作方法。

（二）学习使用光学显微镜观察免疫细胞。

　　二、实验原理

血涂片是临床化验中最常规的技术，也是血液学研究中的最基本技术。

将血液样品制成单层细胞的涂片标本，经瑞氏（Wright）染液染色后，不同免疫细胞中的颗粒可以呈现不同的颜色。

根据细胞中颗粒的颜色、大小及多少，再结合细胞的大小及细胞核的形态，就可以将免疫细胞进行分类计数。

三、实验器材

医用一次性采血针、酒精棉球、镊子、经脱脂洗净的载玻片等

四、实验试剂

伊红-甲基蓝染液

取伊红-甲基蓝粉末0.1克（旧称瑞氏染剂），放在研缽内加适量甘油研磨。

量取纯甲醇60毫升，少许倒入研缽内使染料溶解，已溶部分移入棕色瓶中，未溶部分再加少许甲醇研磨，直到全部溶解为止。

把装染液的棕色瓶密封放阴暗处保存。

最好提前半年配制。

　　五、实验步骤

　　1．采血

　　采血前用70%酒精棉球消毒人的指腹或耳垂，干后用采血针刺破指腹或耳垂的皮肤；挤去第一滴血不要（因含单核细胞较多）。

2．涂片

挤出第二滴血置于载玻片的一端，再取另一张边缘光滑的载玻片，斜置于血涂片的前缘，先向后稍移动轻轻触及血滴，使血液沿玻片端展开成线状，两玻片的角度以30°~40°角为宜（角度过大血膜较厚，角度小则血膜薄），轻轻将载玻片向前推进，即涂成血液薄膜（如下图），推进时速度要一致，否则血膜成波浪形，厚薄不匀。

3．染色

待涂片在空气中完全干燥后，将伊红-甲基蓝染液滴在血膜上，至染液淹没全部血膜，染半分钟。

加等量蒸馏水或缓冲液与染液混合再染5分钟。

最后用蒸馏水把染液冲掉，用吸水纸吸干，待自然干燥后，即可。

涂片如有色渣，可用三种方法清除：

一是再加伊红-甲基蓝染液于涂片上，略加摆动，使色渣溶于甲醇中，待甲醇挥发，加蒸馏水或缓冲液。

二是把血片放水槽中，保持水平，色渣即从玻片边缘溢出。

三是把血片呈45°倾斜，吸95%酒精徐徐滴涂片面，至流下酒精变蓝后，清水冲净晾干。

涂片如有香柏油，用擦镜纸擦去仍可用酒精处理。

4．观察

　　分别用低倍、高倍和油镜观察血涂片，分辨不同的血细胞类型。

用低倍镜观察血涂片，可见红细胞染成粉红色，呈中间色浅、周围色深的圆盘状，没有细胞核。

白细胞较少，难找到，多集中在涂片边缘或推片方向前缘。

比红细胞大，染成蓝紫、红紫色。

主要看白细胞中较多的嗜中性粒细胞与淋巴细胞的形态。

　　1.嗜中性粒细胞细胞质染成红紫色，核染成蓝紫色。

核分为2～5叶。

刚成熟的细胞仅有一叶呈“S”状的细胞核。

　　2.淋巴细胞直径大小不一，以小淋巴细胞为主，其大小与红细胞相似。

细胞核呈圆形或卵圆形，一侧有凹痕，染色质致密块状，被染成深蓝紫色。

核周围可见少数淡蓝色细胞质。

　　3.血小板为不规则小体，直径约2～3微米。

血小板周围部分为浅蓝色，中央有细小的紫红色颗粒，且聚集成群。

　　六、实验报告

　　标出并分析比较各种免疫细胞类型和形态特征。