同种电荷相互排斥，阻止蛋白质颗粒相互聚集而发生沉淀。
沉淀蛋白质的方法，常用的有：
（1）盐析法，在蛋白质溶液加入大量的硫酸铵、硫酸钠或氯化钠等中性盐，去除蛋白质的水化膜，中和蛋白质表面的电荷，使蛋白质颗粒相互聚集，发生沉淀。
用不同浓度的盐可以沉淀不同的蛋白质，称分段盐析。
盐析是对蛋白质进行粗分离的常用方法。
（2）有机溶剂沉淀法：
使用丙酮沉淀时，必须在0～4℃低温下进行，丙酮用量一般10倍于蛋白质溶液的体积，蛋白质被丙酮沉淀时，应立即分离，否则蛋白质会变性。
除了丙酮以外，也可用乙醇沉淀。
此外，还可用加重金属盐，加某些有机酸，加热等方法将样品中的蛋白质变性沉淀。
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[答]
（1）除共价键外，维持蛋白质结构的主要非共价键有：
范德华力（范德华相互作用）、疏水作用、盐键、氢键。
（2）DNA是由4种元件构成的大分子，蛋白质是由20多种元件构成的大分子，显然，蛋白质的分子结构更具复杂性，DNA的双螺旋结构有一定的刚性，其空间结构相对简单，蛋白质作为单链分子，可以形成各种复杂的空间结构，由于结构的复杂性，蛋白质的功能广泛而复杂，且结构和功能受到复杂的调控，DNA的功能则相对简单。
综合而论，蛋白的研究更具复杂性和挑战性。
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[答]
（1）能提高蛋白质的稳定性。
亚基结合可以减少蛋白质的表面积/体积比，使蛋白质的稳定性增高。
（2）提高遗传物质的经济性和有效性。
编码一个能装配成同聚体的单位所需的基因长度比编码一个与同聚体相同相对分子质量的超长肽链所需的基因长度要小得多（如烟草花叶病毒的外壳有2130多个亚基）。
（3）形成功能部位。
不少寡聚蛋白的单体相互聚集可以形成新的功能部位。
（4）形成协同效应。
寡聚蛋白与配体相互作用时，有可能形成类似血红蛋白或别构酶那样的协同效应，使其功能更加完善。
有些寡聚蛋白的不同亚基可以执行不同的功能，如一些酶的亚基可分为催化亚基和调节亚基。
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[答]
（1）由于2，3-BPG是同脱氧HbA中心空隙带正电荷的侧链结合，而脱氧HbF缺少带正电荷的侧链（链143位的His残基），因此2，3-BPG是同脱氧HbA的结合比同脱氧HbF的结合更紧。
（2）2，3-BPG稳定血红蛋白的脱氧形式，降低血红蛋白的氧饱和度。
由于HbF同2，3-BPG亲和力比HbA低，HbF受血液中2，3-BPG影响小，因此HbF在任何氧分压下对氧的亲和力都比HbA大，（3）亲和力的这种差别允许氧从母亲血向胎儿有效转移。
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[答]蛋白质变性后，氢键等次级键被破坏，蛋白质分子就从原来有秩序卷曲的紧密结构变为无秩序的松散伸展状结构。
即二、三级以上的高级结构发发生改变或破坏，但一级结构没有破坏。
变性后，蛋白质的溶解度降低，是由于高级结构受到破坏，使分子表面结构发生变化，亲水基团相对减少，容易引起分子间相互碰撞发生聚集沉淀，蛋白质的生物学功能丧失，由于一些化学键的外露，使蛋白质的分解更加容易。
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[答]
（1）在低pH值时，羧基质子化，蛋白质分子带有大量的净正电荷，分子内正电荷相斥使许多蛋白质变性，蛋白质分子内部疏水基团因此而向外暴露，使蛋白质溶解度降低，因而产生沉淀。
（2）加入少量盐时，对稳定带电基团有利，增加了蛋白质的溶解度。
但是随着盐离子浓度的增加，盐离子夺取了与蛋白质结合的水分子，降低了蛋白质的水合程度。
使蛋白质水化层破坏，从而使蛋白质沉淀。
（3）在等电点时，蛋白质分子之间的静电斥力最小，所以其溶解度最小。
（4）加热会使蛋白质变性，蛋白质内部的疏水基团被暴露，溶解度降低，从而引起蛋白质沉淀。
（5）非极性溶剂减小了表面极性基团的溶剂化作用，使蛋白质分子与水之间的氢键减少，促使蛋白质分子之间形成氢键，蛋白质的溶解度因此而降低。
