细胞自噬研究综述讲课稿.docx

1、细胞自噬研究综述讲课稿细胞自噬研究综述细胞自噬研究综述一、概述细胞自噬是广泛存在于真核细胞内的一种溶酶体依赖性的降解途径。是真核生物中进化保守的对细胞内物质进行周转的重要过程。细胞自噬导致细胞内长寿命蛋白和受损伤细胞器的降解，使细胞在应激条件下循环利用营养物质和三羧酸循环产生的ATP继续生存。根据细胞内底物运送到溶酶体腔方式的不同，哺乳动物细胞自噬可分为微自噬（microautophagy)、巨自噬（macroautophagy）和分子伴侣介导的自噬 (Chaperone-mediated autophagy，CMA）三种主要方式，但目前研究最为广泛的是巨自噬。细胞自噬与细胞凋亡、细胞衰老一样

2、，是十分重要的生物学现象，参与生物的发育、生长等多种过程，细胞自噬的异常导致癌细胞的出现。研究表明，细胞自噬在细胞内稳态、癌症、心力衰竭、神经退行性疾病、传染病、衰老相关性疾病等生命过程中发挥着重要作用。二、细胞自噬的形式微自噬是指溶酶体或者液泡内膜直接内陷底物包裹并降解的过程。多在种子成熟时储藏蛋白的沉积或萌发时储存蛋白的降解中起作用。巨自噬是在其过程中，底物蛋白被一种双层膜的结构（粗面内质网的无核糖体附着区脱落的双层膜）包裹后形成直径约400900纳米大小的自噬小泡（autophagosome)，接着自噬小泡的外膜与溶酶体膜或者液泡膜融合，释放包裹底物蛋白的泡状结构到溶酶体或者液泡中，并最

3、终在一系列水解酶的作用下将其降解，我们将这种进入溶酶体或者液泡腔中的泡状结构称为自噬小体。它作用于营养缺乏条件下培养的细胞、植物的免疫反应、叶片衰老及环境胁迫应答。介导自噬是在动物细胞衰老反应过程中，往往发生分子伴侣介导的自噬过程，保存必须的组成细胞结构的蛋白和其他材料。三、细胞自噬的功能生理性自噬是细胞的自我保护机制，有益于细胞的生长发育，保护细胞防止代谢应激和氧化损伤，对维持细胞内稳态以及细胞产物的合成、降解和循环再利用具有重要作用；但自噬过度可能导致代谢应激、降解细胞成分、细胞死亡等，打破细胞生长和死亡（细胞死亡至少分为三种形态学上不同的进程，即细胞凋亡、自噬性细胞死亡和坏死，此处所指的

4、死亡可能伴随着细胞自噬，过度自噬以一种不同于细胞凋亡和坏死的方式使细胞死亡，但自噬与二者还有一定的关联性，比如Bcl-2和Beclin1之间的互作）间的平衡。自噬在多种生理病理过程中发挥重要作用。缺血再灌注显著上调Beclin1，激发心机细胞自噬；Beclin1表达下调抑制自噬，减弱心肌损伤。研究认为，自噬是动脉粥样硬化发展过程中的一种保护机制，因为自噬通过加工氧化修饰蛋白使斑块固化，而自噬缺陷加剧动脉粥样硬化。在肿瘤细胞生物学上，根据细胞基因组成和细胞所处环境变化，自噬既能抑制肿瘤抑制因素发挥作用，自噬基因的缺失又可促进肿瘤的生成。研究发现，一方面，自噬可使乳腺癌细胞继续生存；而另一方面，自

5、噬又可导致结肠癌细胞HCT116的死亡。目前普遍认为，在乏氧、营养缺乏、代谢应激等条件以及抗癌治疗（如化学疗法、放射疗法）等环境下，癌细胞通过自噬可以继续生存。此外，自噬还可能继续生存。此外，自噬还可能在衰老、炎症、细胞凋亡、胞内病原体入侵、神经退行性疾病等方面发挥着重要作用。四、细胞自噬调控的分子机制1泛素样蛋白系统对细胞自噬的调控泛素化是在翻译后水平上进行蛋白修饰的一种方式，参与蛋白酶体依赖性蛋白水解、蛋白功能调控、亚细 胞 分 布 和 / 或 蛋 白 质 互 作 。 在 泛 素 激 活 酶（ubiquitin-activating enzyme ， El ）、 泛 素 接 合 酶ubiq

