《分子生物学》复习指南答案.docx

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《分子生物学》复习指南答案

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《分子生物学》复习指南答案

一、名解

1、基因：

是含有生物信息的DNA片段，根据这些生物信息可以编码具有生物功能的产物，包括RNA和多肽链。

（课件）

2、分子伴侣（MolecularChaperone）：

又称为伴侣蛋白，是一类在序列上没有相关性但有共同功能的保守性蛋白质，在细胞内协助其它多肽结构完成正确的折叠、组装、转运和降解，在功能完成后与之分离，不构成这些蛋白质结构执行功能时的组份。

3、RFLP：

即限制性片段长度多态性。

高度重复序列中的无间隔反向重复序列很容易形成限制性内切酶识别位点，也很容易由于突变产生或失去一个酶切位点，因而可以造成限制性片段长度多态性。

即用同一种限制性内切酶消化不同个体的同一段DNA时，由于碱基组成的变化而改变限制性内切酶识别位点，从而会产生长度不同的DNA片段，这种方法称为限制性片段长度多态性，简称RFLP技术。

4、DNA的复制（replication）：

以构成基因组的全套核酸分子为模板，精确合成一套新的核酸分子的过程。

遗传信息通过亲代DNA分子的复制传递给子代，在保持生物物种遗传的稳定性方面起着重要的作用。

5、反转录：

又称逆转录（reversetranscription），是以RNA为模板，在逆转录酶的催化下，合成双链DNA的反应。

6、克隆载体：

可携带插入的外源DNA片段并可转入受体细胞中大量扩增的DNA分子。

该分子中含有能够在受体细胞中自主复制的序列和筛选标记，常用于外源基因的克隆，如噬菌体或质粒。

7、功能基因组：

细胞内所有具有生物学功能的基因。

表达一定功能的全部基因所组成的DNA序列，包括编码基因和调控基因。

8、核不均一RNA：

即hnRNA,即前体mRNA，在真核生物中，最初转录生成的RNA,存在于真核生物细胞核中的不稳定、大小不均的一组高分子RNA之总称。

由外显子和内显子组成，需经过剪接加工及各种修饰后，形成成熟的mRNA。

9、分子杂交：

由来源不同的两个脱氧核糖核酸单链或核糖核酸单链结合成双链分子的过程。

确定单链核酸碱基序列的技术，其基本原理是待测单链核酸与已知序列的单链核酸（叫做探针）间通过碱基配对形成可检出的双螺旋片段。

这种技术可在DNA与DNA，RNA与RNA，或DNA与RNA之间进行，形成DNA-DNA，RNA-RNA或RNA-DNA等不同类型的杂交分子。

10、RNA编辑：

是RNA加工的一种特殊方式，是通过对mRNA的加工使遗传信息在mRNA水平上发生改变。

有少数真核基因转录后产生的成熟mRNA序列与相应基因的编码序列有差异，这些差异是在转录物上增加、删除或取代某些核苷酸后形成的，这种编辑后的mRNA才是有翻译功能的mRNA分子。

11、操纵子：

原核生物基因多以操纵子（operon）的形式存在。

操纵子由调控区和信息区组成，上游是调控区，包括启动子（promoter）与操纵元件（operator）二部分。

操纵元件：

特异的阻遏物结合区。

12、启动子：

是RNA聚合酶结合位点及其周围的一组转录调控组件（包括转录起始点以及典型的TATA盒）。

二、填空

转基因动物：

是指用DNA重组技术将外源基因导入动物基因组内，使之能在体内表达并稳定地遗传给后代的一类动物。

端粒酶组成：

蛋白质和RNA共同组成，能以自身的RNA为模板反复延伸端丽DNA的重复序列。

载体类型：

克隆载体和表达载体（书上）

常用载体：

DNA克隆常用的载体有：

质粒载体（plasmid），噬菌体载体（phage），柯斯质粒载体（cosimid），单链DNA噬菌体载体（ssDNAphage），噬粒载体（phagemid）及酵母人工染色体（YAC）等。

从总体上讲，根据载体的使用目的，载体可以分为克隆载体，表达载体，测序载体，穿梭载体等。

基因敲除定义：

将细胞基因组中某基因去除或使基因失去活性的方法。

常用同源重组的方法敲除目的基因，观察生物或细胞的表型变化，是研究基因功能的重要手段。

PCR种类：

RT-PCR,定量RT-PCR，实时荧光定量RT-PCR，反向PCR，Alu-PCR，原位PCR，巢式PCR，不对称PCR，固相锚定PCR，长片段PCR，多重PCR。

