定量PCRTaqman探针设计要领.docx
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定量PCRTaqman探针设计要领
实时荧光定量PCR实验体系的设计与优化
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2007-08-22
时荧光定量PCR以其精确、快速、方便，越来越多的应用在科研、临床及检验检疫的各个领域。
但是定量PCR是对精确性要求很高的实验，不仅要求在实验前有比较完整的实验设计方案，而且实验的条件对实验结果的影响也非常大。
这些都是很多老师与学生非常关心的问题，下面分别从这两个方面来对定量PCR实验做一些阐述。
定量PCR实验步骤（以m为例）：
1.设计实验方案：
例如对样品、实验组和对照组的一个实验流程设计2.引物和探针的设计和合成3.抽提，测定提取的的浓度4.反转录PCR5.定量PCR6.数据分析在进行定量PCR实验的过程中，PCR的扩增效率是一个非常重要的影响因素，因为定量PCR原理的理论方程是基于扩增效率最大值1，因此高的扩增效率能保证定量PCR实验的精确性及重复性，影响PCR扩增效率主要有以下几个方面：
1，扩增子的长度；2，扩增子的GC含量；3，扩增子、引物和探针的二级结构；4，PCR反应各组分的浓度；5，或者c的纯度。
进行定量PCR实验时，必须设计好引物和探针，除了能获得高的扩增效率外，对PCR扩增的特异性、消除的扩增及提高扩增的灵敏度都有很大的影响。
下图就是使用不同的引物和探针对18S进行定量PCR的荧光曲线图（反应条件和模板都相同）。
引物设计原则：
1.上下游引物要保守为了能够扩增出所需要的保守片段，必须对保守的100-200片段进行PCR扩增。
所以引物的选取也要非常的保守。
2.上下游引物的长度一般为18-30bp之间，且Tm值在58-62℃之间，上下游引物的Tm值相差最好不超过2℃。
3.确保引物中GC含量在30-80%。
应避免引物中多个重复的碱基出现，尤其是要避免4个或超过4个的G碱基出现。
引物的3’端最好不为G或/和C。
引物3’端的5个碱基不应出现2个G或/和C。
4.避免引物内出现反向重复序列形成发夹二级结构，同时也应避免引物间配对形成引物二聚体。
5．跨外显子设计引物，用于区别或消除的扩增。
探针设计的基本原则：
1.保守：
探针要绝对的保守，有时分型就仅仅依靠探针来决定。
理论上有一个碱基不配对，就可能检测不出来。
2.Taqman探针的长度最好在25-32bp之间，且Tm值在68-72℃之间，确保探针的Tm值要比引物的Tm值高出5-10℃，这样可保证探针在退火时先于引物与目的片段结合。
3.确保探针中GC含量在30-80%。
4.避免探针中多个重复的碱基出现，尤其是要避免4个或超过4个的G碱基5.探针的5’端不能为G，因为即使单个G碱基与FAM荧光报告基团相连时，也可以淬灭FAM基团所发出的荧光信号，从而导致假阴性的出现。
6.Taqman探针应靠近上游引物，即Taqman探针应靠近与其在同一条链上的上游引物。
两者的距离最好是探针的5’端离上游引物的3’有一个碱基。
7.避免探针与引物之间形成二级结构。
8.对于多重定量PCR，例如SNP分型检测时，SNP位点应设计在探针的中间位置，并且两种探针的Tm值应相近。
实时定量PCR体系的优化1.基本参数的优化：
1）MgCl2的浓度：
在PCR反应中，MgCl2的浓度对酶的活性是至关重要的，不仅如此，合适的MgCl2的浓度还能在反应中得到较低的Cp（crossingpoint）值（指PCR达到指数扩增期时，产生一定的荧光高于背景并为仪器所识别时的循环数），较高的荧光信号强度以及良好的曲线峰值。
所以对其的浓度选择应慎重。
一般来说，对以或c为模板的PCR反应，应选择2－5mM浓度的MgCl2，对以m为模板的RT－PCR而言，则应选择的浓度为4－8mM。
