DNA提取和常见问题分析及对策.docx

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DNA提取和常见问题分析及对策

DNA提取和常见问题

分析及对策

主讲人：

关锰

DNA简单介绍

DNA是遗传信息的载体，是最重要的生物

信息分子，是分子生物学研究的主要对象。

为了进行测序、杂交和基因的表达，获得高分子量和高纯度的DNA是非常重要的前提。

DNA提取原则

.保证DNA结构的完整性

.纯化后不应存在对酶有抑制作用的物质

.排除有机溶剂和金属离子的污染

.蛋白质、多糖、酚类等降低到最低程度

.排除其他核酸分子的污染

DNA提取的几种方法

一、染色体DNA的提取

CTAB法

SDS法其它

DNA提取的几种方法

二、非染色体DNA的提取

质粒DNA的提取

•碱裂解法

•煮沸法

线粒体、叶绿体DNA的提取

•差速离心结合SDS裂解法

CTAB法原理（植物DNA提取经典方法）

CTAB（hexadecyltrimethylammoniumbromide，十六烷基三甲基溴化铵），是一种阳离子去污剂，可溶解细胞膜，并与核酸形成复合物。

该复合物在高盐溶液中（>0.7mol/LNaCl）是可溶的，通过有机溶剂抽提，去除蛋白、多糖、酚类等杂质后加入乙醇或异丙醇沉淀即可使核酸分离出来。

注：

CTAB溶液在低于15℃时会形成沉淀析出，因此在将其加入冰冷

的植物材料之前必须预热，且离心时温度不要低于15℃。

CTAB法流程图

植物材料裂解液

异丙醇沉淀

液氮研磨抽提

离心洗涤

DNA溶液

细胞裂解

上层溶液

干燥溶解

CTAB中各个组分的作用

CTAB提取缓冲液的经典配方

.Tris-HCl（pH8.0）提供一个缓冲环境，防止核酸被破坏；

.EDTA螯合Mg2+离子或Mn2+离子，抑制DNase活性；

.NaCl提供一个高盐环境，使DNP充分溶解，存在于液相中；

.CTAB溶解细胞膜，并结合核酸，使核酸便于分离；

.β-巯基乙醇是抗氧化剂，有效地防止酚氧化成醌，避免褐变，使

酚容易去除。

CTAB提取缓冲液的改进配方

PVP（聚乙烯吡咯烷酮）是酚的络合物，能与多酚

形成一种不溶的络合物质，有效去除多酚，减少DNA中酚的污染；同时它也能和多糖结合，有效去除多糖。

除蛋白质：

✍氯仿/异戊醇抽提（氯仿可使蛋白质变性并有助于液相与有机

相的分离；异戊醇则有助于消除抽提过程

中出现的气泡）。

✍使用变性剂变性（SDS.异硫氰酸胍等）

✍高盐洗涤

✍蛋白酶处理

除多糖：

>高盐法：

用乙醇沉淀时，在待沉淀溶液中加入1/2体积

的5MNaCl，高盐可溶解多糖。

>用多糖水解酶将多糖降解。

>在提取缓冲液中加一定量的氯苯（1/2体积），氯苯可以

与多糖的羟基作用，从而去除多糖。

除酚类物质：

>在抽提液中加入防止酚类氧化的试剂：

β-巯基

乙醇.抗坏血酸.半胱氨酸.二硫苏糖醇等

>加入易与酚类结合的试剂：

如PVP.PEG（聚乙二醇），它们与酚类有较强的亲和力，可防止酚类与DNA的结合

除盐离子：

70％的乙醇洗涤

TE中成分的作用

>TE中的EDTA能螯和Mg2+或Mn2+离子，抑制DNase

>pH值为8.0，可防止DNA发生酸解

称取样品，液氮研磨，加入预热的（65℃）CTAB及β-巯基乙醇

保温1h,期间不停的摇均

吸取上清液,移至新的离心管中,加入等体积氯仿：

异戊醇（24：

1），轻缓颠倒混匀,10000rpm,10min

取上清液，移至新的离心管中,加等体积氯仿：

异戊醇,颠倒混匀,

10000rpm,10min

取上清液，加入0.6-0.7V的异丙醇（预冷），后4℃/-20℃保温沉淀

10000rpm,10min离心取沉淀，70%乙醇清洗两次，吹干

用TE溶解DNA,然后低温保存

应注意的问题

材料准备：

最好使用新鲜材料，低温保存的样品材料不要反复冻融。

液氮研磨：

研磨样品时要有液氮的保护，在整个过程中都不要让液氮挥发干净。

避免材料回温和反复冻融带来的降解。

此外尽量将样品研磨的很细，这样可以提高DNA产量。

细胞裂解：

材料应适量，过多会影响裂解，导致DNA量少，纯度低。

高温温浴时，定时轻柔振荡。

应注意的问题

DNA沉淀：

用乙醇或异丙醇都可以。

异丙醇沉淀的效率要高于无水乙

醇，试验中只需要0.6倍体积的异丙醇沉淀；而需要2倍体积的无水乙醇。

但是异丙醇沉淀容易将盐成分一起沉淀，且在DNA沉淀中异丙醇难以挥发除去。

DNA干燥：

晾干DNA，让乙醇充分挥发。

DNA溶解：

若长期储存建议使用TE缓冲液溶解。

基因组DNA的检测

>高质量的基因组DNA带型单一无拖尾现象

>DNA浓度及纯度的检测A260=1约50μg/mL

>双链DNA，A260/280约为1.8

DNA提取常见问题

问题一：

DNA样品不纯，抑制后续酶解和PCR反应。

原因

1.DNA中含有蛋白、多

糖、多酚类杂质

2.DNA在溶解前，有酒

精残留，酒精抑制对

后续酶解反应策

3.DNA中残留有金属离

子

4.有RNA的存留

•重新纯化DNA，过吸附柱去除蛋白、多糖、多酚等杂质

•重新沉淀DNA，让酒精充分挥发

•增加70％乙醇洗涤的次数（2-3次）

•加入RNase降解RNA

DNA提取常见问题

问题二：

DNA降解。

原

因

1.材料不新鲜或反复冻融

2.未很好抑制内源核酸

酶的活性对

策

3.提取过程操作过于剧

烈，DNA被机械打断

4.外源核酸酶污染

5.反复冻融

1.尽量取新鲜材料，低温保存材料避免反复冻融

2.液氮研磨或匀浆组织后，应在解冻前加入裂解缓冲液

3.在提取内源核酸酶含量丰富的材料的DNA时，可增加裂解液中螯合剂的含量，细胞裂解后的后续操作应尽量轻柔

4.所有试剂用无菌水配制，耗材经高温灭菌

5.将DNA分装保存于缓冲液中，避免

反复冻融

DNA提取常见问题

问题三：

DNA提取量少。

原

因

1.实验材料不佳或量少

2.破壁或裂解不充分对策

3.吸附或沉淀不完全

4.洗涤时DNA丢失

1.尽量选用新鲜（幼嫩）

的材料

2.植物要匀浆研磨充分

3.增加吸附的时间，或低温沉淀

4.小心操作