海藻提取物Fucoidan抗肿瘤作用的实验研究.docx

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海藻提取物Fucoidan抗肿瘤作用的实验研究

海藻提取物Fucoidan抗肿瘤作用的实验研究

【摘要】目的研究海藻提取物Fucoidan抗肿瘤作用，并对其机制进行初探。

方法观察Fucoidan对小鼠S180移植性实体瘤、体外培养肿瘤细胞的作用，并了解其对动物免疫功能的影响。

结果Fucoidan能明显抑制小鼠S180实体瘤的生长，且呈现剂量相关性，其抑瘤率达到环磷酰胺阳性对照的%～％，对体外培养A549细胞、HeLa细胞和L1210细胞的生长均无显着抑制作用，Fucoidan中剂量组和大剂量组能显着提高碳粒廓清实验中的廓清指数K、吞噬指数α和脾脏器指数，但对胸腺脏器指数影响不大。

在DNFB诱导迟发性变态反应实验中，Fucoidan中剂量组和大剂量组亦可使小鼠耳肿胀度增大。

结论Fucoidan具有抗肿瘤作用，其机制可能是通过对免疫功能的增强来实现的。

【关键词】海藻提取物褐海藻多糖硫酸酯；抗肿瘤

　　Abstract：

ObjectiveToobservetheantitumoractionofFucoidanextractedfrombrownalgaUndariapinnatifida.MethodsThemodeofimplantedS180tumorwasestablishedin　inhibitoryeffectontumorwasobservedinmiceafterFucoidanwasgiven　inhibitoryeffectinA549,HeLaandL1210cellsbyFucoidanwiththemethodofMTTwasinvestigatedinvitro.TheimmunefunctionofFucoidantonormalmicewasdetectedthroughtheexperimentontheclearancerateofcharcoalparticlesanddelayedtypehypersensitivereaction（DTH）inducedby　showedsignificantinhibitiononthegrowthofS180tumorinadose-dependentmanner,butnosignificantanti-proliferativeeffectsonA549,HeLaandL1210cells.Theclearancerateofcharcoalparticles,spleenindexandearedemainducedbyDTHwereimprovedinhigh-doseandmiddle-dosegroups.ConclusionFucoidanhasantitumoraction,andthemechanismmayberelatedtostrengtheningtheimmunefunction.

　　Keywords：

FucoidanextractedfromBrownAlga;Antitumor

Fucoidan是一种从日本褐藻Undariapinnatifida中提取的天然多糖类成分，含有4-单邻磺酸-L-岩藻吡喃糖。

现有研究证明，从多种褐藻中提取的Fucoidan具有多种生物效应，如抗肿瘤、抗凝血、抗病毒等，已在日本作为功能食品、化妆品等广泛使用［1］。

其抗肿瘤作用尤引起人们的关注。

本实验以体内、体外方法，观察Fucoidan对小鼠S180移植性实体瘤、体外培养肿瘤细胞的作用，并了解其对动物免疫功能的影响，以对其抗肿瘤机理进行探讨，为其临床应用提供基础。

　　1材料1药品与试剂

　　Fucoidan由武汉和利有限公司提供，为黄褐色粉末，在水溶液中溶解度好。

环磷酰胺：

山西普德药业有限公司生产。

Ⅳ型胶原酶、噻唑蓝、放线菌素D、脂多糖：

购自Sigma公司；RPMI-1640培养基、新生牛血清：

GIBCO公司生产。

2动物及分组

　　昆明种小鼠，18～22g，雌雄各半。

体内抗肿瘤活性的检测实验将小鼠随机分为模型组，Fucoidan小、中、大剂量组及阳性对照组共5组，每组20只；对小鼠免疫功能的影响将小鼠随机分为对照组，Fucoidan小、中、大剂量组共4组，每组10只。