2）模板的浓度：
如果研究者是进行首次实验，那么应选择一系列稀释浓度的模板来进行实验，以选择出最为合适的模板浓度，如果条件困难，也至少要选择两个稀释度（高和中、低浓度）来进行实验。
一般而言，使Cp位于15－30个循环比较合适，若大于30则应使用较高的模板浓度，如果Cp小于15则应选择较低的模板深度。
对于Cp值的确定，经验上是SYBRGreenI探针的荧光信号比本底高2倍，杂交探针的荧光强度比本底高倍。
2.使用SYBRGreenI测定时的条件优化：
1）MgCl2的浓度：
大多数引物－模板对其的要求是2－4mM。
2）模板的浓度：
初次实验要求做一系列的稀释浓度，如条件限制，至少完成两个稀释的度的测定。
在50ng-5pg之间选择，质粒在106拷贝数左右。
3）引物的浓度：
引物的浓度是一个影响PCR反应的关键因素，若浓度太低，会致使反应不完全，若引物太多，则发生错配以及产生非特异的产物的可能性会大大增加。
对于大多数PCR反应，是个合适的浓度，若初次选用这个浓度不理想，可在－之间进行选择，直至达到满意的结果。
4）退火温度：
首次实验设置的退火温度应比计算得出的Tm值小5℃，然后在1－2℃内进行选择。
一般的，退火温度要根据经验来确定，这个经验值往往会同计算得到的Tm值有一定的差距。
3.用SYBRGreenI进行一步法RT－PCR的条件优化：
1）MgCl2的浓度：
不同的靶分子选用不同的浓度，通常是在4－8mM之间选择。
2）模板的浓度：
RT－PCR实验既可以选用总，又可以选用m，其浓度应在1pg-1ug之间选择。
对于低模板浓度，可以增加适量的MS2或用alternative作为载体进行测定。
3）对照设置：
每一引物都应设有阴性对照，阳性对照和污染对照。
4.杂交探针测定1）MgCl2的浓度：
在2－4mM的基础上加－，但是不要超过。
2）杂交探针的浓度：
初次实验每个探针用，如果信号强度达不到要求，可以增加至。
3）对照设置：
每一引物都要设阴性对照，每一探针都要设阴性对照。
每次实验都要设阳性对照。
4）其它的条件同SYBRGreenI。
5.用杂交探针进行实时定量RT－PCR：
1）MgCl2的浓度：
在4－8mM之间进行选择。
2）杂交探针的浓度：
初实验用，如果荧光信号强度不足，可以增加至。
3）模板浓度设置：
优化的扩增须进行一系列稀释度的实验，在条件有困难的情况下，至少要进行两个稀释度的测定。
选用1pg-1ug的总或是m，若是模板的浓度过小（小于10ng/ul），则可加入MS2或alternative作为载体。
4）对照设置：
每个引物都要设无模板对照，阳性对照以及污染对照。
6.关于杂交探针的评价：
在使用杂交探针进行实验时，必须注意防止探针－引物二聚体的形成和其本身在反应过程中的延伸。
引物－探针二聚体的形成，主要是因为探针可与引物的3’末端杂交，其形成以后，会致使此二聚体扩增，从而同目的基因竞争反应的原料，导致反应的效率下降。
探针其本身能同目的基因相结合，且其解链温度高于引物，所以它可能作为引物而引发延伸反应，为了防止发生这种现象，通常是将其3’末端完全磷酸化，使之不能延伸，若此磷酸化不完全或是没有磷酸化，就会产生目的基因的副产品，从而干扰实验结果。
鉴于以上这两点，所以应对探针精心设计，并将其末端完全磷酸化。
（
定量PCRTaqman探针设计要领
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2007-08-22
自90年代Taqman探针诞生以来，虽然荧光探针（引物）不断有新的技术出现，但是作为一种经典的定量PCR技术，Taqman探针技术仍然是许多实验研究人员进行定量检测的首选，这主要是因为相对于SYBR荧光染料，Taqman探针具有序列特异性，只结合到互补区，而且荧光信号与扩增的拷贝数具有一一对应的关系，因此特异性强灵敏度高，而且条件优化容易；而相对于杂交探针，Taqman探针只要设计一条探针，因此探针设计较便宜方便，而且也能完成基本的定量PCR要求。