6、uitin-conjugating enzyme，E2）以及泛素蛋白连接酶（ubiquitin-protein ligase，E3）的连续作用下，泛素与底物蛋白特定的 Lys 残基共价结合完成泛素化。同时，泛素化也是一种可逆性的过程，可由去泛素化酶将泛素从蛋白质上除去。泛素化主要包括以下 3 步酶促反应过程：（1）在 ATP 作用下，E1 可在其 Cys 和泛素的 C-端的 Gly 之间形成巯酯键，即 E1-SHUb，从而激活泛素；（2）在 ATP 和 E2 酶作用下，泛素从 E1 转移到 E2 上，同样以巯酯键的方式结合（E2-SHUb）；（3）E3 酶可以特异性识别底物蛋白并与之结合，与此

7、同时 E2 将激活的泛素直接转移到某些 E3 结合的底物上，经过多个重复，多个泛素之间通过 Lys 相互连接，在底物上形成多泛素链。E1-样酶 Atg7 和 E2-样酶 Atg10 泛素样反应后，泛素样蛋白 Atg12 与 Atg5 Lys130 共价耦联，Atg16L1作为连接蛋白，增强 Atg12 和 E3 泛素连接酶样蛋白 Atg5间的互作，而后 Atg12-Atg5 与 Atg16L1 形成 E3 连接酶样复合体并定位于 PAS。半胱氨酸酶 Atg4 酶切 LC3 并暴露 C-端最后 5 个 Gly 残基，在 E2-样酶 Atg3 辅助下，与磷脂酰乙醇胺（phosphatidyleth

8、anolamine，PE）发生E3-样共轭形成脂化的 LC3（LC3-II）并定位于 PAS，吞噬泡加工成为成熟自噬体。2. mTOR 信号通路对细胞自噬的调控mTOR（ mammalian target of rapamycin） 属 于Ser/Thr 激酶，参与细胞发育、核糖体生成和代谢调控等生物学过程。mTOR 包括雷帕霉素敏感型 mTORC1和雷帕霉素非敏感型 mTORC2。mTORC1 通过磷酸化ULK1-Atg13-RB1CC1-C12orf44/Atg101 复合体使其失活，从而负调控细胞自噬体的形成，其活化程度可反映自噬水平，如果阻断 mTORC1 的功能，Ser/Thr 激酶

9、可磷酸化 Atg1 复合体并激活自噬。mTORC2 的磷酸化能激活 Akt（PKB）和 Atg1 抑制自噬，也可上调 HIF1A（hypoxia-inducible factor 1A）的表达。mTOR 调控细胞自噬主要包括 mTOR 非依赖性和 mTOR 依赖性两条信号通路。（1）mTOR 非依赖性信号通路有实验发现，Mst1（mammalian Ste20-like kinase 1）可使 Beclin1BH3 结构域 N-端的 Thr108 磷酸化，增强Beclin1 与 Bcl-2 和/或 Bcl-xL 疏水沟3 螺旋间的互作，使 Beclin1 同源二聚体稳定，减弱 Atg14L 与

10、 Beclin1 的结合，降低 Beclin1-PI3K-Atg14L 复合体脂激酶 Vps34的活性以抑制自噬。Molejon 等认为，VMP1（vacuolemembraneprotein 1）20 位氨基酸残基 C-端亲水性结构域（VMP1-AtgD）与 Beclin1 BH3 结构域结合致使 Bcl-2与 Beclin1 解离，最终形成 VMP1-Beclin1-hVps34-Atg14L复合体共同定位于 PAS，启动 PI3P 生成、泛素样级联反应和囊泡的形成。有趣的是，棉酚衍生物 ApoG2 与 Mst1作用相反，ApoG2 破坏 Beclin1 和 Bcl-2/xL 的互作，释放

11、出 Beclin1 BH3 结构域，从而诱导自噬，但氯喹可阻断自噬体与溶酶体的融合。而 EGFR（epidermal growthfactor receptor）通过磷酸化 Beclin1 多个位点的酪氨酸，增强 Beclin1 与抑制剂的结合能力，降低 Vps34 脂激酶活性以抑制自噬。（2）mTOR 依赖性信号通路Qased 等发现，Ser/Thr 蛋白激酶 ATM（ataxiatelangiectasia mutated）属 PIKK（PI3K-related proteinkinase）家族，ATM C-端序列与 PI3K 催化区同源，其能够刺激 LBK/AMPK/TSC2 通路的下游

