细胞生物学实验教案09级1011.docx
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细胞生物学实验教案09级1011
2010-2011细胞生物学实验（09级）
实验目录
实验一细胞形态结构观察和显微测量
实验二细胞膜的渗透性
实验三线粒体和细胞核的分离
实验四细胞的吞噬活动
实验五细胞内DNA的显示
实验六活体染色是细胞器（液泡系和线粒体）
实验七细胞骨架的观察
试验八细胞凋亡的观察
实验九细胞的凝聚反应
实验一、细胞形态结构的观察
一、实验目的：
1、熟悉动物细胞、植物细胞的基本形态结构，掌握二者之间的区别
2、掌握临时装片的制作方法
3、掌握显微测量的原理和方法
二、实验原理：
细胞是生物体结构功能的基本单位，其形态与功能相适应。
不同类型的细胞具有不同的大小、形态和结构，以适应其功能。
通过制作临时装片，可以观察很多细胞的结构，并借助测微尺测量细胞直径，进而获得细胞的体积。
三、实验仪器、试剂及材料：
仪器：
光学显微镜（24台：
台/人），载玻片、盖玻片（4套/人）、剪刀（1把）、镊子（1把）、牙签（50根）、滴管（个/组）
试剂：
1%碘液、瑞特染液
材料：
洋葱（红辣椒、兰草）、血细胞悬液、口腔上皮细胞
四、实验步骤：
1.洋葱鳞茎表皮细胞的观察（必做）
在载玻片中央滴一滴1%碘液（或清水）用剪刀在洋葱鳞茎叶外表面画一个1mm2的方框用镊子撕下表皮在碘液（清水中铺平）盖上盖玻片用吸水纸吸去多余碘液（也可帮助排除气泡）显微镜下观察（必须找到细胞内呈紫色的细胞，有核最佳）
质壁分离实验确认细胞壁：
从载物台上取下装片，在盖玻片的一侧，滴入0.3g/mL的蔗糖溶液，另一侧用吸水纸重复吸引几次。
在高倍镜下观察，可见到本来在各个细胞交界的地方都是紫色的，此时可见在细胞的角落处开始变淡，随着可见液泡变小，颜色变深，慢慢的从边角到四周完全分离开来。
质壁分离复原实验：
1处理：
取下临时装片，在一侧滴入清水，另一侧再用吸水纸重复几次吸引，以确保洋葱表皮细胞完全浸在几乎是清水中；2观察：
先在低倍镜找到一个现象质壁分离比较明显的细胞，然后换用高倍镜观察，可见和刚才相反的现象，中央液泡渐渐变大，颜色变浅，最后原生质层又和细胞壁紧紧地贴在一起。
2.人口腔黏膜上皮细胞的观察
在载玻片中央滴一滴1%碘液用牙签刮取上皮细胞在碘液中搅动分散细胞
染色1分钟盖上盖玻片观察
3.鸡红细胞观察
在载玻片右端滴一滴血细胞稀释液用另一张载玻片以30~45度角（两玻片夹角）推移血液成均匀薄膜滴一滴瑞特染液染色3分钟自来水洗掉染液，晾干
观察
4.显微测量（至少测量一种细胞）
（1）、原理：
测微尺由目镜测微尺和镜台测微尺组成，目镜测微尺位于目镜内，为玻璃圆片，有刻度，但不知道每个刻度所代表的数值，这个数值是多少通过镜台测微尺确定）；镜台测微尺是一块载玻片，中央圆形区域内有一带刻度的直线，长度为1mm,一般分为100格。
实验中需要核对一下。
无误时每一小格代表10μm。
（2）、测量：
A、将镜台测微尺放入载物台上，转动目镜，使二者平行。
选择一处让二者重合，然后向右侧寻找再次重合处，记下二者的数值，并按照目镜测微尺和镜台测微尺的精度关系换算目镜测微尺每小格实际代表的刻度值。
B、将镜台测微尺取下，换上鸡血细胞或其他装片，用目镜测微尺测量出其长度和宽度。
C、应用V=4/3Πab2（（a为长半径，b为短半径）计算出鸡血细胞的体积。
注意：