基因打靶技术：

基因打靶通常是指用含已知序列的DNA片段与受体细胞基因组中序列相同或相近的基因发生同源重组，整合至受体细胞基因组中并得以表达的一种改变生物活体遗传信息的外源DNA导入技术。

假基因定义：

在多基因家族中某些与正常功能基因在核酸序列上相似，但不能转录或转录之后生成无功能基因产物的DNA序列被称为假基因,用ψ表示。

基因治疗定义：

基因治疗是指将目的基因导入靶细胞内，成为宿主细胞遗传物质的一部分，目的基因表达产物对疾病起治疗作用。

转录因子类型（狭义）：

指通过基因转移技术或反义核酸技术、核酶技术等，使目的基因在体内得到表达，或封闭、剪切致病基因的mRNA，从而达到治疗疾病的目的（广义）。

生殖细胞基因治疗、体细胞基因治疗

自杀基因：

是指将某些病毒或细菌的基因导入靶细胞中，其表达的酶可催化无毒的药物前体转变为细胞毒物质，从而导致携带该基因的受体细胞被杀死，此类基因称为自杀基因。

RT-PCR原理：

RT-PCR为反转录RCR（reversetranscriptionPCR）和实时PCR（realtimePCR）共同的缩写。

逆转录PCR，或者称反转录PCR（reversetranscription-PCR,RT-PCR），是聚合酶链式反应（PCR）的一种广泛应用的变形。

在RT-PCR中，一条RNA链被逆转录成为互补DNA，再以此为模板通过PCR进行DNA扩增。

DNA变性：

在某些理化因素（温度、PH、离子强度等）的作用下，DNA双链的互补碱基对之间的氢键断裂，使DNA双螺旋结构松散，成为单链的现象极为DNA变性。

只改变其二级结构，不改变他的核苷酸序列。

蛋白质分子翻译后的化学修饰方式：

糖基化、羟基化、甲基化、磷酸化、二硫键形成、亲脂性修饰

.翻译后蛋白质需要进行不同形式的共价修饰:

包括肽链N端甲硫氨酸残基的切除，蛋白质前体的酶切修饰，氨基酸残基侧链基团的磷酸化—去磷酸化、乙酰化—去乙酰化等。

翻译后蛋白质与糖链共价结合成糖蛋白，称糖基化修饰，包括N-糖基化和O-糖基化。

膜蛋白经过豆蔻酰化和棕榈酰化等脂酰化修饰才能定位于膜。

有的蛋白质翻译后由两个半胱氨酸残基上的巯基氧化形成二硫键，使蛋白质的立体结构更稳定。

也有蛋白质需要与金属离子结合转变为功能蛋白质。

Westernblotting定义：

是将蛋白质转移到膜上，然后利用抗体进行检测。

对已知表达蛋白，可用相应抗体作为一抗进行检测，对新基因的表达产物，可通过融合部分的抗体检测。

疾病分子机制研究策略：

欢迎解答？

？

？

基因表达调控方式类型:

1、原核生物：

转录水平调控（启动子、S因子、阻遏蛋白、正调控蛋白）、翻译水平调控（SD序列、mRNA的稳定性及翻译产物的调控作用）2、真核生物：

DNA水平（染色质丢失、基因扩增、基因重排、DNA甲基化、染色质结构改变）、转录水平（反式作用因子）

原核生物基因表达的调控主要为

（1）转录水平上的调控

（2）转录后水平上的调控① mRNA加工成熟水平上的调控② 翻译水平上的调控主要调控机制为操纵子

真核生物基因表达调控的环节：

DNA水平的调控，转录水平的调控，转录后水平的调控，翻译水平的调控，翻译后水平的调控（见P62和第八章）

管家基因：

有些基因产物对生命全过程都是必须的或必不可少的。

这类基因在一个生物个体的几乎所有细胞中持续表达，通常被称为管家基因。

顺式作用元件：

就是指可影响自身基因表达活性的DNA序列

PCR-ELISA分析:

