第三章 污染物的生物效应检测.docx

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第三章污染物的生物效应检测

♦第三章污染物的生物效应检测

本章将讨论以下内容

♦生物测试及方式

♦一般毒性试验

♦生物的分子和细胞水平检测

♦生物致突变、致畸和致癌效应检测

♦微宇宙法

♦3.1生物测试及方式

♦生物测试（Bioassay）的概念：

•指系统地利用生物的反应测定一种或多种污染物或环境因素单独或联合存在时所导致的影响或危害。

•注释1：

所利用的生物反应包括分子、细胞、组织、器官、个体、种群、群落、生态系统各级水平上的反应。

•注释2：

生物测试不同于常规的物理、化学检测。

前者能够测定污染物对生物机体的影响，而后者只能测定污染物的浓度。

例如：

通过水污染的生物测试可获得以下数据：

各种环境因素如DO、pH、温度、混浊度等对生命的有利以及不利的浓度或强度；污染物对受测生物的毒性；各种水生生物对污染物的相对敏感性；废水所应处理的程度；允许的污染物排放浓度等。

♦生物测试的方式

♦短期生物测试（ShortTermBioassays）

•主要用于测定LC50、IC50、EC50，用来快速估计污染物的毒性，评定几种不同毒物或废物对某种生物的相对毒性或评定不同生物对不同条件如温度、pH的相对敏感性等。

多数采用静止式。

♦中期生物测试（IntermediateTermBioassays）

•时间为8d到90d，多数情况下为流动式。

♦长期生物测试（LongTermBioassays）

•包括全部生活史的生物测试（CompleteLife－cycleBioassays）和部分生活史的生物测试（PartialLife－cycleBioassays）

•目的是要测定出在持续情况下不造成有害效应的毒物最大浓度或最大允许毒物浓度（MATC）

•只能采用流动式，要保证试验的环境条件和自然界的季节变化相符合。

♦受试生物的选择（p97）

♦影响生物测试结果的因素

•受试生物

•试验条件生物测试的标准化

•实验室差异

♦3.2一般毒性试验

基本概念

♦毒物（Toxicant）

•毒物与非毒物之间不存在绝对的界限，通常一种物质只有达到中毒剂量时才是毒物。

“Thedosemakesthepoison.”

“Allsubstancesarepoisons;thereisnonewhichisnotapoison.Therightdosedifferentiatesapoisonandaremedy.”