当然Taqman定量方法由于还是要合成探针，也给实验操作带来了挑战。
一般Taqman定量PCR实验过程为：
目的基因查找比对→探针与引物设计→探针与引物合成→配置反应体系→反应参数→重复实验，优化条件→获得曲线数据，比对标准曲线→再重复验证。
第一步：
在第一步目的基因查找比对过程中可以利用NCBIgenbank序列以及star等软件完成目的或者的查找与比对——这在分析报告的时候相信很多人操作过，这一步需要注意的就是要保证所分析的序列在一个contig（重叠群，即染色体的一些区域中毗邻片段重叠的情况）内。
第二步：
如果其它条件一致，那么这个第二步——引物探针的设计就可以说是定量PCR成败的关键了，通过各方面经验的总结有以下几个基本的原则：
总体原则
*先选择好探针，然后设计引物使其尽可能的靠近探针。
*所选序列应该高度特异，尽量选择具有最小二级结构的扩增片段——这是因为二级结构会影响反应效率，而且还会阻碍酶的扩增。
建议先进行二级结构检测，如果不能避免二级结构，那么就要相应提高退火温度。
*扩增长度应不超过400bp，理想的最好能在100-150bp内，扩增片段越短，有效的扩增反应就越容易获得。
较短的扩增片段也容易保证分析的一致性。
*保持GC含量在20％和80％之间，GC富含区容易产生非特异反应，从而会导致扩增效率的降低，以及出现在荧光染料分析中非特异信号。
*为了保证效率和重复性，应避免重复的核苷酸序列，尤其是G（不能有4个连续的G）*将引物和探针互相进行配对检测，以避免二聚体和发卡结构的形成。
引物设计原则
*序列选取应在基因的保守区段*避免引物自身或与引物之间形成4个或4个以上连续配对，避免引物自身形成环状发卡结构*典型的引物18到24个核苷长。
引物需要足够长，保证序列独特性，并降低序列存在于非目的序列位点的可能性。
但是长度大于24核苷的引物并不意味着更高的特异性。
较长的序列可能会与错误配对序列杂交，降低了特异性，而且比短序列杂交慢，从而降低了产量。
*Tm值在55－65℃（因为60℃核酸外切酶活性最高），GC含量在40%－60%*引物之间的TM相差避免超过2℃*引物的3’端避免使用碱基A，引物的3’端避免出现3个或3个以上连续相同的碱基*为避免的扩增，引物设计最好能跨两个外显子。
*Taqman探针技术要求片段长度在50bp－150bp*引物末端（最后5个核苷酸）不能有超过2个的G和C。
探针设计原则
*探针位置尽可能地靠近上游引物*探针长度应在15-45bp（最好是20-30bp），以保证结合特异性*检测探针的折叠和二级结构*Tm值在65-70℃，通常比引物TM值高5-10℃（至少要5℃），GC含量在40%－70%*探针的5’端应避免使用G鸟嘌呤——因为5'G会有淬灭作用，而且即使是被切割下来还会存在淬灭作用。
*整条探针中，碱基C的含量要明显高于G的含量——G含量高会降低反应效率，这时就应选择配对的另一条链作为探针。
*为确保引物探针的特异性，最好将设计好的序列在blast中核实一次，如果发现有非特异性互补区，建议重新设计引物探针。
TaqmanMGB探针设计
*探针的5’端避免出现G，即使探针水解为单个碱基，与报告基团相相连的G碱基仍可淬灭基团的荧光信号。
*Tm值应为65-67℃。
*尽量缩短TaqmanMGB探针，但探针长度不少于13bp。
*尽量避免出现重复的碱基，尤其是G碱基，应避免出现4个或4个以上的G重复出现。
*原则上MGB探针只要有一个碱基突变，MGB探针就会检测到（MGB探针将不会与目的片段杂交，不产生荧光信号）。
因此，在进行SNP检测时，为了检测到突变子，即TaqmanMGB不与目的片段杂交，不产生荧光信号，探针目的片段产生荧光信号检测将探针的突变位点尽量放在中间1/3的地方。
注意：
为了满足上述要求的4个条件，探针的突变位点可向3’端移动，但突变位点至少在离3’端2个碱基的前方（即必须确保探针的后两个碱基是绝对的保守），以进行SNP检测。