12、信号，抑制mTORC1。mTORC1 被抑制后可激活 ULK1（unc-51like autophagy activatingkinase 1），ULK1 通过与 UVRAG结合再使 Beclin1Ser14 磷酸化，从而增强 Beclin1-Vps34-Atg14L 复合体的活性，启动自噬。此外，作为ULK 复合体的重要组成成分，FIP200 的缺失会造成MEF（mouse embryonicfibroblast）的 Atg14-Atg1-WIPI诱导缺陷。然而，Efeyan 等指出，Rag GTPases 活化后能够募集 mTORC1 进入到溶酶体表面导致自噬缺陷。除前述作用外，ApoG2

13、 亦可抑制线粒体电子传递以产生ROS（reactive oxygen species），ROS 通过提高 ERK（extracellular regulated protein kinases）、JNK（c-JunN-terminal kinases）（靶作用于 Bim 和 Atg5）的磷酸化水平，加快 HMGB1（high-mobility group box 1）从细胞核到细胞质的转运，以及抑制 mTOR 信号，启动细胞自噬。但 NAC（N-acetyl-cysteine）可减弱 HMGB1 从细胞核到细胞质的转运，诱导细胞凋亡和杀伤。同样，EGFR也可使 PI3K、Akt 和 mTOR

14、的酪氨酸磷酸化，负调控细胞自噬。（3）其他信号对细胞自噬的调控研究表明，在细胞核中，p53 可通过 sestrin1/2 蛋白激活 AMPKmTORC1 信号通路，从而抑制 mTORC1 以上调自噬水平；也可通过激活 DAPK1（death-associatedproteinkinase 1），磷酸化 Beclin1，促进细胞自噬；还能通过激活抗凋亡蛋白 Bcl-2 家族，解除 Bcl-2/xL 与Beclin1 之间的抑制作用而上调细胞自噬。而在细胞质中，p53 缺失的癌细胞的自噬水平上调，重新载入 p53后 可 下 调 细 胞 自 噬 水 平 。 还 有 研 究 表 明 ， 脂 多 糖（l

15、ipopolysaccharide ， LPS ） 可 通 过 TLR （ Toll likereceptor）调节细胞自噬的水平。在天然免疫研究中发现，LPS 能诱导小鼠单核巨噬细胞和人巨噬细胞自噬体形成，抑制 TLR4 后自噬体形成明显减少。LPS/TLR4 信号通路介导的自噬可加强 TLR4 信号通路中髓样分化蛋白（myeloid differentiation factor 88，MyD88）或 IFN 诱导接头蛋白Toll/interleukin （IL）-1receptor homologydomain （ TIR） -containing adaptorinducing inte

16、rferon（IFN）-，TRIF与自噬蛋白 Beclin1 的相互作用，抑制 Beclin1 和自噬信号通路中 Bcl-2 的结合，增强 NF-B核转录因子的活性。此外，PI3K-Akt-FoxO 信号通路可介导谷氨酰胺合成酶的活化，参与募集 Atg 蛋白，提高 LC3 和 ULK2 的共定位水平。ox-LDL（oxidized low-densitylipoprotein）极大地促进动脉粥样硬化的发生、发展，适当浓度（1040g/mL）的 ox-LDL 可激活保护性细胞自噬，致使内皮细胞、血管细胞和巨噬细胞的溶酶体降解ox-LDL。3. miRNA 对细胞自噬的调控microRNA（miR

17、NA）是一类长约 22 nt 的内源性非编码小 RNA 分子，在转录后水平调控基因的表达。研究表明，miRNA 参与细胞生长发育、炎症、肿瘤、衰老、凋亡等多种生理病理过程。近年来，还发现 miRNA 参与了细胞自噬调控，在自噬的发生和形成中发挥重要作用。miRNA 与其靶 mRNA 3-UTR 部分互补序列配对，通过降解 mRNA 和/或抑制蛋白翻译来调控基因表达，并且 miRNA 与其靶 mRNA 的序列同源性决定了是降解mRNA 还是抑制翻译。营养饥饿、缺氧、雷帕霉素等可诱导细胞自噬，但多数 miRNA 在自噬过程的不同阶段可通过作用于 Atg 蛋白以拮抗这种诱导作用，抑制细胞自噬，对细胞