♦中毒（Intoxication）

•中毒是各种毒性作用的综合表现，包括急性中毒、亚急性中毒、慢性中毒。

♦毒性（Toxicity）

•指一种物质引起机体损伤的能力。

毒性作用或毒效应（ToxicEffect）

♦效应（Effect）

•也称为作用，指接触一定剂量化学物后，使机体产生的生物学改变。

效应是对个体而言的，这种改变可用一定的计量单位表示。

♦反应（Response）

•指接触一定剂量化学物后，产生某种效应并达到一定强度的个体在群体中所占的比例。

反应是对群体而言的，用百分率或比值来表示，如发病率、死亡率等。

♦剂量－效应关系和剂量－反应关系

•以剂量为横坐标，以表示效应强度的计算单位或表示反应的百分率或比值为纵坐标绘制散点图所得到的曲线，即为剂量－效应关系和剂量－反应关系曲线。

•不同的化学物或同一化学物在不同条件下，其剂量与效应或反应的相关关系不同，可呈现不同类型的曲线。

（见图3－1，3－2，3－3，3－4）

♦剂量－效应关系和剂量－反应关系曲线图

♦毒性试验常用参数

♦致死剂量或致死浓度（LethalDose，LethalConcentration）

•绝对致死剂量或致死浓度（LD100、LC100）

•半数致死剂量或浓度（LD50、LC50）

•最小致死剂量或浓度（MLD、MLC）

•最大耐受剂量或浓度（LD0、LC0）

♦急性毒性剂量-反应关系曲线

♦最大无作用剂量（MaximumNo－effectLevel）

•每日容许摄入量（AcceptableDailyIntake）

•最高容许浓度（MaximumAllowableConcentration）

♦毒作用带

•急性毒作用带（Acute－toxicEffectZone）

•慢性毒作用带（Chronic－toxicEffectZone）

♦半数效应浓度（EC50）和半数抑制浓度（IC50）

♦急性毒性试验（AcuteToxicityTest）

♦急性毒性试验（AcuteToxicityTest）

•研究化学物质大剂量一次染毒或24小时内多次染毒动物所引起的毒性的试验。

•其目的是短期内了解该物质的毒性大小和特点，并为进一步开展其他毒性试验提供设计依据。

♦急性毒性试验类型

•哺乳动物急性毒性试验

•水生生物急性毒性试验

•蚯蚓急性毒性试验

♦动物急性毒性试验

（1）

动物急性毒性试验方法如下：

♦按试验要求选择受试生物

•常用成年大鼠或小鼠，雌雄动物同时试验，对试验动物预先观察几天后标记编号并随机分组。

♦预备试验和确定剂量组

•选用少量动物进行预备试验，找出引起动物90％（或全部）死亡的剂量（即最高剂量组剂量）和引起动物10％死亡（或不死亡）的剂量（即最低剂量组剂量）。

•在最高剂量组剂量和最低剂量组剂量的范围内，按等比级数插入若干个中间剂量（一般4～6组），从而确定正式试验的剂量组。

♦染毒方式和受试物的配制

•一般用灌胃法和人工熏气法。

•受试物的配制：

配制试验所需的最高剂量浓度溶液，然后依次稀释到所需浓度。

♦动物急性毒性试验

（2）

♦观察指标

•中毒症状：

一般观察24～48小时，最好观察到绝大多数动物出现典型中毒症状。

•动物死亡数目和死亡时间

•病理检查：

对于试验时立即死亡的动物，可解剖，分析死亡原因，看是技术事故还是中毒引起的死亡。

♦确定半数致死量（LD50）

♦试验结果

•LD50值越小，毒性越大。

•急性毒性试验结果只能粗略地表示某化学物质的毒性，而不能全面反映其毒性。

•由于动物种属、性别、染毒方式的不同，所表现的毒性也不一致，故表示LD50应注释明动物种类和染毒方式。

♦亚慢性毒性试验和慢性毒性试验

♦亚慢性毒性试验和慢性毒性试验

♦蓄积毒性试验

•蓄积系数法（CumulativeCoefficientMethod）：

用来评价环境污染物蓄积作用的方法。

•蓄积系数K＝

•生物半减期T＝

♦3.3生物的分子和细胞水平检测

♦加合物的测定

•DNA－加合物的测定

•蛋白加合物的测定

♦一般代谢酶的活性测定

•乙酰胆碱酯酶

•腺三磷酶

♦解毒系统酶类诱导作用的检测

•混合功能氧化酶的诱导作用

•谷胱甘肽硫转移酶

♦抗氧化防御系统检测

•过氧化氢酶

•谷胱甘肽过氧化酶

♦1、致突变作用（mutagenesis）

♦突变：

•定义：

遗传物质（染色体、基因、DNA）的突然改变。

•为生物界正常现象，有利有弊。

可自发，也可人工诱导

•严重突变是畸变与癌变的基础：