反过来，若要进行同类检测，找的是保守片段区，探针中不应有突变位点。
若探针即便是只有13个bp，探针仍不完全保守。
有几个突变，突变位点也应靠近探针的5’端，这样，即便是突变，探针也可与目的片段杂交，产生荧光信号。
另一种方法是设计简并探针，也可达到即使是突变，仍可检测到突变。
第三步：
寻找一家信赖的公司合成引物和探针，一般引物合成大家比较熟悉，而且价格也比较便宜（特别是这两年便宜了许多），而探针则相对来说贵了许多，一般Taqman探针合成在1000到5000元不等（不同的合成要求价钱不同）——而这只是标记价钱，序列合成基本上和引物合成价钱相似。
第四、五、六步：
一般的定量PCR反应体系与普通PCR其实也差不了多少，只是要加入Taqman探针，另外不同就是分步法的不同。
其中需要注意的是：
*扩增酶最好选用热启动酶*引物和探针的浓度需要进行优化，有人建议从50nM开始，在50nM—900nM之间优化，一般为200nM（注意探针需要避光保存。
*同样Mg和酶量也需要进行优化，酶的推荐反应浓度是（50ul）*模板的添加量通常在100ng以下，因不同种类的模板中含有的靶基因的拷贝数不同，必要时可进行梯度稀释，确定最佳的模板添加量。
如果欲进行2Step反应的第二步PCR扩增反应，第一步的RT反应液作为模板时的添加量不要超过PCR反应液总体积的10%。
另外循环参数虽然在引物和探针设计完之后也就确定了，但是有时也需要进行优化。
第七步：
在进行数据分析的时候，通常用不同浓度的标准样品的Ct值来产生标准曲线，然后计算相对方程式。
方程式的斜度可以用来检查PCR的效率，对于100%PCR效率来说，一个理想的斜率是。
最佳的标准曲线是建立在PCR的扩增效率为90%-100%（100%意味着在每个循环之后，模板的总数将增加为前一次的2倍）的基础上。
所有标准曲线的线性回归分析需要存在一个高相关系数（R2≥，这样才能认为实验的过程和数据是可信的。
使用这个方程式我们可以计算出未知样本的初始模板量。
大多数定量PCR仪都有这样一个软件，它可以从标准曲线中自动地计算出未知样本的初始模板量。
这其中有两种基本的方法：
绝对定量和相对定量，研究人员需要根据自己的实验目的来选择。
绝对定量是指将未知样品与标准曲线相比较进行分析，一般标准品就是一个已知绝对浓度的样品，要注意得是绝对定量分析的准确性是相对标准品的准确性而言的。
相对定量是指两个或更多的基因互相进行比较，其结果是一个比率，没有确切的数字被检测道。
另外由于不同的样品在反应过程中存在着一定的差异，因此除了要制作标准曲线来进行定量外，还需要设计表达水平相对较为稳定的内参基因来对结果进行标准化。
β-actin和三磷酸甘油醛脱氢酶（Glyceraldehyde-3-phosphatedehydrogenase，GAPDH）是两种较常用的管家基因，另外还有cyclophilin，18sr，phosphoglyserokinase，beta-microglobulin，beta-glucronidase，hypoxanthineribosyltransferase，transferringreceptor等。
要注意这些基因可以被反应条件所影响，在设计定量表达研究时，保证初始对照基因的质量是必要的一步，而且严谨的研究人员会通过对一系列内参基因定量结果取几何平均数来对定量数据进行标准化。
还有一个问题就是如何判断所得到数据的好坏，关于扩增曲线，经验总结认为：
“1.总体看曲线拐点清楚，指数期明显，扩增曲线整体平行性极好，基线平无上扬现象，低浓度样本扩增曲线指数期明显。
2.曲线指数期斜率，反应了扩增效率，越大说明扩增效率越高。
扩增效率越高，试剂灵敏度表现会越好。
3.基线，图上的基线也就是阴性样本的扩增曲线，平直或略微下降是好试剂的表现，阴阳性清楚，不易误判。
如果有上扬趋势，有可能造成阴性标本误判。