18、造成伤害，且无细胞特异性。（1）囊泡（吞噬泡）成核阶段在正常生长条件下，抗凋亡蛋白家族 Bcl-2（包括Bcl-2、Bcl-xL、Mcl-1、A1、Bcl-W 和 Rubicon）与 Beclin1结合能力最强，Beclin1BH3 结构域与 Bcl-2 和/或 Bcl-xL的疏水沟互作，负调控 Beclin1-Vps34 PI3K-p150 核心复合体的形成和活性，形成 Beclin1 同源二聚体抑制自噬；当自噬被诱导时，Beclin1 与 Bcl-2 解离启动自噬。此外， Beclin1 CCD（coiled-coil domain）结构域也可与 Bcl-2和/或 Bcl-xL 的 BH4

19、 结构域互作，但 miR-376b、miR-216a、miR-30a、miR-30d 都可靶向 Beclin1，抑制其表达，减弱 Beclin1 与 Bcl-2 的结合和解离能力，从而调控自噬。Atg9 作为唯一的跨膜蛋白，定位于 PAS、线粒体和高尔基复合体，启动脂质从生物膜转运到 PAS，介导组装完整的囊泡膜，但 miR-34a 抑制 Atg9A 表达，中断囊泡成核。Atg14L 可以调节脂激酶 Vps34 活性，并可募集 ULK1 以使 Beclin1 磷酸化，但 miR-195 靶抑制Atg14，以抑制细胞自噬。PI3KC3 是 PI3K 复合体的核心蛋白，miR-338-5p 通过抑

20、制 PI3KC3 的表达，阻断囊泡成核，从而负调控细胞自噬。（2）自噬体的成熟阶段miR-216a、miR-181-a、miR-30a 和 miR-30d 靶作用于 Atg5，miR-375、miR-199a-5p 靶作用于 Atg7，miR-23b、miR-30d 靶作用于 Atg12，抑制泛素化蛋白表达，负调控囊泡膜延伸。除可脂化 LC3-I 外，Atg4 酶（Atg4B）同样可以介导自噬体膜表面的 LC3 蛋白发生去脂化作用，从而使细胞自噬循环利用 LC3 蛋白。研究发现，miR-376b 靶作用于 Atg4C、miR-101 靶作用于 Atg4D 以抑制细胞自噬。Suzuki 等认为，

21、LC3 侧链 lys49 参与调控 LC3 和 Atg13 C-端 LIR（LC3 interactingregion，氨基酸序列H441D442D443F444V445M446I447）间的互作。miR-204通过靶向抑制通过靶向抑制 LC3B 的表达，阻断 LC3B 的脂化，从而抑制自噬体的成熟。LC3-II 与自噬体形成有关，而未成熟的 LC3-I 是可溶的。因此，LC3-II 或 LC3-II/LC3-I 比值常用作自噬体形成的分子标记，用于自噬现象的观察和分析。（3）自噬溶酶体的融合阶段研究认为，Atg8 不仅参与膜延伸，且可经接头蛋白LIR 结构将错误折叠或聚合蛋白质、受损细胞器、

22、病原体募集到自噬体膜进行降解。酵母 Atg8 的哺乳动物同源蛋白有 7 种，即 LC3A、LC3B、LC3C、GABARAP、GABARAPL-1、GABARAPL-3、GABARAPL-2，因此LC3 亚型与 Atg13 LIR 亲和力的特异性也是影响自噬体形成的关键因素。但 miR-204 通过靶抑制 LC3B 表达，抑制自噬，从而降低自噬溶酶体的分解能力。此外，miR-22、miR-138、miR-302b、miR-210 分别靶作用于 HMGB1、Mst1、EGFR、VMP1，且 miR-22与 HMGB1、Mst1 与 miR-138、miR-302b 与 EGFR、miR-210与

23、 VMP1 均呈负相关，这些 miRNA 通过抑制蛋白表达，从而负调控前述细胞自噬信号通路。Ucar 等认为，IGF-1（insulinlike growth factor-1）可上调 miR- 212/132的表达，并且 miR-212/132 靶抑制 FoxO3 表达以致弱细胞自噬。miR-132 还可激活 PI3K-Akt-mTOR 信号通路，抑制细胞自噬。hsa-let-7g 可能通过下调 LOX-1、ROS的表达，以抑制细胞自噬。miR-101 还可靶作用于STMN1（在一定程度上拮抗 miR-101 的抑制作用）、RAB5A，miR-30d 靶作用于 Atg2，miR-130a 靶

