细胞自噬研究综述讲课稿.docx

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细胞自噬研究综述讲课稿

细胞自噬研究综述

细胞自噬研究综述

一、概述

细胞自噬是广泛存在于真核细胞内的一种溶酶体依赖性的降解途径。

是真核生物中进化保守的对细胞内物质进行周转的重要过程。

细胞自噬导致细胞内长寿命蛋白和受损伤细胞器的降解，使细胞在应激条件下循环利用营养物质和三羧酸循环产生的ATP继续生存。

根据细胞内底物运送到溶酶体腔方式的不同，哺乳动物细胞自噬可分为微自噬（microautophagy）、巨自噬（macroautophagy）和分子伴侣介导的自噬（Chaperone-mediatedautophagy，CMA）三种主要方式，但目前研究最为广泛的是巨自噬。

细胞自噬与细胞凋亡、细胞衰老一样，是十分重要的生物学现象，参与生物的发育、生长等多种过程，细胞自噬的异常导致癌细胞的出现。

研究表明，细胞自噬在细胞内稳态、癌症、心力衰竭、神经退行性疾病、传染病、衰老相关性疾病等生命过程中发挥着重要作用。

二、细胞自噬的形式

微自噬是指溶酶体或者液泡内膜直接内陷底物包裹并降解的过程。

多在种子成熟时储藏蛋白的沉积或萌发时储存蛋白的降解中起作用。

巨自噬是在其过程中，底物蛋白被一种双层膜的结构（粗面内质网的无核糖体附着区脱落的双层膜）包裹后形成直径约400~900纳米大小的自噬小泡（autophagosome），接着自噬小泡的外膜与溶酶体膜或者液泡膜融合，释放包裹底物蛋白的泡状结构到溶酶体或者液泡中，并最终在一系列水解酶的作用下将其降解，我们将这种进入溶酶体或者液泡腔中的泡状结构称为自噬小体。

它作用于营养缺乏条件下培养的细胞、植物的免疫反应、叶片衰老及环境胁迫应答。

介导自噬是在动物细胞衰老反应过程中，往往发生分子伴侣介导的自噬过程，保存必须的组成细胞结构的蛋白和其他材料。

三、细胞自噬的功能

生理性自噬是细胞的自我保护机制，有益于细胞的生长发育，保护细胞防止代谢应激和氧化损伤，对维持细胞内稳态以及细胞产物的合成、降解和循环再利用具有重要作用；但自噬过度可能导致代谢应激、降解细胞成分、细胞死亡等，打破细胞生长和死亡（细胞死亡至少分为三种形态学上不同的进程，即细胞凋亡、自噬性细胞死亡和坏死，此处所指的死亡可能伴随着细胞自噬，过度自噬以一种不同于细胞凋亡和坏死的方式使细胞死亡，但自噬与二者还有一定的关联性，比如Bcl-2和Beclin1之间的互作）间的平衡。

自噬在多种生理病理过程中发挥重要作用。

缺血再灌注显著上调Beclin1，激发心机细胞自噬；Beclin1表达下调抑制自噬，减弱心肌损伤。

研究认为，自噬是动脉粥样硬化发展过程中的一种保护机制，因为自噬通过加工氧化修饰蛋白使斑块固化，而自噬缺陷加剧动脉粥样硬化。

在肿瘤细胞生物学上，根据细胞基因组成和细胞所处环境变化，自噬既能抑制肿瘤抑制因素发挥作用，自噬基因的缺失又可促进肿瘤的生成。

研究发现，一方面，自噬可使乳腺癌细胞继续生存；而另一方面，自噬又可导致结肠癌细胞HCT116的死亡。

目前普遍认为，在乏氧、营养缺乏、代谢应激等条件以及抗癌治疗（如化学疗法、放射疗法）等环境下，癌细胞通过自噬可以继续生存。

此外，自噬还可能继续生存。

此外，自噬还可能在衰老、炎症、细胞凋亡、胞内病原体入侵、神经退行性疾病等方面发挥着重要作用。

四、细胞自噬调控的分子机制

1．泛素样蛋白系统对细胞自噬的调控

泛素化是在翻译后水平上进行蛋白修饰的一种方式，参与蛋白酶体依赖性蛋白水解、蛋白功能调控、亚细胞分布和/或蛋白质互作。

在泛素激活酶（ubiquitin-activatingenzyme，El）、泛素接合酶ubiquitin-conjugatingenzyme，E2）以及泛素蛋白连接酶（ubiquitin-proteinligase，E3）的连续作用下，泛素与底物蛋白特定的Lys残基共价结合完成泛素化。

