水稻农杆菌转化方法.docx
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水稻农杆菌转化方法
方法1
NB基本培养基（右边的为N6,大量相同,加glycine甘氨酸2mg/L）
KNO32830mg/L
（NH4）2SO4463mg/L
KH2PO4400mg/L
MgSO4.7H2O185mg/L
CaCl2.2H2O166mg/L
FeSO4.7H2O27.8mg/L5.6
Na2EDTA37.5mg/L7.5
MnSO4.4H2O10mg/L27.8
H3BO33mg/L1.6
ZnSO4.7H2O2mg/L1.5
Na2MoO4.2H2O0.25mg/L0.25
CuSO4.5H2O0.025mg/L0.025
CoCl2.6H2O0.025mg/L0.025
KI0.75mg/L0.8
盐酸硫胺素thiamineCHLVB110mg/L0.1
盐酸吡哆醇pyridoxine-CHLVB61mg/L0.5
烟酸nicotinicacid1mg/L0.5
肌醇myo-inositol100mg/L100
水解酪蛋白300mg/L
谷氨酰胺500mg/L
脯氨酸500mg/L
蔗糖30,000mg/L
PHytagel2.6mg/L
pH5.8
Basic培养基
BN6（大量）50ml（20倍）
AMs-Fe盐10-20ml（100倍）CH0.3g/L
SB5macro10ml（100倍）phytogel4g/L或agar8g/L
IB5vita10ml（100倍）sucrose30g/L
Cproline0.5g/Lglutamine0.5g/L
N6（大量梗稻种子）终浓度母液（20倍）终浓度母液（20倍）
培KNO32830mg/L56.6g/LMgSO4.7H2O185mg/L3.7g/L
养（NH4）2SO4463mg/L9.26g/LCaCl2.2H2O166mg/L3.32g/L
基KH2PO4400mg/L8.00g/L
制备1KNO3,（NH4）2SO4,KH2PO4同时倒入烧杯,加水搅拌,使之完全溶解.
2MgSO4.7H2O先溶于加了100ML水的烧杯中溶解后再缓慢倒入1中,边倒边搅,不能有沉淀.
3CaCl2.2H2O的配制同MgSO4.7H2O
4配好后放于棕色瓶4℃保存
MS（大量籼稻种子）终浓度母液（20倍）终浓度母液（20倍）
培KNO31900mg/L38g/LMgSO4.7H2O370mg/L7.4g/L
养NH4NO31650mg/L33g/LCaCl2.2H2O440mg/L8.8g/L
基KH2PO4170mg/L3.4g/L
制备1KNO3,NH4NO3,MgSO4.7H2O同时倒入烧杯,加水搅拌
2KH2PO4先溶于加了100ML水的烧杯中溶解后再缓慢倒入1中,边倒边搅,
3CaCl2.2H2O同KH2PO4
4配好后放于棕色瓶4℃保存
Ms（大量花药用）终浓度母液（20倍）终浓度母液
元素KNO32830mg/L56.6g/LMgSO4.7H2O370mg/L7.4g/L
培养（NH4）2SO4231mg/L4.62g/LCaCl2.2H2O160mg/L3.2g/L
基KH2PO4641mg/L12.82g/L
制备1KNO3,（NH4）2SO4,KH2PO4同时倒入烧杯,加水搅拌
2MgSO4.7H2O先溶于加了100ML水的烧杯中溶解后再缓慢倒入1中,边倒边搅,
不能有沉淀.CaCl2.2H2O的配制同MgSO4.7H2O
3配好后放于棕色瓶4℃保存
YM脓杆菌培养基
KH2PO40.5g/LMannitol10g/LL-Glutamine2g/L
NaCl0.2g/LMgSO40.2g/LYeastextract0.3g/L
Agar15g/LPH=7.0
诱导愈伤、继代培养基basic+2,4-D（2mg/L）PH=5.8
共培养培养基
液体:
N6（大）+Fe+B5（micro）+B5（vita）+sucrose（前四项与basic相同）
+肌醇2g/L+CH500mg/L+phytogel+0.1%AS
固体:
N6（大）+Fe+B5（micro）+B5（vita）+sucrose（前四项与basic相同）
+肌醇2g/L+CH500mg/L+2,4-D（2mg/L）+phytogel+0.1%AS
PH=5.5加2,4-D前后都要调PH值.灭完菌,温度降下来后加AS
筛选培养基诱导愈伤+cef（300mg/L）+hyg（50mg/ml）PH=5.5
一筛,二筛的cef,hyg的浓度依次逐渐下降
分化1:
basic+KT（4mg/L）+NAA（0.25mg/L）+cef（300mg/L）+hyg（50mg/L）
培养2:
basic+KT（0.5mg/L）+NAA（0.25mg/L）+6-BA（2mg/L）+cef（300mg/L）+hyg（50mg/L）
基PH=5.8
分化培养基NB培养基：
6-BA,2.5mg,NAA,0.25mg,KT,0.5mg
壮苗培养基（生根）