4.曲线与曲线间平行性非常好，说明各反应管扩增效率相近，外标准定量建立在每管扩增效率一样的假定基础上，所以扩增效率越相近，定量的重复性和准确性就越好。
而扩增效率相近与否，反应在扩增曲线图上就是曲线的平行性。
5.低浓度曲线指数期明显，一方面不易出现假阴阳性误判，另一方面说明灵敏度高。
”
∙实时荧光定量PCR技术：
定量分析功能及软件应用
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2007-8-22
定量PCR除能够对样品的初始浓度进行准确信量外，还有其它多种丰硕的应用。
还包括基因表达调控情形的分析、等位基因的分析等，那么这些功能是如安在一台定量PCR仪上实现的呢？
下面将进行一一介绍。
利用标准曲线对样品的初始浓度进行定量：
用已知浓度的标准品绘制标准曲线来对未知样品定量，第一要有一组稳固的标准品。
标准品能够是含有目的基因的线性化的质粒，也能够是比扩增片段长的纯化后的PCR产物，固然也能够是，乃至c，但前提是所有的作为标准品的核酸都必需保证稳固。
一样一条标准曲线取四到五个点，浓度范围要能覆盖样品的浓度区间，以保证定量的准确性。
一样一个点重复三至五次，关于常期稳固利用的标准品能够适当减少重复的次数。
以Rotor-Gene3000的操作为例，以标准曲线对未知样品定量是默认的分析方法。
软件可在反应尚在进行时就对结果进行分析，结果随着反应的进行可实时更新，当然也可以等反应完全结束后再进行分析。
点示“Analysis”，弹出分析框，默许分析功能即为“Quantitation”，点击“Show”，软件即自动给出包括标准曲线（包括R值，R平方值，扩增效率、标准曲线公式等）、标准化的荧光曲线、各样品计算浓度（包括标准误差、变异系数等）在内的结果。
若是使用SYBRGreenI法，还可进行熔解曲线分析，以判断退火温度是否合适，产物中是否有引物二聚体的影响。
对于SYBRGreenI的客户，我们建议一定要在最后做一步熔解曲线的分析，这对于反应条件的优化和结果的正确判定都有着非常重要的作用。
同样，点击“Analysis”，在分析窗口中选择“Melt”，点击“Show”，自动给出分析结果。
完成了所需的分析以后，如还需给出分析结果报告，点击“Analysis”边上的“Report”选项，选择报告模板，软件自动给出报告。
利用定量技术进行基因型分析研究：
常用的分析方法有两种，一种是Taqman探针法，一种为FRET探针法（又称Hyb探针），运用以上两种方法进行基因型的分析需要一台有多通道的荧光定量PCR仪。
Taqman探针分析基因型是以扩增信号的有无来判定，而FRET探针则根据扩增后片段熔解温度的不同来判定。
以下为用Taqman探针判断基因型的实例：
这里，突变型的探针以FAM荧光素标记，野生型的探针以VIC荧光素标记，检测时分别同时检测了FAM通道和VIC通道的荧光情况。
这里，3、4号样品只在FAM通道有信号，而在VIC通道里无信号，表明这两个样品为突变型；1、2号样品在FAM通道无信号，在VIC通道有信号，表明这两个样品为野生型；而5、6号样品在两个通道都有信号，但荧光强度恰为其它样品的一半，说明这两个样品为杂合型。
并且，我们可以在软件里将不同的通道定义为不同的基因型，软件会根据不同样品在各个通道的荧光情况，自动对各个样品的基因型做出判定。
以下为用FRET方式分析基因型的实例：
如上图，荧光探针与突变型完全匹配，而与野生型存在一个碱基的错配，因此打开这两组双链所需的能量就不同，具体体此刻熔解温度的不同上，因此突变型的样本有较高的熔解温度，而野生型的样品熔解温度相对较低。
在图中，5号样本熔解温度较低，为野生型；2号样本熔解温度较高，为突变型；而一、3、4号样品在高温和低温处都显现了熔解峰，那么它们为杂合型。
而且用户还能够将不同的峰概念为不同的基因型，软件可依照用户的概念自动给出未知样品的基因型。
如上图表格中所示。