24、作用于Atg2B、DICER1，miR-224（可被自噬降解）可能靶作用于 Smad4，这些均能够抑制细胞自噬。研究还发现，除多数 miRNA 对细胞自噬有抑制作用外，少数 miRNA 也可增强细胞自噬水平（表 2）。Wan等认为，miR-155、miR-7 可靶作用于 mTOR 信号多种分子，如 RHEB、RICTOR 和 RPS6KB2 等，负调控 PI3K-Akt-mTOR 信号通路，诱导细胞自噬。此外，miR-99a也可通过抑制 mTOR 信号、miR-18a 通过上调 ATM 的表达以增强细胞自噬水平。目前，细胞自噬与 miRNA 关系的研究还处于初级阶段，关于 miRNA 如何参与

25、调控自噬的研究有待进一步阐明。随着研究的深入，不同的 miRNA 在细胞自噬中的作用与机制将会更加清楚，对理解机体病理生理过程、抗感染以及天然免疫机制等方面具有重要意义。在自噬过程涉及的复杂的分子调节网络中，解析 miRNA与细胞自噬关系，有助于寻找新的自噬调控靶点，也为揭示自噬分子调控机制提供新的思路和策略。4. 细胞自噬调控的其他机制caspase属于半胱天冬氨酸蛋白酶（cysteinyl containing aspartate-specific protease），在正常细胞中，caspase 以无活 性 的 酶 原 形 式 存 在 。 MOMP （ mitochondrialoute

26、r membrane permeabilisation）是激活 caspase 的主要机制之一，细胞色素 C 进入到细胞质启动凋亡复合体的形成，激活 caspase-9，caspase-9 被裂解后激活 caspase-3 和caspase-7。细胞应激激活 caspase，活化的 caspase 能够启动细胞降解，调控细胞凋亡。研究发现，ATP 合成增加能够抑制细胞自噬，而凋亡蛋白 caspase Dcp-1 调控自噬潮（autophagicflux）的发生。pro-Dcp-1 在线粒体聚集，Dcp-1 与核苷酸转移酶 SesB 互作，降低 SesB 的稳定性并下调 ATP 的合成，从而启动

27、细胞自噬。Atg16L1 蛋白发生 Thr300Ala/Thr316Ala 突变，能够致使 caspase-3 对Atg16L1 的降解敏感性增强，进一步影响自噬体的形成。但此时，36 kDa 和 34 kDa 裂解产物的出现，并不是由于 caspase-3 活性增强所造成的。calpain 是一种钙依赖性的半胱氨酸蛋白酶，可在 Atg5 蛋白的氨基末端进行裂解，产生一个相对分子质量为 24000 的产物，从而驱使细胞自噬向细胞凋亡转变，将自噬与凋亡联系起来。除 Atg5 蛋白外，Beclin1、Bax 也是 calpain 的作用靶点，更说明自噬与凋亡有一定的关联性。AMPK（AMP-act

28、ivated protein kinase）是一种异源三聚体，包括催化亚基 1 个和调控型、亚基各 1个。多种应激因素可激活 AMPK，AMPK 活化后既可抑制自噬，又可激活自噬。细胞渗透性核苷酸类似物AICAR（AICA riboside）可以激活肝细胞 AMPK，AMPK磷酸化水平的提高能够抑制细胞自噬，致使神经元胞内泛素化蛋白的累积；而在酵母和多种哺乳动物细胞内， AMPK 的活化可以激活自噬。Yu 等认为，蛋白磷酸酶PP2A（protein phosphatase 2A）调控 AMPK 和亚基间的互作，使 AMPK 亚基去磷酸化，从而使 AMPK抑制 mTOR 磷酸化，启动细胞自噬。研究还认为，蛋白乙酰化是多种细胞进程的关键调控机制。Yi 等对酿酒酵母进行遗传学分析证实，自噬过程必需组蛋白乙酰转移酶 Esa1 的参与，且 Atg3 是 Esa1的作用底物。Atg3 的 K19 和 K 发生乙酰化，控制Atg3-Atg8 互作和 Atg8 的脂化，进而调控细胞自噬。去除脱乙酰酶 Rpd3 后，提高 K19-K48的乙酰化水平，可以增强细胞自噬。