测量细胞时的放大倍数必须与校正测微尺时的显微镜倍数一致，否则需要重新矫正测微尺的刻度。
测量至少需要测量3个以上细胞，取平均值。
五、思考题
1.结合实验分析细胞形态结构的特点及其与功能的适应性。
2.如何使用测微尺？
你会测量其他细胞如细菌的大小吗？
实验二、细胞膜的渗透性
一、实验目的
1、了解细胞膜的渗透性
2、了解各类物质进入细胞的速度。
二、实验原理：
细胞膜是细胞与环境进行物质交换的选择通透性屏障。
它是一种半透膜，可选择性控制物质进出细胞。
各种物质出入细胞的方式是不同的，水是生物界最普遍的溶剂，水分子可以按照物质浓度梯度从渗透压低的一侧通过细胞膜向渗透压高的一侧扩散，这种现象就是渗透。
将红细胞放在低渗盐溶液中，水分子大量渗到细胞内，可使细胞胀破，血红蛋白释放到介质中，由不透明的红细胞悬液变为红色透明的血红蛋白溶液，这种现象称为溶血。
将红细胞放在某些等渗盐溶液中，由于红细胞膜对各种溶质的通透性不同，膜两侧的渗透压平衡会发生改变，也会发生溶血现象。
因此，发生溶血现象所需时间长短可作为测量物质进入红细胞速度的一种指标。
本实验选用红细胞作为细胞膜透性的实验材料，将其放入不同的介质溶液中，观察红细胞的变化。
三、实验仪器、试剂及材料：
1.仪器：
离心机（一台）、10ml试管（11只）、试管架（1个）、10ml移液管（11支）、洗耳球（11个）、eppendorf离心管（一包）、移液枪一套、枪头、滴管（11只）、记号笔等。
2.试剂
（1）．Alsever溶液
葡萄糖2.05g
柠檬酸钠（Na9C6H5O7.2H2O）0.89g
氯化钠0.42g
蒸馏水100ml
调PH至7.2，过滤灭菌或高压灭菌10min，置4℃冰箱保存。
（2）、0.128mol/LNaCl、0.128mol/LNH4Cl、0.128mol/LNH4AC、0.128mol/LNaNO3、0.09mol/LNa2SO4、0.09mol/L草酸铵、0.32mol/L葡萄糖、0.32mol/L甘油、
0.32mol/L乙醇、0.32mol/L正丙醇、蒸馏水
3.材料：
30%鸡血细胞悬液
四、实验步骤：
1．从集市买一只活鸡现杀取血5ml（防止污染），放入盛有20mlAlsever’s的液瓶中，混匀（如不是实验当天使用可置冰箱保存备用，2周内使用）。
2.取用Alsever’s液保存的新鲜鸡血5ml，加入8ml0.128mol/L的NaCl溶液，小心混匀，1000r/min离心3min，如此3次洗涤，最后配成30%的鸡红细胞（CRBC）悬液。
3.取11支试管，做好标记，分别加入附表中所示测试溶液3ml，再滴加红细胞悬液2滴，轻轻晃动试管，观察试管中溶液颜色的变化，记录下发生溶血所需的时间。
注：
试管内液体分两层：
上层浅黄色透明，下层红色不透明为不溶血（－）；
试管内液体混浊，上层带红色者，称不完全溶血（＋或＋＋）；
试管内液体变红而透明者，称完全溶血（＋＋＋）。
附表1
序号
溶液
是否溶血
溶血时间
1
H2O
2
NaCl、
3
NH4Cl
4
NH4AC
5
NaNO3
6
Na2SO4
7
草酸铵
8
葡萄糖
9
甘油
10
乙醇
11
正丙醇
对于不能确定是否溶血的细胞，制片于显微镜下观察，看细胞是否破碎。
说明哪些溶质可渗入红细胞，哪些不能，将能渗入红细胞的物质按进入红细胞的速度快慢排序，并解释原因。
五、思考题：
1.结合实验阐述细胞膜的渗透性和选择透性。
2.实验中有哪些注意事项？
实验三、动物细胞线粒体和细胞核的分离
一、实验目的：