Fucoidan小、中、大剂量组分别按1，2，3mg/10g灌胃给药，对照及模型组和阳性对照组同法给予等量生理盐水和mg/10g环磷酰胺，1次/d。

3瘤株

　　A549细胞、HeLa细胞、L1210细胞：

由武汉大学典藏中心提供；荷瘤S180腹水型小鼠：

由华中科技大学同济医学院提供。

　　2方法

　　体内抗肿瘤活性的检测［2］

　　模型组和Fucoidan各组按剂量要求预防性灌胃给药7d。

第7天给药后1h，由荷瘤S180腹水型小鼠体内无菌抽取腹水，显微镜下计数，以无菌生理盐水调整肿瘤细胞数至×1010/L，混匀后，每鼠右腋皮下注射肿瘤细胞悬液ml。

各组如前给药，连续2周，最后1次给药24h，动物处死，并剖取各组动物皮下肿瘤，称重。

与模型组比较，计算抑瘤率。

　　体外抗肿瘤活性的检测［2］

　　采用MTT法。

10％RPMI1640生长培养基培养细胞，收集对数期细胞，用2％RPMI1640维持培养基调节细胞浓度，除空白调零孔外，每孔均匀接种约2×104个细胞／180μl到96孔板中。

空白调零孔仅加入10％RPMI1640180μl。

37℃、饱和蒸气、5％CO2培养箱培养过夜使其充分贴壁，37℃、饱和蒸气、5％CO2培养箱培养过夜使其充分贴壁，然后除空白调零孔及正常对照孔外，每孔分别加入终浓度为5×10-1，1×10-1，5×10-2，1×10-2，5×10-3，1×10-3，5×10-4，1×10-4mg/ml的Fucoidan20μl，每个浓度各设4个复孔，正常对照孔仅加入PBS20μl。

因Fucoidan有颜色，每个浓度组均设一不加细胞，只加20μl相应浓度培养液的对照孔。

Fucoidan继续培养48h后，弃去孔内液体，每孔加入5mg/mlMTT20μl,37℃、饱和蒸气、5％CO2培养箱放置4h。

每孔加入DMSO20μl,37℃、饱和蒸气、5％CO2培养箱放置30min后，平板离心机2000g×10min离心后，低速振荡15min,使结晶物充分溶解。

在酶联免疫检测仪570nm处测量各孔的光密度值。

给药各组所测OD570需减去对照孔OD570。

　　对正常小鼠免疫功能的影响

碳粒廓清法［3］：

各组按分组灌胃给药7d,1次/d。

最后一次给药后1h，每只小鼠尾静脉注射经稀释的印度墨汁ml/kg，注毕即刻计时。

在注射墨汁后3min和13min，分别以预先用肝素处理过的玻璃毛细管刺入小鼠眼内眦取血ml，将所取血液加入含％Na2CO32ml的试管中，摇动试管使均匀混合，在分光光度计上测定600nm波长处每个样品的光密度值,％Na2CO3液作空白对照。

称重肝脾末次取血后，立即颈椎脱臼处死小鼠，取出肝脾，去除脂肪和结缔组织，滤纸拭干后分别称重记录。

并计算清除速度K值、吞噬指数α和脾、胸腺脏器指数：

　　清除速度K值K=LgOD1-LgOD2t2-t1

吞噬指数α：

α=体重肝重-脾重×3K

脾、胸腺脏器指数＝器官重量/体重×10

2，4-二硝基氟苯诱导迟发性变态反应［2］：

各组按分组灌胃给药7d，1次/d。

第7日给药后，每鼠腹部剪毛，均匀涂抹1%DNFB50μl致敏，继续用药后第5天再用1%DNFB10μl攻击右耳，24h后处死动物，用打孔器取下直径8mm耳片，称重，以左右耳重量之差来表示DTH程度。