即在PCR扩增以后，在微也板上借用酶联免疫吸附试验（ELISA）的原理，使用酶标抗体，进行固相杂交来实现定量。

被称为PCR－ELISA：

反式作用因子：

真核细胞内含有大量的序列特异性的DNA结合蛋白，其中一些蛋白的主要功能是使基因开放或关闭，称为反式作用因子，简称反式因子。

也称为基因特异性转录因子，是一类细胞核内蛋白质因子。

原核细胞DNA的甲基化位点：

谁来解答？

三、选择题

真核细胞参与基因表达调节的调控区比原核细胞复杂原因：

多级调控

在真核基因表达的调控中，上游调控元件（UCE）能促进转录的速率

基因突变类型:

点突变、移码突变、缺失突变、插入突变（按碱基变化情况分）

同义突变、错义突变、无义突变（按影响分）

溴化乙锭是一种___试剂：

高灵敏度的荧光染色剂，常用于观察PAGE或琼脂糖凝胶中的核酸；合成DNA及RNA的抑制剂及诱变剂；分离和测定核酸结构（网上搜的，仅供参考）

Dicer蛋白是:

Dicer是RNA干扰中起核心作用的一种dsRNase。

（网上搜的，仅供参考）

蛋白质芯片技术原理：

以偶联标记物的抗体分子作为探针，检测转移到固相支持物上的蛋白质分子

基因治疗靶细胞类型:

生殖细胞、体细胞

基因诊断技术类型：

核酸分子杂交、PCR技术、DNA序列测定、DNA芯片技术

真核生物基因的顺式作用元件类型：

启动子和上游启动子元件，增强子，反应元件和poly（A）加尾信号

原核基因基因组结构特点：

基因密度高，基因组序列中编码区所占比例较大；重复序列很少；含有同工酶的同基因；不同原核生物基因组中的GC含量变化很大。

受体作用的特点：

高度特异性、高亲和力、可饱和性和可逆性。

12、DNA指纹：

DNA经限制酶酶切后，以重复序列中的核心序列为探针进行DNA印迹杂交所形成的杂交带型。

13、分子伴侣特点：

分子伴侣又称伴侣蛋白，是一类序列上没有相关性但有共同功能的保守性蛋白质，它们在细胞内能协助其他多肽结构完成正确的折叠、组装、转运和降解。

分子伴侣本身不包括控制正确折叠所需的构象信息，但是能阻止非天然态多肽链的错误折叠或凝集，给处于折叠中间态的多肽链提供更多的正确折叠的机会，因而它们能提高折叠的产率但不一定能提高其速度。