了解和掌握差速离心法分级分离细胞组分的原理和方法。
二、实验原理：
分离细胞组分常采用组织匀浆和差速离心的方法。
在一定的离心场中，球形颗粒的沉降
速度取决于颗粒的密度、半径和悬浮介质的密度，在悬浮介质密度相同时，颗粒的密度、体积越大，其沉降速度越快。
细胞内各细胞器的密度和大小都不同，依据沉降原理，依次增加离心力和离心时间，就可使细胞器按密度和体积大小分批沉降，从而实现分离。
詹纳斯绿是线粒体的专一染料，它还原态无色，氧化态为蓝绿色，线粒体中的细胞色素氧化酶可将染料维持在氧化态而显蓝绿色。
三、实验仪器、试剂、材料：
1.实验仪器：
光学显微镜（24台）、台式高速离心机（4台）、离心管（若干）、玻璃匀浆器（6个）、解剖剪（1把）、镊子（1把）、吸管（若干）、载玻片及盖玻片（若干）、八层纱布（6块）、冰块
2.试剂：
0.25mol/L蔗糖溶液（含0.01mol/LTris-HCl缓冲液，pH7.4）、1%詹钠斯绿染液、吉姆萨染液、95%乙醇、生理盐水
3.材料：
鼠肝
实验步骤：
将饥饿12~24小时的小白鼠处死取肝用预冷的生理盐水洗去血污
称取1克肝组织放入冰上预冷的烧杯中剪碎，加入少量0.25mol/L蔗糖溶液洗去血污
按4ml蔗糖溶液/克肝分批加入预冷的0.25mol/L蔗糖溶液在冰浴中用玻璃
匀浆器制成肝细胞匀浆八层纱布过滤收集滤液于离心管中3000r/min离心10分钟
转移上清液于新的离心管中沉淀用0.25mol/L蔗糖溶液悬浮
10，000r/min离心15min4000r/min离心10min
弃上清，沉淀置于冰浴，制装片B用0.5ml溶液悬浮沉淀，制片A
A装片：
用95%的乙醇固定5分钟晾干吉姆萨染液染色25分钟蒸馏水漂洗几秒滤纸吸干水分观察
B装片：
在两张载玻片上加2滴1%詹钠斯绿染液让酒精蒸发掉用牙签挑少量沉淀物于染液中染色5分钟盖盖玻片高倍镜观察（线粒体为亮绿色）
注意事项：
整个操作过程必须保持低温，否则影响实验结果。
应尽量缩短组织匀浆时间。
实验四、细胞吞噬活动的观察和活体染色
一、实验目的：
1.观察巨噬细胞吞噬外源细胞的过程，了解胞吞作用。
2.掌握活体染色的原理和方法。
二、实验原理：
巨噬细胞是高等动物体内重要的免疫细胞，其具有较大的表面积，能移动和吞噬病原和
异物，形成吞噬泡，然后与初级溶酶体融合把异物分解掉。
巨噬细胞只有在活化后才具有较强的吞噬功能，因此实验前应先对实验动物进行腹腔淀粉注射增强免疫，以更好的观察吞噬现象。
活体染色是生物学中重要的研究方法。
它利用具有专一性、对细胞无毒性或毒性小的染料对生物体、生物组织、细胞进行染色以显示特异的细胞或细胞结构。
根据染色方法可分为体内活染和体外活染（超活染色）。
常用的有酸性染料如中性红和碱性染料如詹纳斯绿。
三、实验仪器、试剂、材料：
1.实验仪器：
光学显微镜（24台）、注射器（10支）、吸管（2个）、剪刀（1把）、镊子（1把）、试管（4个）、载玻片及盖玻片（50套）
2.实验试剂：
1%血细胞悬液、3%淀粉溶液（含0.4%台盼蓝）、生理盐水
3.实验材料：
小白鼠
四、实验步骤：
1.实验前4~6天对小鼠腹腔注射1ml3%淀粉溶液；
2.实验前30分钟向小鼠腹腔注射1ml1%血细胞悬液；
3.用颈椎脱臼法处死小鼠，剪开腹腔，将内脏推向一侧，用吸管吸取2ml生理盐水冲洗腹
腔，收集腹腔液至试管中。
4.取载玻片，滴一滴腹腔液，盖上盖玻片制成临时装片。
5.显微镜下暗视野观察。
注意事项：
1.实验前4~6天必须对小鼠进行免疫。