sucrose30g/LN625ml/LMS-Fe盐10ml/L
B5vita10ml/Lagar7g/L
MS-Fe盐（必须单独配制,否则会沉淀,用鳌合铁）
终浓度母液（100倍）
FeSO4.7H2O27.8mg/L2.78g/L
Na-EDTA37.5mg/L3.75g/L
制备1FeSO4.7H2O溶解于水,Na-EDTA溶解于热水,将两者混合定容,于微波炉中加热,煮沸,
颜色变深,冷却到室温,补水,棕色瓶4℃保存
2,4-D母液（1g/ml）用无水乙醇溶解2,4-D后缓慢加入到H2O中,搅拌,如产生沉淀,则重配.
配好后4℃保存
NAA母液（1g/ml）用1NKOH溶解NAA,用水稀释定容,4℃保存
PAA母液（1g/ml）用无水乙醇溶解加H2O搅拌,定容,4℃保存
6-BA母液（1g/ml）用HCl溶解,加少量HCl后,用玻棒研磨成糊状,再加HCl使之完全溶解
AS（乙酰丁香酮）用DMSO直接溶解定容19.62mg/ml,分装到无菌小管
KT母液（5mg/ml）用1NKOH溶解，用水稀释定容到10ml，过滤灭菌后分装到EP管中，冰冻保存
B5vitamin终浓度母液（100倍）终浓度母液（100倍）
肌醇100mg/L10g/lNico-acid1mg/l0.1g/l
pyrido（B6）1mg/L0.1g/lthiamin（B1）10mg/L1g/l
棕色瓶4℃保存（每次配100ml为好）,肌醇在配培养基时,加入到培养基中
B5（micro）
KI0.75mg/LH3BO33.0mg/LMnSO410mg/LZnSO42.0mg/LNa2MnO4.2H2O0.25mg/L
CuSO40.025mg/LCoCl20.025mg/L
程序
1.种子去皮，挑成熟完整健康的种子
2.用70%乙醇清洗浸泡2-3分钟，洗3-4次，用0.1%升汞浸泡20-40分钟
3.无菌水洗3至4次
4.置于虑纸上吹干,吹3小时以上
5.摆放到诱导愈伤培养基上，黑暗中培养15-20天，直到长出黄色较大的愈伤
6.剥下愈伤，转至继代培养基上，黑暗培养2周
7.共培养。
脓杆菌与愈伤在液体共培养基中轻轻摇培30分钟，转至共培养基（用虑纸盖住培养基）上，
吹风3-4小时。
黑暗培养3天
8.转至筛选培养基上，吹风吹干。
黑暗培养2周。
转至二筛培养基上，黑暗培养2周，直到长出新的愈伤。
9.转至分化培养基上，黑暗培养一周。
然后明暗交替（16小时：
8小时）
10. 剪苗后，转至生根壮苗培养基上
11. 移苗到温床，田间。
方法2
水稻转化（来自文献
Forricetransformation,maturericeseedswerede-huskedandsterilisedwith3%sodiumhypochlorite（30min）.TheseedswerethoroughlywashedthreetimeswithsteriledistilledwaterandtransferredontoMSbasalmedium（MurashigeandSkoog1962）containing500mg/lproline,300mg/lcaseinhydrolyte,2mg/l2,4-dichlorphenoxyacidicacid（2,4-D）and30gsucrose,for1week.ThefreshlyinducedcalliweredippedinAgrobacteriumtumefaciens（AGL1strain）andtransferredontoNBmedium（N6macro-elements,B5micro-elements）containing500mg/lproline,300mg/lcaseinhydrolysate,and30gsucrose.Afterco-cultivationwithAgrobacterium（nodimlight,28℃,2days）,thecalliweretransferredontoNBmediumcontaining2mg/l2,4-D,120mg/lG418,and500mg/lCefotaxime.Theresistantcalliweresubculturedonfreshplatesat2-weekintervalsfor4weeks,andthentransferredontoMSmediumcontaining0.2mg/lanaphthaleneaceticacid（NAA）,3mg/l6-benzylaminopurine（6-BA）and150mg/lG418untilshootsregenerated.Shootsweretransferredonto1/2MSmediumcontaining0.5mg/lNAAforrootingandfurthergrowth.Thetransgenicplantsweregrowninthefieldorat28℃undera16/8hlight/darkcycleinthegreenhouse.