•发生在生殖细胞——子代畸形；发生在体细胞——个体肿瘤

♦环境中常见的致突变物

•主要是化学物质：

卤代甲烷、汞化合物、甲醛等

•某些物理因素：

放射线、微波等

•生物因素：

病毒

♦致突变作用

♦检测方法

•基因：

Ames实验（详细的介绍）

•DNA：

彗星实验

•染色体：

微核实验

♦2、致畸作用（teratogenesis）

♦广义的畸胎应包括结构、功能或精神活动的发育缺陷。

目前一般指解剖结构上可见的形态发育缺陷。

♦我国新生儿畸形率约为1.4％~3.3％。

目前有上升趋势。

其中以神经管畸形和唇腭裂畸形的出现率最高。

♦产生畸形的原因：

ð环境因素10%。

ð遗传因素25%

ð综合因素（环境和遗传共同作用）65%。

♦凡具有致畸胎作用的各种环境因素，统称为致畸物。

•生物因素：

风疹病毒、弓形体、梅毒螺旋体等。

•物理因素：

射线、高温、严寒、微波等。

•药物因素：

抗肿瘤药物、某些抗生素、避孕药等。

•化学因素：

•某些亚硝基化合物，

•某些烷基和苯类化合物，

•某些农药如敌枯双，

•某些重金属如铅、砷、镉、汞，

•塑料增塑剂邻苯二甲酸酯等。

•其他因素：

酗酒、大量吸烟、缺氧、严重营养不良等均有致畸作用。

♦致畸试验

•致畸试验的目的检测环境污染物能否通过妊娠母体引起胚胎畸形。

•一般试验动物要求其对化学物质的代谢过程与人相似，胎盘结构也相似，还要求孕期短，产仔多，经济实用，如家兔、大鼠、小鼠等。

♦致畸作用的评价

•注意与自然变异区分；

•注意种属差异；

•注意试验的阈剂量与人类实际可能摄入量之间的差别。

♦3、致癌作用（carcinogenesis）：

•Boyland（1969年）和Higgison（1975年）的学说：

•人类癌症10～20%与遗传有关，80%～90%与环境因素有关（其中化学因素占80%～85%，余为物理及生物性因素）。

癌变过程

•引发阶段

•促进阶段

•浸润和转移阶段

•环境中主要致癌性因素：

•空气：

多环芳烃、苯、甲醛、氡气等

•水：

砷、微囊藻毒素等

•食物：

亚硝胺、黄曲霉毒素等

♦致癌作用

♦致癌试验

•致癌试验是检验受试物及其代谢产物是否具有致癌效应或诱发肿瘤作用的慢性毒性试验法。

•短期筛检方法

•长期动物诱癌试验

♦艾姆氏试验　－　Amestest

♦　－　可用来快速地筛选物质的致突变、致癌性的一种试验方法

♦Ames试验的原理

♦化学致癌物质对细菌的诱变率与其对动物的致癌性成正比：

超过95%的致癌物质对微生物有诱变作用；而90%以上的非致癌物质对微生物没有诱变作用利用细菌突变来检测环境中存在的致癌物质是一种简便、快速、灵敏的方法。

♦由美国加利福尼亚大学

的Ames教授

首先发明，

因此又称Ames试验。

♦Ames试验是利用鼠伤寒沙门氏菌（Salmonellatyphmurium）的组氨酸营养缺陷型菌株（his-）的回复突变性能来进行的。

♦营养缺陷型（auxotroph）：

某一野生型菌株由于发生基因突变而丧失合成一种或几种生长因子的能力，因而无法在基本培养基上正常生长繁殖的变异类型。

♦野生型（wildtype）：

从自然界分离到的任何微生物在其发生营养缺陷型突变前的原始菌株。

♦基本培养基（MM）能够满足野生型菌株生长最低限度需要的培养基。

♦培养基（Medium）是供微生物、植物和动物组织生长和维持用的人工配制的养料，一般都含有碳水化合物、含氮物质、无机盐（包括微量元素）以及维生素和水等

♦Ames试验　－　同一种微生物的营养缺陷型突变型菌株与受试物（被测化学物质）接触，若此化学物质具有致突变性，可使突变型微生物再发生一次突变，重新成为野生型微生物。

这种突变叫做回复突变。

♦从不能合成组氨酸的突变菌株变成具有合成组氨酸能力的菌株

his-his+

♦细菌回复突变试验（Ames试验）

♦Ames试验结果

♦鼠伤寒沙门氏菌/哺乳动物微粒体酶试验法

•方法原理：

在动物体外将待测物经肝微粒体酶系活化后，检测其所诱发的沙门氏菌回变菌落数，即由不能自行合成组氨酸的营养缺陷型突变菌株（his－），回复为能自行合成组氨酸的（his＋）菌落数。

•突变率＝诱发回复突变菌落数/自发回复突变的菌落数（对照）

•当突变率大于2.0时，为阳性结果。

♦Ames试验的应用

1.采用Ames试验分别对泸州市南郊水厂的水源水、出厂水、末梢管网水的有机浓集物的致突变性进行检测.