同时，泛素化也是一种可逆性的过程，可由去泛素化酶将泛素从蛋白质上除去。

泛素化主要包括以下3步酶促反应过程：

（1）在ATP作用下，E1可在其Cys和泛素的C-端的Gly之间形成巯酯键，即E1-SH～Ub，从而激活泛素；

（2）在ATP和E2酶作用下，泛素从E1转移到E2上，同样以巯酯键的方式结合（E2-SH～Ub）；

（3）E3酶可以特异性识别底物蛋白并与之结合，与此同时E2将激活的泛素直接转移到某些E3结合的底物上，经过多个重复，多个泛素之间通过Lys相互连接，在底物上形成多

泛素链。

E1-样酶Atg7和E2-样酶Atg10泛素样反应后，泛素样蛋白Atg12与Atg5Lys130共价耦联，Atg16L1作为连接蛋白，增强Atg12和E3泛素连接酶样蛋白Atg5间的互作，而后Atg12-Atg5与Atg16L1形成E3连接酶样复合体并定位于PAS。

半胱氨酸酶Atg4酶切LC3并暴露C-端最后5个Gly残基，在E2-样酶Atg3辅助下，与磷脂酰乙醇胺（phosphatidylethanolamine，PE）发生E3-样共轭形成脂化的LC3（LC3-II）并定位于PAS，吞噬泡加工成为成熟自噬体。

2.mTOR信号通路对细胞自噬的调控

mTOR（mammaliantargetofrapamycin）属于Ser/Thr激酶，参与细胞发育、核糖体生成和代谢调控等生物学过程。

mTOR包括雷帕霉素敏感型mTORC1和雷帕霉素非敏感型mTORC2。

mTORC1通过磷酸化ULK1-Atg13-RB1CC1-C12orf44/Atg101复合体使其失活，从而负调控细胞自噬体的形成，其活化程度可反映自噬水平，如果阻断mTORC1的功能，Ser/Thr激酶可磷酸化Atg1复合体并激活自噬。

mTORC2的磷酸化能激活Akt（PKB）和Atg1抑制自噬，也可上调HIF1A（hypoxia-induciblefactor1A）的表达。

mTOR调控细胞自噬主要包括mTOR非依赖性和mTOR依赖性两条信号通路。

（1）mTOR非依赖性信号通路

有实验发现，Mst1（mammalianSte20-likekinase1）可使Beclin1BH3结构域N-端的Thr108磷酸化，增强Beclin1与Bcl-2和/或Bcl-xL疏水沟α3螺旋间的互作，使Beclin1同源二聚体稳定，减弱Atg14L与Beclin1的结合，降低Beclin1-PI3K-Atg14L复合体脂激酶Vps34的活性以抑制自噬。

Molejon等认为，VMP1（vacuolemembraneprotein1）20位氨基酸残基C-端亲水性结构域（VMP1-AtgD）与Beclin1BH3结构域结合致使Bcl-2与Beclin1解离，最终形成VMP1-Beclin1-hVps34-Atg14L复合体共同定位于PAS，启动PI3P生成、泛素样级联反应和囊泡的形成。

有趣的是，棉酚衍生物ApoG2与Mst1作用相反，ApoG2破坏Beclin1和Bcl-2/xL的互作，释放出Beclin1BH3结构域，从而诱导自噬，但氯喹可阻断自噬体与溶酶体的融合。

而EGFR（epidermalgrowthfactorreceptor）通过磷酸化Beclin1多个位点的酪氨酸，增强Beclin1与抑制剂的结合能力，降低Vps34脂激酶活性以抑制自噬。