配置1升诱导培养基：
1. 水解酪蛋白300mg/L
2. 谷氨酰胺500mg/L
3. 脯氨酸500mg/L
4. 肌醇100mg/L
5. 蔗糖30g/L
6. PHytagel2.6mg/L
N6大量50毫升，B5微量5毫升，B5维生素5毫升，铁盐毫升，2,4-D母液2毫升，pH5.8
5.1水稻转化受体的准备
5.1.1水稻幼胚愈伤组织的诱导培养
取开花后12-15天左右的水稻幼穗脱粒,用清水漂去秕粒,用70%乙醇浸泡1-2分钟，然后用加有几滴Tween20的1.25%的次氯酸钠溶液（活性氯含量为1.25%）浸泡90分钟，进行表面灭菌。
（灭菌时要经常搅拌）用无菌水冲洗3-4次，沥去水备用。
在无菌滤纸上用镊子和刮牙器挤出水稻幼胚置于固体诱导培养基（NB培养基）上，26℃暗培养诱导愈伤组织。
约5-7天后剥下愈伤组织，转入新鲜配制的继代培养基（NB培养基）上，在相同条件下继代培养5天左右，用于共培养。
5.1.2水稻成熟胚愈伤组织的诱导培养
去壳的水稻成熟种子先用70%乙醇浸泡1-2分钟，然后用0.1%升汞浸泡30分钟，进行表面灭菌（最好在摇床上进行），无菌水冲洗3-4次，再将种子放在无菌滤纸上吸干水分后，放在成熟胚愈伤诱导培养基上，26℃暗培养。
约10-15天后，剥下成熟胚盾片长出的愈伤组织,转入成熟胚继代培养基上，在相同条件下继代培养。
以后每两周继代培养一次。
挑选继代培养4-5天、色泽淡黄颗粒状的愈伤组织共培养。
成熟季节的天气；颖壳和种皮表面没有麻点（病斑）；按成熟度分开（青米优于完熟米）
注意：
粳稻不适宜用NaClO灭菌。
5.2农杆菌的培养
将含有目的基因载体的农杆菌EHA105在含有50mg/LKanamycin的YM平板上划线，28℃黑暗培养2-3天，用一金属匙收集农杆菌菌体,将其悬浮于共培养CM液体培养基中，调整菌体浓度至OD600为0.3-0.5，加入AS，使AS终浓度为100mΜ，即为共培养转化水稻用的农杆菌悬浮液。
5.3水稻愈伤组织与农杆菌的共培养
挑选状态较好的继代到一定时间的水稻愈伤组织放入无菌三角瓶中,然后加入适量农杆菌悬浮液（至少保证有足够的菌液与材料接触）,室温放置20min,并不时晃动。
取出愈伤组织,在无菌滤纸上吸去多余菌液,随即转移到铺有一层无菌滤纸的固体共培养基上（将诱导愈伤和继代培养时始终紧贴培养基的那一面依然朝下放置，愈伤应摆放整齐，相互之间最好不要叠放），26℃黑暗培养2-3天。
仔细挑选无菌、状态较好（继代培养4-5天、色泽淡黄、颗粒状）的愈伤组织放入100ml无菌三角瓶中，加入适量农杆菌悬浮液，室温放置20min，并不时晃动。
倒掉菌液，将愈伤组织放在无菌滤纸上吸去多余菌液，随即转移到铺有一层无菌滤纸的固体共培养基上，25℃黑暗培养2-3天。
5.4抗性愈伤组织的筛选
将共培养后的愈伤组织（也可以水洗除菌后）放在含有50mg/lHygromycin的筛选培养基上，26℃暗培养14天，转到新鲜配制的筛选培养基上继续筛选14天。
大部分愈伤组织在筛选后10天左右褐化，然后在褐化组织的边缘重新生长出乳白色的抗性愈伤组织。
现象：
愈伤组织在选择培养基上出现脓状现象，导致培养失败。
减少菌量和共培养后水洗并不能消除这一现象。
对策：
需要从两方面把关：
从继代培养开始，精心挑选愈伤组织，杜绝染菌的愈伤组织。
另一方面，严把农杆菌关：
农杆菌不应该多次传代，坚持用单菌落的农杆菌划线。
5.5抗性愈伤组织的分化