（6）介电常数的下降对暴露在溶剂中的非极性基团有稳定作用，促使蛋白质肽链的展开而导致变性。
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[答]凝胶过滤时，凝胶颗粒排阻Mr较大的蛋白质，仅允许Mr较小的蛋白质进入颗粒内部，所以Mr较大的蛋白质只能在凝胶颗粒之间的空隙中通过，可以用较小体积的洗脱液从层析柱中洗脱出来。
而Mr小的蛋白质必须用较大体积的洗脱液才能从层析柱中洗脱出来。
SDS-PAGE分离蛋白质时，所有的蛋白质均要从凝胶的网孔中穿过，蛋白质的相对分子质量越小，受到的阻力也越小，移动速度就越快。
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[答]DEAE-纤维素柱层析的结果说明，在pH6的条件下，A带有较多的负电荷，B次之，C带负电荷最少。
凝胶过滤法测出A的Mr是C的4倍，B的Mr是C的2倍，但SDS-PAGE只发现一条带。
由于SDS-PAGE测定的亚基的Mr，凝胶过滤法可以测定寡聚体的Mr，可以推断C是单体，B是以C为亚基的二聚体，A是以C为亚基的4聚体，由于C在pH6时带负电荷，随着亚基数的增加，带负电荷的量也会增加，这与DEAE-纤维素层析的结果也是一致的。
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[答]
（1）共性：
用量少而催化效率高；仅改变化学反应的速度，不改变化学反应的平衡点，酶本身在化学反应前后也不改变；可降低化学反应的活化能。
（2）特性：
酶作为生物催化剂的特点是催化效率更高，具有高度的专一性，容易失活，活力受条件的调节控制，全酶的活力与辅助因子有关。
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[答]
（1）v-[S]图是直角双曲线，可以通过其渐近线求Vmax，v=1/2Vmax时对应的[S]为Km；优点是比较直观，缺点是实际上测定时不容易达到Vmax，所以测不准。
（2）1/v-1/[S]图是一条直线，它与纵轴的截距为1/Vmax，与横轴的截距为-1/Km，优点是使用方便，Vmax和Km都较容易求，缺点是实验得到的点一般集中在直线的左端，作图时测定值稍有偏差，直线斜率就会有较大的偏差，Km就测不准。
（3）v-v/[S]图也是一条直线，它与纵轴的截距为Vmax，与横轴的截距为Vmax/Km，斜率为-Km，优点是求Km比较方便，缺点是作图前计算较繁。
（4）[S]/v-[S]图也是一条直线，它与纵轴的截距为Km/Vmax，与横轴的截距为-Km，优缺点与v-v/[S]图相似。
（5）直接线性作图法是一组交于一点的直线，交点的横坐标为Km，纵坐标为Vmax，是求Vmax和Km的最好的一种方法，不需计算，作图方便，缺点是实验测定值往往不会全部相交于一点，会给数据取舍造成一定的困难。
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[答]据v-[S]的米氏曲线，当底物浓度远远低于Km值时，酶不能被底物饱和，从酶的利用角度而言，很不经济；当底物浓度远远高于Km值时，酶趋于被饱和，随底物浓度改变，反应速度变化不大，不利于反应速度的调节；当底物浓度在Km值附近时，反应速度对底物浓度的变化较为敏感，有利于反应速度的调节。
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[答]酶蛋白分子中组氨酸的侧链咪唑基pK值为6.0~7.0，在生理条件下，一部分解离，可以作为质子供体，一部分不解离，可以作为质子受体，既是酸，又是碱，可以作为广义酸碱共同催化反应，因此常参与构成酶的活性中心。
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[答]竞争性抑制是指抑制剂I和底物S对游离酶E的结合有竞争作用，互相排斥，已结合底物的ES复合体，不能再结合I；同样已结合抑制剂的EI复合体，不能再结合S。