（2）mTOR依赖性信号通路

Qased等发现，Ser/Thr蛋白激酶ATM（ataxiatelangiectasiamutated）属PIKK（PI3K-relatedproteinkinase）家族，ATMC-端序列与PI3K催化区同源，其能够刺激LBK/AMPK/TSC2通路的下游信号，抑制mTORC1。

mTORC1被抑制后可激活ULK1（unc-51

likeautophagyactivatingkinase1），ULK1通过与UVRAG结合再使Beclin1Ser14磷酸化，从而增强Beclin1-Vps34-Atg14L复合体的活性，启动自噬。

此外，作为ULK复合体的重要组成成分，FIP200的缺失会造成MEF（mouseembryonicfibroblast）的Atg14-Atg1-WIPI诱导缺陷。

然而，Efeyan等指出，RagGTPases活化后能够募集mTORC1进入到溶酶体表面导致自噬缺陷。

除前述作用外，ApoG2亦可抑制线粒体电子传递以产生ROS（reactiveoxygenspecies），ROS通过提高ERK（extracellularregulatedproteinkinases）、JNK（c-JunN-terminalkinases）（靶作用于Bim和Atg5）的磷酸化水平，加快HMGB1（high-mobilitygroupbox1）从细胞核到细胞质的转运，以及抑制mTOR信号，启动细胞自噬。

但NAC（N-acetyl-cysteine）可减弱HMGB1从细胞核到细胞质的转运，诱导细胞凋亡和杀伤。

同样，EGFR也可使PI3K、Akt和mTOR的酪氨酸磷酸化，负调控细胞自噬。

（3）其他信号对细胞自噬的调控

研究表明，在细胞核中，p53可通过sestrin1/2蛋白激活AMPKmTORC1信号通路，从而抑制mTORC1以上调自噬水平；也可通过激活DAPK1（death-associatedproteinkinase1），磷酸化Beclin1，促进细胞自噬；还能通过激活抗凋亡蛋白Bcl-2家族，解除Bcl-2/xL与

Beclin1之间的抑制作用而上调细胞自噬。

而在细胞质中，p53缺失的癌细胞的自噬水平上调，重新载入p53后可下调细胞自噬水平。

还有研究表明，脂多糖（lipopolysaccharide，LPS）可通过TLR（Tolllikereceptor）调节细胞自噬的水平。

在天然免疫研究中发现，LPS能诱导小鼠单核巨噬细胞和人巨噬细胞自噬体形成，抑制TLR4后自噬体形成明显减少。

LPS/TLR4信号通路介导的自噬可加强TLR4信号通路中髓样分化蛋白（myeloiddifferentiationfactor88，MyD88）或IFN诱导接头蛋白[Toll/interleukin（IL）-1receptorhomologydomain（TIR）-containingadaptorinducinginterferon（IFN）-β，TRIF]与自噬蛋白Beclin1的相互作用，抑制Beclin1和自噬信号通路中Bcl-2的结合，增强NF-κB核转录因子的活性。

此外，PI3K-Akt-FoxO信号通路可介导谷氨酰胺合成酶的活化，参与募集Atg蛋白，提高LC3和ULK2的共定位水平。

ox-LDL（oxidizedlow-densitylipoprotein）极大地促进动脉粥样硬化的发生、发展，适当浓度（10～40μg/mL）的ox-LDL可激活保护性细胞自噬，致使内皮细胞、血管细胞和巨噬细胞的溶酶体降解ox-LDL。

3.miRNA对细胞自噬的调控

microRNA（miRNA）是一类长约22nt的内源性非编码小RNA分子，在转录后水平调控基因的表达。

研究表明，miRNA参与细胞生长发育、炎症、肿瘤、衰老、凋亡等多种生理病理过程。

近年来，还发现miRNA参与了细胞自噬调控，在自噬的发生和形成中发挥重要作用。

miRNA与其靶mRNA3′-UTR部分互补序列配对，通过降解mRNA和/或抑制蛋白翻译来调控基因表达，并且miRNA与其靶mRNA的序列同源性决定了是降解mRNA还是抑制翻译。