2.腹腔洗涤液的体积不可过大，否则细胞密度降低，不易观察
3.要在暗视野观察，将光强调到最大，光圈调至最小。
4.在小鼠免疫4天左右观察效果最好。
五、实验结果
绘制观察到的吞噬现象和吞噬过程图解。
实验五、细胞内DNA的显示
——Feulgen反应
一、实验目的
1.掌握细胞内DNA显示的原理和方法。
2.熟悉传统细胞化学实验的基本实验技能。
二、实验原理
Feulgen反应是一种特异的显示细胞内DNA的分布和含量的方法，于1924年由Feulgen发明。
反应的原理是DNA经弱酸（1mol/L）水解后，打开了嘌呤和脱氧核糖连接的键，在脱氧核糖的一端形成有离的醛基。
这些醛基就在原位与Schiff试剂结合，形成含醌基（紫红色）的化合物，因此凡有DNA的部位，就呈现紫红色。
三、实验器材
1.器具：
显微镜、恒温水浴锅、盖玻片、载玻片、滴管、镊子、烧杯
2.试剂：
甲醇、1mol/L盐酸、Schiff试剂、亚硫酸盐溶液、1%亮绿水溶液、甘油/PBS（封片剂）
3.材料：
2%鸡血细胞悬液
四、实验步骤
1.制备血细胞途片，晾干，加甲醇固定5min。
（此处设置对照，把涂片放在95℃5%三氯醋酸溶液中15min去掉DNA、RNA）
2.蒸馏水过一下。
3.1mol/L盐酸（60℃）水解10min。
4.1mol/L盐酸（室温）1min。
5.蒸馏水稍洗。
6.置Schiff试剂中室温染色1小时（用改良苯酚品红染色可只染20min）。
7.亚硫酸盐溶液洗3次，总时间为6min。
8．自来水流水冲洗5min。
9．用1%亮绿水溶液复染15秒。
10.自来水流水冲洗1min。
11.甘油/PBS封片剂封片；显微镜观察。
五、实验结果DNA所在处显红色，细胞质显绿色。
绘制观察结果图。
实验六、活体染色显示液泡系
（植物液泡、动物高尔基体）
一、实验目的：
1.掌握活体染色的原理
2.掌握液泡系的显示方法。
二、实验原理：
活体染色是利用对细胞无毒或毒性小的染料对动、植物及其组织细胞进行染色以显示特定的细胞或细胞结构的方法，它可以显示生活细胞中的某些天然结构。
活体染色的机制是染料的堆积，酸性染料（带负电）和碱性染料（带正电）可与被染部位的特异物质（离子）相互作用而附着。
根据染色的方式不同活体染色又可分为体内活染和体外活染（超活染色）。
在动物细胞内，凡是由膜所包围的小泡和液泡除线粒体外都属于液泡系，包括高尔基器、溶酶体、微体、消化泡、自噬小体、残体、胞饮液泡和吞噬泡，都是由一层单位膜包围而成。
软骨细胞内含有较多的粗面内质网和发达的高尔基复合体，能合成与分泌软骨粘蛋白及胶原纤维等，因而液泡系发达。
植物液泡是植物细胞独有的结构，在调节细胞渗透压、积累次生物质方面有重要作用。
随着细胞的大小和生长状态不同，植物液泡的形态和数目也有很大变化。
中性红是液泡系特殊的活体染色剂，只将液泡系染成红色，在细胞处于生活状态时，细胞质及核不被染色，中性红染色可能与液泡中的蛋白有关。
詹纳斯绿B是线粒体专一的活性染料。
三、实验器材
1.仪器：
解剖刀、镊子、刀片、显微镜、滤纸、载玻片、盖玻片
2.试剂：
1／3000中性红溶液、Ringer氏液
四、实验步骤
1.黄豆根尖液泡的观察
用刀片纵切黄豆根尖1~2cm置载玻片上加一滴中性红染色8分钟吸去染液加一滴Ringer氏液盖盖玻片，稍用力使根尖压扁观察
2.蟾蜍胸骨剑突软骨细胞液泡系活体染色及观察
取一只蟾蜍，破坏脑和脊髓剪开胸腔，取胸骨剑突软骨最薄部分的一小片放在载片上，滴两滴1／3000中性红染液染色10分钟用吸水纸吸去染液，加一滴Ringer氏液盖上盖片观察