结果:

水源水的有机浓集物的Ames试验呈阴性,出厂水和末梢管网水的有机浓集物的Ames试验呈阳性反应.

结论:

通过饮水氯化消毒虽然减少了水中致病微生物的作用,但是增加了氯化消毒副产物的致突变性.

2.近年来,水体污染日趋严重,各国学者从氯化后饮水中分离出多种致突变、致癌物质.为此我们采用Ames试验,对珠江流域主要取水点的水源水和对应自来水中的有机致突变物污染情况进行了研究.

♦研究表明,部分取水点的有机致突变物污染较严重,并且氯化消毒后自来水的致突性大于水源水的致突性.因而,加强饮水中致突变物质的检测,改进净水消毒剂和净水流程很有必要.

<<微生物学通报>>2002年03期

♦3.5微宇宙法

♦微宇宙（Microcosm）

•是研究污染物在生物种群、群落、生态系统和生物圈水平上的生物效应的一种方法，又称模型生态系统法（ModelEcosystem）

•可分为自然微宇宙和人工微宇宙

•根据生态系统分为水生微宇宙和陆生微宇宙

♦例1:

微宇宙法用于测试土壤或地下水对污染物的降解能力（naturalattenuation）

♦标准化水生微宇宙（StandardizedAquaticMicrocosm，SAM）-用于在实验室测定有毒物质在多物种水平对淡水生态系统的影响

•对试验设计中的时间、容器、试验生物及对物理化学参数如温度、光照强度、pH值等理化参数均有具体要求。

♦烧杯水生微宇宙（MixedFlaskCulture，MFC）-用来评价有毒物质对水生系统中种群的毒理学效应

•又称烧杯混合培养，试验时间12～14周，容器为1L的玻璃广口瓶，试验生物包括4种藻、2种无脊椎动物、一些细菌和原生动物。

对温度、光照强度、pH值等理化参数均有具体要求。

•与SAM不同的是通过加入来自生态系统浸出液提供给微宇宙中生物群落所需的基质。

♦室外水生微宇宙（OutdoorAquaticMicrocosm）

•又称中宇宙（Mesocosm），试验单元6m3，试验生物包括浮游植物、浮游动物、鱼类、大型水生植物和无脊椎动物，研究有毒物质对水生态系统的影响和有毒物质在水环境中的归宿。

♦土壤核心微宇宙（SoilCoreMicrocosm，SCM）

•该法采用野外环境的土壤核心，将其设置在环境条件控制的实验室中，试验生物因土壤核心采集场所不同而不同，可研究化学物质和营养元素对农业生态环境的影响及其环境归趋。

♦模拟农田生态系统

•该系统模拟农田条件，无陆生动物，为同时测定农药在土壤、植物、水溶液和空气中的残留而设计，采用0.75m3的矩形玻璃室，可打入足够数量的空气，通过玻璃室模拟微风并能收集挥发的农药，用来研究农药在各介质中的残留。

♦掌握概念：

生物测试、半数致死剂量、急性和慢性毒性试验、“三致作用”、微宇宙法

要点：

环境污染物的生物毒性测试方法

水污染的生物检测

♦思考题：

1.例举1-2个国内近期发生的环境污染事件，试分析环境污染物的急性毒性和慢性毒性作用，以及如何检测出污染物对其周围生态系统的影响

2.某厂家为了生产具有安全性特征的制品，要求在染色加工时分散染料必须不是致癌物质，根据本章所学的知识，如何在短时间内对所提供的多种染料安全性进行筛选？