营养饥饿、缺氧、雷帕霉素等可诱导细胞自噬，但多数miRNA在自噬过程的不同阶段可通过作用于Atg蛋白以拮抗这种诱导作用，抑制细胞自噬，对细胞造成伤害，且无细胞特异性。

（1）囊泡（吞噬泡）成核阶段

在正常生长条件下，抗凋亡蛋白家族Bcl-2（包括Bcl-2、Bcl-xL、Mcl-1、A1、Bcl-W和Rubicon）与Beclin1结合能力最强，Beclin1BH3结构域与Bcl-2和/或Bcl-xL的疏水沟互作，负调控Beclin1-Vps34PI3K-p150核心复合体的形成和活性，形成Beclin1同源二聚体抑制自噬；当自噬被诱导时，Beclin1与Bcl-2解离启动自噬。

此外，Beclin1CCD（coiled-coildomain）结构域也可与Bcl-2和/或Bcl-xL的BH4结构域互作，但miR-376b、miR-216a、miR-30a、miR-30d都可靶向Beclin1，抑制其表达，减弱Beclin1与Bcl-2的结合和解离能力，从而调控自噬。

Atg9作为唯一的跨膜蛋白，定位于PAS、线粒体和高尔基复合体，启动脂质从生物膜转运到PAS，介导组装完整的囊泡膜，但miR-34a抑制Atg9A表达，中断囊泡成核。

Atg14L可以调节脂激酶Vps34活性，并可募集ULK1以使Beclin1磷酸化，但miR-195靶抑制Atg14，以抑制细胞自噬。

PI3KC3是PI3K复合体的核心蛋白，miR-338-5p通过抑制PI3KC3的表达，阻断囊泡成核，从而负调控细胞自噬。

（2）自噬体的成熟阶段

miR-216a、miR-181-a、miR-30a和miR-30d靶作用于Atg5，miR-375、miR-199a-5p靶作用于Atg7，miR-23b、miR-30d靶作用于Atg12，抑制泛素化蛋白表达，负调控囊泡膜延伸。

除可脂化LC3-I外，Atg4酶（Atg4B）同样可以介导自噬体膜表面的LC3蛋白发生去脂化作用，从而使细胞自噬循环利用LC3蛋白。

研究发现，miR-376b靶作用于Atg4C、miR-101靶作用于Atg4D以抑制细胞自噬。

Suzuki等认为，LC3侧链lys49参与调控LC3和Atg13C-端LIR（LC3interactingregion，氨基酸序列H441D442D443F444V445M446I447）间的互作。

miR-204通过靶向抑制通过靶向抑制LC3B的表达，阻断LC3B的脂化，从而抑制自噬体的成熟。

LC3-II与自噬体形成有关，而未成熟的LC3-I是可溶的。

因此，LC3-II或LC3-II/LC3-I比值常用作自噬体形成的分子标记，用于自噬现象的观察和分析。

（3）自噬溶酶体的融合阶段

研究认为，Atg8不仅参与膜延伸，且可经接头蛋白LIR结构将错误折叠或聚合蛋白质、受损细胞器、病原体募集到自噬体膜进行降解。

酵母Atg8的哺乳动物同源蛋白有7种，即LC3A、LC3B、LC3C、GABARAP、GABARAPL-1、GABARAPL-3、GABARAPL-2，因此LC3亚型与Atg13LIR亲和力的特异性也是影响自噬体形成的关键因素。

但miR-204通过靶抑制LC3B表达，抑制自噬，从而降低自噬溶酶体的分解能力。

此外，miR-22、miR-138、miR-302b、miR-210分别靶作用于HMGB1、Mst1、EGFR、VMP1，且miR-22与HMGB1、Mst1与miR-138、miR-302b与EGFR、miR-210与VMP1均呈负相关，这些miRNA通过抑制蛋白表达，从而负调控前述细胞自噬信号通路。

Ucar等认为，IGF-1（insulinlikegrowthfactor-1）可上调miR-212/132的表达，并且miR-212/132靶抑制FoxO3表达以致弱细胞自噬。

miR-132还可激活PI3K-Akt-mTOR信号通路，抑制细胞自噬。

hsa-let-7g可能通过下调LOX-1、ROS的表达，以抑制细胞自噬。

miR-101还可靶作用于STMN1（在一定程度上拮抗miR-101的抑制作用）、RAB5A，miR-30d靶作用于Atg2，miR-130a靶作用于Atg2B、DICER1，miR-224（可被自噬降解）可能靶作用于Smad4，这些均能够抑制细胞自噬。