利用相对定量的方式分析目的基因的上下调情形：
基因表达调控研究中，常用的相对定量方法主要有两种，Delta-deltaCt法和双标准曲线法。
由于纯化后得率不同、反转录为c的效率不同等客观因素，用于定量分析的初始样品浓度不同，因此，在进行基因表达调控研究中都会用一些看家基因来标准化，以校正因样品初始浓度不同而造成的差异。
常用的看家基因有beta-actin，GAPDH，18Sr等。
因此，在做基因表达调控分析时至少要做两个基因，目的基因和一个看家基因。
我们分别来看看以上两种相对定量分析方法的特点和应用。
Delta-deltaCt：
公式：
由Delta-deltaCt的公式能够看出，该方式直接利用看家基因来校正样品初始量，但同时默许两个基因扩增效率一致。
ComparativeDelta-deltaCt法的特点、注意事项及实际应用：
1.ComparativeDelta-deltaCt法的一大特点是，当优化的体系已经建立后，在每次实验中无需再对看家基因和目的基因做标准曲线，而只需对待测样品分别进行PCR扩增即可。
2.每次实验都默认目的基因和看家基因的扩增效率一致，而并非真实扩增情况的反映，因此实验条件需要严格优化，并且总会存一定的偏差。
用ComparativeDelta-deltaCt法展开定量实验前，在预实验中，必需对目的基因和看家基因做两组标准曲线。
Rotor-Gene的软件会自动给出两组标准曲线的R值、扩增效率等信息，如果两组标准曲线的斜率，即M值的差小于，表明两个基因的扩增效率已非常接近，那么后续实验中就可以用ComparativeDelta-deltaCt法进行相对定量分析。
反之，如果M差值大于，就无法用该方法进行相对定量分析。
此时的解决方法有两种，一是优化实验，使两组标准曲线的斜率差值小于，二是换用其它的相对定量方法。
下面是某科研用户用Delta-deltaCt进行相对定量分析的实例：
首先，该客户分别做了目的基因和看家基因的确标准曲线，根据软件自动给出的M值判断该方法的可行性：
如下图，将标准品进行梯度稀释后，分别对目的基因（GeneofInterest）和看家基因（HousekeeperGene）做标准曲线。
软件自动绘制标准曲线，并给出相应的参数。
从上图可知，两组标准曲线的M值分别为和，两者的差值<，因此，这组看家基因和目的基因可以用ComparativeDelta-deltaCt法进行相对定量。
确信这两个基因能够用Delta-deltaCt法分析后，用户扩增了其待测样品的目的基因和看家基因。
经软件自动分析后，给出分析结果，如下：
咱们看到，在该客户的实验中，以样品A为对照组，软件自动组出了样品B和C的目的基因相关于样品A的表达情形。
这种方式关于样品量大，但研究的基因数量相对较少的客户专门有效，因为一旦条件优化好以后就无需再做标准曲线，节约了试剂和样品量，实验操作也相对简单。
双标准曲线法：
公式：
双标准曲线法考虑到了不同基因扩增效率的不同，用标准曲线来校正扩增效率。
双标准曲线法的特点、注意事项及实际应用：
1.双标准曲线法做相对定量分析的最大特点是，应用简便，无需像Delta-deltaCT法那样对实验进行严格的优化。
2.其不足之处是每次实验都必需对目的基因和看家基因做两组标准曲线。
并且，如果用于做标准曲线的标准品不同于样品，比如标准品为质粒或纯化的PCR产物，而待测样品为c，那么标准曲线的扩增效率并不能真实地反映样品的扩增情况，因此以标准曲线来计算样品的实际浓度就存在一定误差。
每种相对定量方法都会有一定的局限性，对于双标准曲线法，比较适合于样本量不大，但研究的基因较多的客户，这样对不同基因条件优化相对Delta-deltaCt法更为简单。
下面是某科研用户用双标准曲线法进行相对定量分析的实例。
要用该方法进行分析，客户在一
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