目前已发现细胞内至少有两类伴侣蛋白家族，即热休克蛋白家族和伴侣素。

14、反式作用因子的激活方式：

通过基因表达产生反式作用因子、共价修饰调节蛋白的活性、与配体结合引起功能变化、蛋白质与蛋白质相互作用。

15、真核细胞转染的方法：

磷酸钙共沉淀法介导基因转染、电钻孔法介导基因转染、DEAE-葡萄糖法介导基因转染、脂质体介导基因转染、显微注射法。

16、真核转录调控作用主要环节：

反式作用因子通过结合顺式作用元件后影响转录起始复合物的形成。

17、功能基因组学研究的内容是：

基因组的表达、蛋白质产物的功能、基因组多样性的研究、基因组功能注释等。

18、限制性内切酶切割特点：

能识别双链DNA分子内部的特异位点并且裂解磷酸二酯键

19、转基因方法：

基因转移的生物学方法是以病毒载体作为基因转移系统

基因转移的非生物学方法是利用各种非病毒介质作为基因转移系统，如：

脂质体介导基因转移、细胞表面受体介导基因转移、直接注射介导基因转移、其他。

20、蛋白质生物合成肽链的方向是欢迎解答

21、基因工程使用的工具酶有哪些：

限制性核酸内切酶、DNA多聚酶、逆转录酶、DNA连接酶等。

22、真核生物的mRNA帽子结构特点：

甲基化鸟苷酸以5'磷酸基团连接mRNA5'端形成帽子结构，有Ⅰ型帽子结构和Ⅱ型帽子结构。

23、DNA损伤修复方式：

原核细胞：

直接修复、切除修复、重组修复、SOS修复

真核细胞：

细胞周期检查点控制

24、克隆载体类型：

常见克隆载体主要来自质粒和病毒

25、DNA损伤的方式：

交联、断裂、碱基突变、DNA重组

四、判断题

1.分子生物学是研究对象：

核酸、蛋白质等所有生物大分子的形态、结构特征及其重要性、规律性和相互关系的科学，2.点突变：

也称作单碱基替换，指由于DNA复制过程中的自发突变或由于物理、化学原因导致的单碱基改变发生的突变，可以分为转换和颠换3.基因定点诱变（Site-directedmutagenesis），是在体外特异性地取代、插入或缺失DNA序列中任何一个特定碱基的技术,包括盒式取代诱变、寡核苷酸引物诱变及PCR定点诱变等。

在DNA水平上产生多肽编码顺序的特异性改变称为基因的定向诱变。

4.基因诊断：

主要是应用分子生物学技术，检测人体某些基因结构或表达的变化，或者检测病原体基因组在人体内的存在，从而达到诊断疾病或监控疾病治疗效果的目的。

将分子生物学技术用于诊断疾病，可能达到前所未有的特异性强，灵敏度高，简便快速的目的。

基因诊断将成为疾病诊断的一个重要方面，也将成为法医学的一个重要手段。

5.反义RNA和siRNA：

反义RNA：

与靶核酸（如mRNA或有义DNA）链互补的RNA分子，可抑制靶核酸的功能，导致正常翻译终止的RNA分子。

根据反义RNA的作用机制可将其分为3类：

Ⅰ类反义RNA直接作用于靶mRNA的SD序列和（或）部分编码区，直接抑制翻译，或与靶mRNA结合形成双链RNA，从而易被RNA酶Ⅲ降解；Ⅱ类反义RNA与mRNA的非编码区结合，引起mRNA构象变化，抑制翻译；Ⅲ类反义RNA则直接抑制靶mRNA的转录。

反义RNA是指与mRNA互补的RNA分子，也包括与其它RNA互补的RNA分子。

由于核糖体不能翻译双链的RNA，所以反义RNA与mRNA特异性的互补结合,即抑制了该mRNA的翻译。

通过反义RNA控制mRNA的翻译是原核生物基因表达调控的一种方式。

siRNA：

小干扰RNA（SmallinterferingRNA；siRNA）有时称为短干扰RNA（shortinterferingRNA）或沉默RNA（silencingRNA），是一个长20到25个核苷酸的双股RNA，在生物学上有许多不同的用途。

目前已知siRNA主要参与RNA干扰（RNAi）现象，以带有专一性的方式调节基因的表达。

此外，也参与一些与RNAi相关的反应途径，例如抗病毒机制或是染色质结构的改变。

是一种小RNA分子（~21-25核苷酸），由Dicer（RNAaseⅢ家族中对双链RNA具有特异性的酶）加工而成。

SiRNA是siRISC的主要成员，激发与之互补的目标mRNA的沉默。

siRNA有如下特点：

　　1.长度约在22nt左右。

　　2.依赖Dicer酶的加工，是Dicer的产物，所以具有Dicer产物的特点。

　　3.生成需要Argonaute家族蛋白存在。

　　4.是RISC组分。

　　5.siRNA合成是由双链的RNA或RNA前体形成的。

　　6.siRNA一般是人工体外合成的，通过转染进入人体内，是RNA干涉的中间产物；植物体内也存在内源的siRNA。

　　7.结构上，siRNA是双链RNA。

　　8.在Dicer酶的加工过程中，siRNA对称地来源于双链RNA的前体的两侧臂。

　　9.在作用位置上，siRNA可作用于mRNA的任何部位，并与mRNA完全互补。

　　10.在作用方式上，siRNA只能导致靶标基因的降解，即为转录水平后调控。

　　11.siRNA不参与生物生长，是RNAi的产物，原始作用是抑制转座子活性和病毒感染。

6.Northernblot　Northernblot是一种通过检测RNA的表达水平来检测基因表达的方法，通过northernblot的方法可以检测到细胞在生长发育特定阶段或者胁迫或病理环境下特定基因表达情况。