从经两轮筛选后长出的抗性愈伤组织中，挑选乳黄色致密的抗性愈伤组织转至含有50mg/LHygromycin的分化培养基上,先暗培养3天,然后转至15h/d光照条件下培养,一般经过15-25天左右,有绿点出现。
30-40天后进一步分化出小苗。
从经两轮筛选后长出的抗性愈伤组织中，挑选乳黄色致密的抗性愈伤组织转至含有50mg/lhygromycinB的分化培养基上，先暗培养3天，然后转至15h/d光照条件下培养，一般经过15-25天左右，有绿点出现，30-40天后进一步分化出小苗。
只要愈伤组织的质量符合要求，预分化并非必需。
我们省略了预分化，将抗性愈伤组织直接转到分化培养基上，不但节省了能源、昂贵的hygromycinB和ABA，大大降低了成本，而且使转基因的时间缩短了10天。
5.6生根、壮苗和移栽
当抗性愈伤组织分化的芽长至约2cm时,将小苗移到生根培养基上,培养两周左右。
选择高约10cm、根系发达的小苗，用温水洗去培养基，在温室内移栽入土。
水面以不淹没小苗为度，如果天晴，需要遮荫到小苗成活（以吐水为准）。
A， 再生的转基因苗要适时移到生根培养基上，保证转基因苗在试管中生长正常。
B， 对过于细小的苗通过剪根、剪叶和再次转培，使转基因苗强壮。
C， 选苗高约10-15cm，根系旺盛的试管苗，选择时机直接移栽入土。
D，平整土地，保持水位，适当遮阴。
1，试管苗根系发达，株高约10cm
2，选择天气：
春夏季选阴天、傍晚移栽；
冬季选晴天移栽，连续阴雨天不适合移栽
3，洗根时的水温要与土温基本一致
4，洗根和移栽时不要将成丛的试管苗分开
5，平整土地，控制水面，水不能淹没植株
培养基
（1） LB培养基
Trypton
10
g/L
Yeastextract
5
g/L
NaCl
10
g/L
Agar
15
g/L
pH7.0
（2） YM培养基
KH2PO4
0.5
g/L
Mannitol
10
g/L
L-Glutamine
2
g/L
NaCl
0.2
g/L
MgSO4
0.2
g/L
Yeastextract
0.3
g/L
Agar
15
g/L
pH7.0
（3）NB基本培养基
KNO32830mg/L
（NH4）2SO4463mg/L
KH2PO4400mg/L
MgSO4.7H2O185mg/L
CaCl2.2H2O166mg/L
FeSO4.7H2O27.8mg/L
Na2EDTA37.5mg/L
MnSO4.4H2O10mg/L
H3BO33mg/L
ZnSO4.7H2O2mg/L
Na2MoO4.2H2O0.25mg/L
CuSO4.5H2O0.025mg/L
CoCl2.6H2O0.025mg/L
KI0.75mg/L
盐酸硫胺素10mg/L
盐酸吡哆醇1mg/L
烟酸1mg/L
肌醇100mg/L
水解酪蛋白300mg/L
谷氨酰胺500mg/L
脯氨酸500mg/L
蔗糖30,000mg/L
PHytagel2.6mg/L
pH5.8
（4）水稻愈伤诱导及继代培养基（粳稻）
NB
2,4-D
0.002
g/L
L-Glutamine
0.5
g/L
Proline
0.5
g/L
Casein
0.3
g/L
Sucrose
30
g/L
Gelrite
2.6
g/L
pH5.8
（5）共培养培养基
NB基本培养基（不包括谷氨酰胺和脯氨酸，加10克葡萄糖/升）
2,4-D2mg/L
肌醇2mg/L
pH5.5-5.2
AS（acetosyringone,乙酰丁香酮）100µM10-20毫克/升
注释：
AS于用前溶化的培养基放至55℃左右时加入；
共培养液体培养基中不加2,4-D。