3、洋葱细胞线粒体的观察
取洁净载玻片滴1滴1／5000詹纳斯绿染液取洋葱鳞茎内表皮于染液染色10-15分钟吸去染液，加一滴Ringer氏液盖盖玻片观察
4、人口腔黏膜上皮细胞线粒体的观察
取洁净载玻片于37℃水浴锅，滴2滴1／5000詹纳斯绿染液用牙签刮取口腔上皮细胞于染液中染色10分钟（注意染液不能干燥）盖上盖玻片，观察。
低倍镜找到细胞，高倍镜下可见染成蓝绿色的颗粒状或棒状结构（线粒体）
五、实验结果
1.黄豆根尖液泡的观察（生长点延长区成熟区）
2.软骨细胞的液泡系：
显微镜下观察，可见软骨细胞为椭圆形，细胞核周围有许多染成玫瑰红色．大小不一的小泡，即软骨细胞液泡系。
3、洋葱和人口腔黏膜上皮细胞内可见绿色的棒状或线状的线粒体。
实验七、植物细胞骨架的观察
一、实验目的
1.掌握考马斯亮蓝R250对植物细胞骨架染色的方法。
2.通过对洋葱内皮细胞的处理，掌握植物细胞骨架的制备方法。
二、实验原理
细胞骨架（cytoskeleton），是细胞内以蛋白质纤维为主要成分的网络结构，根据蛋白质纤维的直径、组成成分和组装结构的不同可分为微丝、微管和中等纤维。
细胞骨架对于维持细胞的形态结构及细胞运动、物质运输、能量转换、信号传导和细胞分裂等有重要的作用。
本试验采用去垢剂TritonX-100的缓冲液处理植物材料时，可将细胞的膜结构和大部分蛋白质抽提掉，但细胞骨架系统的蛋白却被保存下来，后者用考马斯亮蓝R250染色，在光学显微镜下可见一种网状结构。
三、实验器材
1.仪器：
光学显微镜、载玻片、滴管、擦镜纸、PH计
2.试剂：
①、0.01mol/L磷酸盐缓冲生理盐水（PBS）
0.2mol/LNa2HPO4-NaH2PO4缓冲液（PB，PH7.3）50ml
0.15mol/LNaCl
双蒸馏水加至1000ml
②、PB
0.2mol/LNa2HPO477ml
0.2mol/LNaH2PO423ml
③、M-缓冲液
咪唑（PH6.7）50mmol/L
KCl50mmol/L
MgC120.5mmol/L
EGTA1mmol/L
EDTA0.1mmol/L
巯基乙醇1mmol/L
甘油4mmol/L
用1mol/LHCl调pH至7.2。
④、1%的TritonX-100/M-缓冲液
⑤、0.2%考马斯亮蓝R250染液
甲醇46.5ml
冰醋酸7ml
蒸馏水46.5ml
6.3%戊二醛-PB溶液（PH7.3）
3.材料：
洋葱
四、实验步骤
取洋葱近中轴鳞茎内皮中、上部细胞1cm2左右置于含PBS液的载玻片上湿润后，吸去PBS加2滴1%TritonX-10030minM-缓冲液洗3次每次5min吸去缓冲液，加3%戊二醛-PB溶液，固定30min
加PBS洗2次，每次5min加0.2%考马斯亮蓝R250染色30min
水洗镜检并绘图
注意事项：
1.用去垢剂TritonX-100的缓冲液处理材料时，应控制在30min左右。
2.每一次加液或染色后，应用PBS洗2次，并用滤纸吸干。
五、实验报告及作业
1.画出实验所观察到的细胞骨架图，并注明放大倍数。
2.为什么用TritonX-100的缓冲液处理材料？
实验八、细胞凋亡的观察
一、实验目的
了解细胞凋亡的形态学特征，学习研究细胞凋亡的方法。
二、原理原理
细胞凋亡又称细胞程序性死亡，指细胞内在的由遗传机制决定的细胞死亡现象（基因调控的细胞自杀行为）。