指的是RNA分子从胶上转移到膜上的过程，当然它现在通指整个实验的过程。

Northernblot可用来检测不同组织、器官；生物体不同发育阶段以及胁迫环境或病理条件下特定基因的表达样式。

Northernblot还可用来检测目的基因是否具有可变剪切产物或者重复序列。

Northernblot首先通过电泳的方法将不同的RNA分子依据其分子量大小加以区分，然后通过与特定基因互补配对的探针杂交来检测目的片段。

　Northernblot的优势在于它可检测目的片段的大小、是否具有可变剪切出现、可允许探针的部分不配对性，杂交过后的膜经过一定的处理除去探针后还可保存很长时间再次杂交使用。

Westernblot称为蛋白质印迹。

它是分子生物学、生物化学和免疫遗传学中常用的一种实验方法。

其基本原理是通过特异性抗体对凝胶电泳处理过的细胞或生物组织样品进行着色。

通过分析着色的位置和着色深度获得特定蛋白质在所分析的细胞或组织中的表达情况的信息。

WesternBlot采用的是聚丙烯酰胺凝胶电泳，被检测物是蛋白质，“探针”是抗体，“显色”用标记的二抗。

经过PAGE分离的蛋白质样品，转移到固相载体（例如硝酸纤维素薄膜）上，固相载体以非共价键形式吸附蛋白质，且能保持电泳分离的多肽类型及其生物学活性不变。

以固相载体上的蛋白质或多肽作为抗原，与对应的抗体起免疫反应，再与酶或同位素标记的第二抗体起反应，经过底物显色或放射自显影以检测电泳分离的特异性目的基因表达的蛋白成分。

该技术也广泛应用于检测蛋白水平的表达。

7反式作用因子通过直接结合或间接作用于DNA、RNA等核酸分子，对基因表达发挥不同调节作用（激活或抑制）的各类蛋白质因子；起反式作用的调控元件；其本身对基因表达没有调控作用，只是阻断来自上、下游的调控效应；是指能直接或间接地识别或结合在各类顺式作用元件核心序列上参与调控靶基因转录效率的蛋白质。

（大多数真核转录调节因子由某一基因表达后，可通过另一基因的特异的顺式作用元件相互作用，从而激活另一基因的转录。

这种调节蛋白称反式作用因子。

）反式作用因子有两个重要的功能结构域:

DNA结合结构域和转录活化结构域,它们是其发挥转录调控功能的必需结构，此外还包含有连接区。

反式作用因子可被诱导合成,其活性也受多种因素的调节。

　同一类序列特异性的反式作用因子由多基因家族所编码,它们具有特定的蛋白质结构（如上述的锌指结构、碱性亮氨酸拉链、螺旋-环-螺旋基元等）和蛋白质结构上的同源性,因而构成反式作用因子家族,如类固醇激素受体家族、AP1家族等。