研究还发现，除多数miRNA对细胞自噬有抑制作用外，少数miRNA也可增强细胞自噬水平（表2）。

Wan等认为，miR-155、miR-7可靶作用于mTOR信号多种分子，如RHEB、RICTOR和RPS6KB2等，负调控PI3K-Akt-mTOR信号通路，诱导细胞自噬。

此外，miR-99a也可通过抑制mTOR信号、miR-18a通过上调ATM的表达以增强细胞自噬水平。

目前，细胞自噬与miRNA关系的研究还处于初级阶段，关于miRNA如何参与调控自噬的研究有待进一步阐明。

随着研究的深入，不同的miRNA在细胞自噬中的作用与机制将会更加清楚，对理解机体病理生理过程、抗感染以及天然免疫机制等方面具有重要意义。

在自噬过程涉及的复杂的分子调节网络中，解析miRNA与细胞自噬关系，有助于寻找新的自噬调控靶点，也为揭示自噬分子调控机制提供新的思路和策略。

4.细胞自噬调控的其他机制

caspase属于半胱天冬氨酸蛋白酶（cysteinylcontainingaspartate-specificprotease），在正常细胞中，caspase以无活性的酶原形式存在。

MOMP（mitochondrialoutermembranepermeabilisation）是激活caspase的主要机制之一，细胞色素C进入到细胞质启动凋亡复合体的形成，激活caspase-9，caspase-9被裂解后激活caspase-3和caspase-7。

细胞应激激活caspase，活化的caspase能够启动细胞降解，调控细胞凋亡。

研究发现，ATP合成增加能够抑制细胞自噬，而凋亡蛋白caspaseDcp-1调控自噬潮（autophagicflux）的发生。

pro-Dcp-1在线粒体聚集，Dcp-1与核苷酸转移酶SesB互作，降低SesB的稳定性并下调ATP的合成，从而启动细胞自噬。

Atg16L1蛋白发生Thr300Ala/Thr316Ala突变，能够致使caspase-3对Atg16L1的降解敏感性增强，进一步影响自噬体的形成。

但此时，36kDa和34kDa裂解产物的出现，并不是由于caspase-3活性增强所造成的。

calpain是一种钙依赖性的半胱氨酸蛋白酶，可在Atg5蛋白的氨基末端进行裂解，产生一个相对分子质量为24000的产物，从而驱使细胞自噬向细胞凋亡转变，将自噬与凋亡联系起来。

除Atg5蛋白外，Beclin1、Bax也是calpain的作用靶点，更说明自噬与凋亡有一定的关联性。

AMPK（AMP-activatedproteinkinase）是一种异源三聚体，包括α催化亚基1个和调控型β、γ亚基各1个。

多种应激因素可激活AMPK，AMPK活化后既可抑制自噬，又可激活自噬。

细胞渗透性核苷酸类似物AICAR（AICAriboside）可以激活肝细胞AMPK，AMPK磷酸化水平的提高能够抑制细胞自噬，致使神经元胞内泛素化蛋白的累积；而在酵母和多种哺乳动物细胞内，AMPK的活化可以激活自噬。

Yu等认为，蛋白磷酸酶PP2A（proteinphosphatase2A）调控AMPKα和γ亚基间的互作，使AMPKα亚基去磷酸化，从而使AMPK抑制mTOR磷酸化，启动细胞自噬。

研究还认为，蛋白乙酰化是多种细胞进程的关键调控机制。

Yi等对酿酒酵母进行遗传学分析证实，自噬过程必需组蛋白乙酰转移酶Esa1的参与，且Atg3是Esa1的作用底物。

Atg3的K19和K发生乙酰化，控制Atg3-Atg8互作和Atg8的脂化，进而调控细胞自噬。

去除脱乙酰酶Rpd3后，提高K19-K48的乙酰化水平，可以增强细胞自噬。