与坏死引起的细胞体积肿大、膜破坏、染色质随机断裂相比，凋亡细胞往往体积变小、膜完整且出现发泡现象，其DNA在核小体间断裂而在电泳时出现梯状条带；在凋亡晚期，还会出现膜包裹细胞器的凋亡小体。
因此可通过染色观察细胞形态变化和电泳检测来判断细胞是否发生凋亡现象。
三、实验器材
1、实验用具：
烧杯、离心机、滴管、载玻片、盖玻片
2、实验材料：
10%鸡血红细胞、人口腔黏膜上皮细胞（如用洋葱内皮细胞需提前2天处理）
3、实验试剂：
0.85%生理盐水、阿氏抗凝液、磷酸缓冲液（pH7.2）、230nmol/LCaCl2、300μmol/L维生素K3、甲醇、吉姆萨染液
四、实验步骤
1、制备10%鸡血细胞悬液（以0.85%的生理盐水洗涤）/刮取口腔上皮细胞。
2、将细胞悬浮在300umol/L的维生素K3溶液/230nmol/LCaCl2中1~2小时诱导细胞凋亡。
（此处设置正、负对照，正对照细胞不做任何处理，负对照将细胞煮沸30min使细胞坏死）。
3、500r/min离心10min,去上清，用PBS重悬细胞（浓度为2%血细胞悬液，即为开始实验体积的5倍）
4、制备血细胞涂片，晾干后甲醇固定1分钟，晾干。
5、加吉姆萨染液染色5分钟。
6、洗掉染液，室温晾干，显微镜下观察细胞及细胞核形态。
五、实验结果：
绘制实验观察图
实验九细胞的凝聚反应
一、实验目的
1.了解细胞凝集反应的原理
2.学习使细胞发生凝集反应的方法。
二实验原理：
凝集素是一类含糖、并能与糖专一结合的蛋白质，一般认为与糖的运输、储存物质的积累、细胞间的互作以及细胞分裂的调控有关。
凝集素使细胞凝集的原理是它与细胞表面的糖分子连接，在细胞间形成“桥”。
凝集素与糖结合的活性及专一性决定其凝聚效果，加入与凝集素互补的糖可以抑制细胞的凝集。
大多数植物凝集素存在于储藏器官中，作为一种氮源；对某些植物而言，受到危害时，凝集素作为一种防御蛋白发挥作用。
三、实验器材：
1.仪器：
研钵、离心管、离心机、载玻片、光学显微镜
2.试剂：
（1）磷酸缓冲液：
pH7.2。
（2）2%鸡血细胞：
以无菌方法抽取鸡血（加肝素抗凝剂），用生理盐水洗5次，每次2000r/min离心3min，最后按红细胞体积加生理盐水配成2%血细胞悬液。
（3）生理盐水
3.材料：
马铃薯、韭菜
四、实验步骤：
1.马铃薯凝聚素的提取：
称取马铃薯去皮块茎4g，加少许磷酸缓冲液研磨成匀浆，最终加到30ml磷酸缓冲液，浸泡2h，浸出的粗提液中含有可溶性马铃薯凝集素。
2.韭菜凝聚素的提取：
称取韭菜叶片4g洗净，剪碎按1：
1（W/V）加入生理盐水（即4ml）研磨成匀浆过滤滤液5000r/min离心20min弃沉淀（转移上清）上清液加硫酸胺（约0.4g/ml）至60%饱和度沉淀5000r/min离心20min沉淀用0.25ml磷酸缓冲液溶解
3.凝聚效果的观察
用滴管分别吸取土豆、韭菜凝集素提取液各一滴，置载玻片上，加2%鸡血细胞液各一滴,充分混匀；同时滴一滴磷酸缓冲液（生理盐水）和一滴2%血细胞液作为对照。
静置2min后观察凝聚效果，并于光学显微镜下观察细胞凝集现象。
注意事项：
研磨一定要到位。
韭菜凝聚素提取中硫酸铵的量一定要适当过量，否则沉淀效果不好。
具体标准为假如硫酸铵后振摇溶解，至溶解后在离心管底部能看到少量过量的硫酸铵。
五、实验结果
1.绘图表示血细胞凝集现象，并说明原因。
2.比较马铃薯和韭菜凝集素的凝集效果并分析原因。
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