　　统计学处理

　　数据均以±s表示，两组间均数比较采用t检验。

　　3结果

　　Fucoidan对S180实体瘤的抑制作用

　　肉眼观察，模型组小鼠瘤块不断增大，边界不清，不易剥离，而Fucoidan小、中、大各剂量组瘤块与周围组织界限较清楚。

表1所示，Fucoidan能明显抑制小鼠S180实体瘤的生长，且呈现剂量相关性，其抑瘤率达到环磷酰胺阳性对照的%～％，提示具有有效的抗肿瘤生长作用。

表1海藻提取物对小鼠S180实体瘤重量的影响

　　Fucoidan对体外培养A549细胞、HeLa细胞和L1210细胞的影响

　　结果见表2。

Fucoidan对体外培养A549细胞、HeLa细胞和L1210细胞的A570均无显着影响。

提示其并无直接杀伤肿瘤细胞的能力。

表2Fucoidan对体外培养A549细胞、HeLa细胞和L1210细胞OD570的影响

　　Fucoidan对正常小鼠免疫功能的影响

　　结果见表3。

Fucoidan中剂量组和大剂量组能显着提高碳粒廓清实验中的廓清指数K、吞噬指数α和脾脏器指数，且呈现明显剂量相关性，但对胸腺脏器指数影响不大。

在DNFB诱导迟发性变态反应实验中，Fucoidan中剂量组和大剂量组亦可使小鼠耳肿胀度增大。

表3Fucoidan对正常小鼠免疫功能的影响

　　4讨论

大量药理及临床研究表明，海藻中的提取物具有有效的抗肿瘤作用［4］，特别是多糖成分，能提高机体的免疫功能，用于癌症的辅助治疗中，具有毒副作用小、安全性高、抑瘤效果好等优点［5］。

本实验结果显示，海藻提取物Fucoidan能抑制小鼠移植性S180实体瘤的生长，具有确切的体内抗肿瘤作用。

而就其机制而言，活性多糖一般是作为生物免疫反应调节剂，通过增强机体的免疫功能，尤其是非特异性免疫功能，而间接抑制或杀死肿瘤细胞的［6］。

碳粒廓清实验是反映非特异性免疫功能的经典实验，能表现单核巨噬细胞系统的吞噬能力，活化的单核巨噬细胞对肿瘤细胞可产生直接的杀伤和抑制作用，在机体对抗肿瘤的环节中起重要作用。

而DNFB诱导迟发性变态反应是机体细胞免疫功能的另一敏感指标，反映T淋巴细胞功能。

Fucoidan能显着提高碳粒廓清实验中的廓清指数K、吞噬指数α、脾脏器指数和DNFB诱导迟发性变态反应。

但Fucoidan对体外培养肿瘤细胞的生长并未显示确切的直接抑制作用，这种对细胞无毒的特点，明显不同于常用细胞毒类抗癌药。

提示Fucoidan可能是通过增强免疫功能而发挥抗肿瘤作用。

【参考文献】

　　［1］TakeshiTeruya,TerukoKonishi,ShuntokuUechi,etal.Anti-proliferativeactivityofoversulfatedfucoidanfromcommerciallyculturedCladosiphonokamuranusTOKIDAinU937cells［J］.InternationalJournalofBiologicalMacromolecules,2007,40（3）:

221.

　　［2］徐叔云，卞如濂，陈修.药理实验方法学，第3版［M］.北京：

人民卫生出版社，2002：

1785，1420.

　　［3］陈奇.中药药理实验方法学，第1版［M］.北京：

人民卫生出版社，1993：

317.

　　［4］杨文豪，吕俊华，徐石海.海藻提取物A1和A2抑制肝癌和肺腺癌细胞增殖作用的实验研究［J］.辽宁中医杂志，2005，32：

371.

　　［5］刘海洲，刘均红.海藻多糖的生物活性及医药应用研究新进展［J］.化工科技市场，2005，8：

29.

　　［6］李玉芳，王杰.中药多糖抗肿瘤机制研究进展［J］.实用癌症杂志，2007，22：

546.