　　主要包括：

　　1.DNA结合域：

　　a.螺旋-转角-螺旋　　b.锌指结构　　c.亮氨酸拉链　　d.螺旋-突环-螺旋

8.RT-PCR技术即逆转录PCR，是将RNA的逆转录（RT）和cDNA的聚合酶链式扩增反应（PCR）相结合的技术。

RT-PCR技术灵敏而且用途广泛，可用于检测细胞/组织中基因表达水平，细胞中RNA病毒的含量和直接克隆特定基因的cDNA序列等。

　首先经反转录酶的作用从RNA合成cDNA，再以cDNA为模板，扩增合成目的片段。

作为模板的RNA可以是总RNA、mRNA或体外转录的RNA产物。

无论使用何种RNA，关键是确保RNA中无RNA酶和基因组DNA的污染。

RT-PCR操作流程：

1.从细胞或特定组织中提取总RNA；　　2.逆转录实验；　　3.扩增内参和目的基因并比较基因表达差异。

RT-PCR影响因素：

RT-PCR反应受多个因素影响，如硫酸镁的浓度,引物退火的温度，扩增的循环数等。

　　◇建议选择0.5-3.0mM（相差0.5mM）的硫酸镁作初步实验。

　　◇对于具有较高Tm的引物，增加退火和延伸时的温度对反应有利。

较高的温度有利于减少非特异的引物结合，因而提高特异产物的得率。

　　◇大多数目标RNA经40轮PCR反应就能观察到。

但如果目标RNA太稀少，或者只有很少的起始材料，有必要增加扩增的次数到45-50次。

9核酶：

具有生物催化功能的RNA，是生物催化剂。

又称核酸类酶，酶RNA,核酶类酶RNA。

它的发现打破了酶是蛋白质的传统观念。

10表达载体：

能使插入基因进入宿主细胞表达的克隆载体，包括原核表达载体和真核表达载体，可以是质粒、噬菌体或病毒。

典型的表达载体带有能使基因表达的调控序列，并在适当位置有可插入外源基因的限制性内切酶位点。

11蛋白质分子模体：

模体（motif）属于蛋白质的超二级结构，由2个或2个以上具有二级结构的肽段，在空间上相互接近，形成一个特殊的空间构象，并发挥专一的功能。

一种类型的模体总有其特征性的氨基酸序列。

12提高PCR扩增产物特异性方法1递减PCR通过在PCR的前几个循环使用严紧的退火条件提高特异性。

2热启动PCR是除了好的引物设计之外，提高PCR特异性最重要的方法之一。

3促进PCR的添加剂退火温度，引物设计和镁离子浓度的优化足以对大多数模板进行高特异性的扩增，但是，某些模板，包括高GC含量的模板，需要其他的措施。

影响DNA熔解温度的添加剂提供了提高产物特异性和产量的另外一种方法。

4.巢式PCR使用巢式引物进行连续多轮扩增可以提高特异性和灵敏度

五、简答题

1.基因结构与表达分析策略

DNA序列分析:

a.双脱氧链末端终止法b.化学降解法c.DNA序列分析自动化核酸分子杂交:

Southern、Northern、斑点杂交、原位杂交、液相杂交聚合酶链反应基因芯片与微阵列Western免疫印迹其它技术2.基因克隆的基本过程

一目的DNA片段的获得二载体的选择三体外重组四导入受体细胞五重组子的筛选

常用载体：

DNA克隆常用的载体有：

质粒载体（plasmid），噬菌体载体（phage），柯斯质粒载体（cosimid），单链DNA噬菌体载体（ssDNAphage），噬粒载体（phagemid）及酵母人工染色体（YAC）等。

从总体上讲，根据载体的使用目的，载体可以分为克隆载体，表达载体，测序载体，穿梭载体等。

常用工具酶：

限制性内切酶—DNA分子的特异切割。

DNA甲基化酶—DNA分子的甲基化。

核酸酶—DNA和RNA的非特异切割。

核酸聚合酶—DNA和RNA的合成。

核酸连接酶—DNA和RNA的的链接。

核酸末端修饰酶—DNA和RNA的末端修饰。

其它—破壁，转化，检测用酶。

3.电子克隆原理与方法

原理：

电子克隆（insilicocloning）是近年来伴随着基因组和EST计划发展起来的基因克隆新方法，它的主要原理是利用日益发展的生物信息学技术，借助电子计算机的巨大运算能力，通过EST或基因组的序列组装和拼接，利用RT-PCR的方法快速获得功能基因。

基于原理：

物种同源蛋白氨基酸序列相似性（保守性）

方法：

从GenBank的核酸（nr）数据库中检索已测序列植物的目的基因，获得目的基因cDNA序列，以该序列为模板对另一种未测序列植物EST数据库进行BLAST检索，获得与之部分同源的EST群，从中选取一条EST作为种子序列BLAST检索该植物的EST数据库，将检出与种子序列同源性较高或有部分重叠的EST序列拼接组装为重叠群（contig），再以此重叠群序列重复以上BLAST检索过程，反复进行EST重叠群序列的拼接和比对，直至检出所有的重叠EST或重叠群不能继续延伸，最终获得未测序列植物基因的cDNA全序列。

4.PCR的原理与方法

原理：

PCR（PolymeraseChainReaction）即聚合酶链式反应，是指在DNA聚合酶催化下，以母链DNA为模板，以特定引物为延伸起点，通过变性、退火、延伸等步骤，体外复制出与母链模板DNA互补的子链DNA的过程。

是一项DNA体外合成放大技术，能快速特异地在体外扩增任何目的DNA.可用于基因分离克隆，序列分析，基因表达调控，基因多态性研究等许多方面。

PCR反应基本步骤：

1、变性：

高温使双链DNA解离形成单链（94℃，30s）。

2、退火：

低温下，引物与模板DNA互补区结合（55℃，30s）。

3、延伸：

中温延伸。

DNA聚合酶催化以引物为起始点的DNA链延伸反应（70～72℃，30～60s）以上述三个步