（6）抗性筛选培养基
NB基本培养基
2,4-D2mg/L
cefotaxine（头孢霉素）500mg/L
hygromycinB（潮霉素）50mg/L
pH5.8
二筛时可适当降低头孢浓度。
（7）水稻分化培养基（粳稻）
NB
BA
0.002
g/L
NAA
0.0005
g/L
Sucrose
30
g/L
Gelrite
3.5-2.6
g/L
pH5.8
还要加头孢300毫克/升潮霉素50毫克/升，增加培养基的硬度和渗透压，山犁醇30克/升
（8）水稻长根壮苗培养基（粳稻）
1/2NB无机盐
1/2B5有机
Sucrose
10-15
g/L
Gelrite
2.6
g/L
pH5.8
（9）20×N6大量元素母液
KNO3
56.6
g/L
（NH4）2SO4
9.26
g/L
KH2PO4
8
g/L
MgSO4.7H2O
3.7
g/L
CaCl2.2H2O
3.32
g/L
（10）100×B5有机母液
Inositol（肌醇）
10
g/L
NicotinicAcid（VB5）
100
mg/L
Pyridoxine（VB6）
100
mg/L
Thiamine（VB1）
1
g/L
注意：
棕色瓶4度保存，每次配100毫升为好，肌醇在配培养基时直接加到培养基中。
（11）100×B5微量元素母液
H3BO3
300
mg/L
MnSO4.H2O
1000
mg/L
CoCl2.6H2O
2.5
mg/L
CuSO4.5H2O
2.5
mg/L
ZnSO4.7H2O
200
mg/L
Na2MoO4.H2O
25
mg/L
KI
75
mg/L
12）100×MSFe盐溶液
FeSO4•7H2O
2.78
g/L
Na2•EDTA
3.75
g/L
（13）20×MS大量元素母液
MSMgSO4.7H2O
3.7
g/L
KH2PO4
1.7
g/L
KNO3
19
g/L
NH4NO3
16.5
g/L
CaCl2.2H2O
4.4
g/L
（14）100×MS微量元素母液
H3BO3
0.62
g/L
MnSO4.4H2O
1.56
g/L
CoCl2.6H2O
0.0025
g/L
CuSO4.5H2O
0.0025
g/L
ZnSO4.7H2O
0.86
g/L
NaMoO4.H2O
0.025
g/L
KI
0..83
g/L
（15）100×MS有机元素母液
Myoinositol
10
g/L
NicotinicAcid（VB5）
0.05
g/L
Pyridoxine（VB6）
0.05
g/L
Thiamine（VB1）
0.1
g/L
培养基和激素母液配制方法
（1）100×MSFe盐溶液
称取2.78gFeSO4•7H2O溶于水（A液）；
称取3.75gNa2•EDTA溶于热水（B液）；
混合A液B液，加水接近1000ml；
把混合液置于微波炉内加热煮沸，混合液颜色变深，冷却到室温；
定容到1升后置于棕色试剂瓶内4℃保存。
（2）0.5mg/ml2,4-D母液的配法
称取100mg2,4-D，置于小烧杯内；
加少量无水乙醇使之完全溶解；
把2,4-D酒精溶液缓缓加入磁力搅拌器上的水中，如果出现沉淀，需要重新配置；
定容至200ml，4℃保存。
（3）0.5mg/mlα-NAA母液的配法
称取100mgNAA置于小烧杯内；
用1N的KOH溶液溶解NAA；
用水定容至200ml，4℃保存。
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