多数竞争性抑制在化学结构上与底物S相似，能与底物S竞争与酶分子活性中心的结合，因此，抑制作用大小取决于抑制剂与底物的浓度比，加大底物浓度，可使抑制作用减弱甚至消除。
竞争性抑制作用的双倒数曲线与无抑制剂的曲线相交于纵坐标I/Vmax处，但横坐标的截距，因竞争性抑制存在而变小，说明该抑制作用，并不影响酶促反应的最大速度Vmax，而使Km值变大。
非竞争性抑制是指抑制剂I和底物S与酶E的结合互不影响，抑制剂I可以和酶E结合生成EI，也可以和ES复合物结合生成ESI。
底物S和酶E结合成ES后，仍可与I结合生成ESI，但一旦形成ESI复合物，再不能释放酶E和形成产物P。
其特点是：
I和S在结构上一般无相似之处，I常与酶分子活性部位以外的化学基团结合，这种结合并不影响底物和酶的结合，增加底物浓度并不能减少I对酶的抑制程度。
非竞争性抑制剂的双倒数曲线与无抑制剂的曲线相交于横坐标-1/Km处，但纵坐标的截距，因竞争性抑制存在变大，说明该抑制作用，不影响酶促反应的Km值，而使Vmax值变小。
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[答]酶的活性中心往往是若干个在一级结构上相距很远，但在空间结构上彼此靠近的氨基酸残基集中在一起形成具有一定空间结构的区域，该区域与底物相结合并将底物转化为产物，对于结合酶来说，辅酶或辅基往往是活性中心的组成成分。
酶的活力中心通常包括两部分：
与底物结合的部位称为结合中心，决定酶的专一性；促进底物发生化学变化的部位称为催化中心，它决定酶所催化反应的性质以及催化的效率。
有些酶的结合中心与催化中心是同一部分。
对ES和EI的X-射线晶体分析、NMR分析、对特定基团的化学修饰、使用特异性的抑制剂和对酶作用的动力学研究等方法可用于研究酶的活性中心。
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[答]影响酶催化效率的有关因素包括：
（1）底物和酶的邻近效应与定向效应，邻近效应是指酶与底物结合形成中间复合物后，使底物和底物（如双分子反应）之间，酶的催化基团与底物之间结合于同一分子而使有效浓度得以极大的升高，从而使反应速率大大增加的一种效应；定向效应是指反应物的反应基团之间和酶的催化基团与底物的反应基团之间的正确取位产生的效应。
（2）底物的形变和诱导契合（张力作用），当酶遇到其专一性底物时，酶中某些基团或离子可以使底物分子内敏感键中的某些基团的电子云密度增高或降低，产生“电子张力”，使敏感键的一端更加敏感，底物分子发生形变，底物比较接近它的过渡态，降低了反应活化能，使反应易于发生。
（3）酸碱催化，酸碱催化是通过瞬时的向反应物提供质子或从反应物接受质子以稳定过渡态，加速反应的一类催化机制。
（4）共价催化，在催化时，亲核催化剂或亲电子催化剂能分别放出电子或接受电子并作用于底物的缺电子中心或负电中心，迅速形成不稳定的共价中间复合物，降低反应活化能，使反应加速。
（5）微环境的作用：
酶的活性部位形成的微环境通常是疏水的，由于介电常数较低，可以加强有关基团之间的静电相互作用，加快酶促反映的速度。
在同一个酶促反应中，通常会有上述的3个左右的因素同时起作用，称作多元催化。
31.------------------返回试题
[答]辅酶和辅基的主要作用是在反应中传递电子、质子或一些基团，辅酶与酶蛋白结合较松，可以用透析或超滤方法除去；辅基与酶蛋白结合紧密，不能用透析或超滤方法除去，辅酶和辅基的差别仅仅是它们与酶蛋白结合的牢固程度不同，无严格的界限。
32.------------------返回试题
[答]底物浓度、酶含量、温度、pH、产物等均影响酶的活性，此外称为激活剂或抑制剂的某些无机或有机化学物质也会强烈影响酶的活性。
天然酶在其自然环境中（细胞或组织中）是受到细胞调控的。
细胞对酶的活性的控制主要是通过代谢反馈、可逆的共价修饰、细胞区室化（不同的区室pH、底物浓度等不同，可以避免产物的积累）和酶原激活等控制。
制备酶制剂时，要尽量避免高温、极端pH、抑制剂等的影响，酶制剂应尽可能制成固体，并在低温下保存。
无法制成固体的酶，可在液态低温保存，但要注意某些液态酶在冰冻时会失去活性。
33.------------------返回试题
[答]谷氨酸的?
-羧基的pKa值约为4.0，在近中性条件下，该基团去质子化，在酶促反应中起着碱催化剂的作用。
赖氨酸的?
-氨基的pKa值约为10.0，在近中性条件下，它被质子化，在酶促反应中起着酸催化剂的作用。
34.------------------返回试题
[答]
（1）测定不同底物浓度下的酶促反应速度；
（2）分别在几种不同抑制剂浓度存在下测定底物浓度对酶促反应速度的影响；（3）在测定相应反应速度后，以1/v对1/[S]作图（双倒数图）；（4）从坐标图上量取-1/Km和1/Vmax的距离，即可求出Km和Vmax；（5）比较无抑制剂和有抑制剂存在下的Km和Vmax。
在抑制剂存在下，如果Km增大，Vmax不变，表明该抑制剂是竞争性抑制剂；如果Km不变，Vmax降低，表明该抑制剂是非竞争性抑制剂；如果Km和Vmax都降低且Vmax/Km保持不变，表明该抑制剂是反竞争性抑制剂。
35.------------------返回试题
[答]
（1）对底物的结合无显著影响；
（2）对底物的催化活性丧失。
36.------------------返回试题
[答]首先分析TPCK作为胰凝乳蛋白酶的亲和标记试剂具有什么特征结构。
一般来说，亲和标记试剂有两个特点：
①亲和标记试剂与底物非常类似，但缺乏可以被酶作用的位点，因而能选择性地与酶的活性部位结合，却不被酶作用，TPCK的结构中这一部分是其对甲苯磺酰-苯丙氨甲基酮部分；②亲和标记试剂有活泼的化学基团，可以与靶酶的活性部位中的某个残基反应，形成稳定的共价键。
TPCK的反应基团是-CH2-Cl。
其次分析胰蛋白酶与胰凝乳蛋白酶有什么相似之处。
已知胰蛋白酶和胰凝乳蛋白酶均催化肽键的裂解反应，其结构和作用机制很相似，它们的活性部位都位于酶分子表面凹陷的口袋中，都有由His、Asp和Ser形成的催化三联体，只是专一性明显不同。
胰凝乳蛋白酶的口袋被疏水氨基酸环绕，大到足以容纳一个芳香残基，因此该酶选择裂解芳香氨基酸如Phe和Tyr的羧基侧肽键。
而胰蛋白酶口袋的底部有一个带负电荷的Asp189，有利于结合带正电荷Arg和Lys残基。
根据上述分析可知：
（1）为胰蛋白酶设计一个类似TPCK的亲和标记试剂，可以将TPCK的反应基团—CH2—Cl和类似肽键结构—NH—CH—CO—保留，其余部分更换为带正电荷的Arg或Lys的R基团或其类似物；
（2）检验该抑制剂的专一性实际上就是分析其与酶的竞争结合能力，可以设计动力学实验，即分析在没有抑制剂时和有不同浓度抑制剂存在时反应速度随底物浓度的变化；（3）由于弹性蛋白与上述两种酶空间结构和催化机理相似，推测该亲和标记试剂有可能使弹性蛋白酶失活。
37.------------------返回试题
[答]酶的活性部位多数位于疏水性的裂缝中，化学基团的反应活性和化学反应的速率在非极性介质和水性介质中有明显
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