DNA提取和常见问题分析及对策.docx

1、DNA提取和常见问题分析及对策DNA提取和常见问题分析及对策主讲人： 关锰DNA简单介绍DNA是遗传信息的载体，是最重要的生物信息分子，是分子生物学研究的主要对象。 为了进行测序、杂交和基因的表达，获得高 分子量和高纯度的DNA是非常重要的前提。DNA提取原则. 保证DNA结构的完整性. 纯化后不应存在对酶有抑制作用的物质. 排除有机溶剂和金属离子的污染. 蛋白质、多糖、酚类等降低到最低程度. 排除其他核酸分子的污染DNA提取的几种方法一、染色体DNA的提取CTAB法SDS法 其它DNA提取的几种方法二、非染色体DNA的提取质粒DNA的提取 碱裂解法 煮沸法线粒体、叶绿体DNA的提取 差速离心

2、结合SDS裂解法CTAB法原理（植物DNA提取经典方法）CTAB（hexadecyltrimethylammonium bromide，十六烷基 三甲基溴化铵），是一种阳离子去污剂，可溶解细胞膜， 并与核酸形成复合物。该复合物在高盐溶液中（0.7mol/L NaCl）是可溶的，通 过有机溶剂抽提，去除蛋白、多糖、酚类等杂质后加入乙 醇或异丙醇沉淀即可使核酸分离出来。注：CTAB溶液在低于15 时会形成沉淀析出，因此在将其加入冰冷的植物材料之前必须预热，且离心时温度不要低于15。CTAB法流程图植物材料 裂解液异丙醇沉淀液氮研磨 抽提离心洗涤DNA溶液细胞裂解上层溶液干燥溶解CTAB中各个组分的

3、作用CTAB提取缓冲液的经典配方. Tris-HCl （pH8.0）提供一个缓冲环境，防止核酸被破坏；. EDTA螯合Mg2+离子或Mn2+离子，抑制DNase活性；. NaCl 提供一个高盐环境，使DNP充分溶解，存在于液相中；. CTAB溶解细胞膜，并结合核酸，使核酸便于分离；. -巯基乙醇是抗氧化剂，有效地防止酚氧化成醌，避免褐变，使酚容易去除。CTAB提取缓冲液的改进配方PVP（聚乙烯吡咯烷酮）是酚的络合物，能与多酚形成一种不溶的络合物质，有效去除多酚，减少 DNA中酚的污染；同时它也能和多糖结合，有效 去除多糖。除蛋白质： 氯仿/异戊醇抽提(氯仿可使蛋白质变性并有助于液相与有机相的分

4、离；异戊醇则有助于消除抽提过程中出现的气泡）。 使用变性剂变性 (SDS.异硫氰酸胍等） 高盐洗涤 蛋白酶处理除多糖： 高盐法：用乙醇沉淀时，在待沉淀溶液中加入1/2体积的5M NaCl，高盐可溶解多糖。 用多糖水解酶将多糖降解。 在提取缓冲液中加一定量的氯苯(1/2体积)，氯苯可以与多糖的羟基作用，从而去除多糖 。除酚类物质： 在抽提液中加入防止酚类氧化的试剂：-巯基乙醇.抗坏血酸.半胱氨酸.二硫苏糖醇等 加入易与酚类结合的试剂：如PVP.PEG(聚乙二 醇)，它们与酚类有较强的亲和力，可防止酚类 与DNA的结合除盐离子：70的乙醇洗涤TE中成分的作用 TE中的EDTA能螯和Mg2+或Mn2

5、+离子，抑制DNase pH值为8.0，可防止DNA发生酸解称取样品，液氮研磨，加入预热的(65 ) CTAB及-巯基乙醇保温1h,期间不停的摇均吸取上清液,移至新的离心管中,加入等体积氯仿：异戊醇（24：1），轻缓颠倒 混匀,10000rpm,10min取上清液，移至新的离心管中,加等体积氯仿：异戊醇,颠倒混匀,10000rpm,10min取上清液，加入0.6-0.7V的异丙醇（预冷），后4 /-20 保温沉淀10000rpm,10min离心取沉淀，70%乙醇清洗两次，吹干用TE溶解DNA,然后低温保存应注意的问题材料准备：最好使用新鲜材料，低温保存的样品材料不要反复冻融。液氮研磨： 研磨样

6、品时要有液氮的保护，在整个过程中都不要让液氮 挥发干净。避免材料回温和反复冻融带来的降解。此外尽 量将样品研磨的很细，这样可以提高DNA产量。细胞裂解： 材料应适量，过多会影响裂解，导致DNA量少，纯度低。 高温温浴时，定时轻柔振荡。应注意的问题DNA沉淀：用乙醇或异丙醇都可以。异丙醇沉淀的效率要高于无水乙醇，试验中只需要0.6倍体积的异丙醇沉淀；而需要2倍体 积的无水乙醇。但是异丙醇沉淀容易将盐成分一起沉淀， 且在DNA沉淀中异丙醇难以挥发除去 。DNA干燥：晾干DNA，让乙醇充分挥发。DNA溶解：若长期储存建议使用TE缓冲液溶解。基因组DNA的检测 高质量的基因组DNA带型 单一无拖尾现象

7、 DNA浓度及纯度的检测 A260=1 约 50 g/ mL 双链 DNA， A260/280 约为1.8DNA提取常见问题问题一：DNA样品不纯，抑制后续酶解和PCR反应。原因1. DNA中含有蛋白、多糖、多酚类杂质2. DNA在溶解前，有酒精残留，酒精抑制 对后续酶解反应 策3. DNA中残留有金属离子4. 有RNA的存留 重新纯化DNA，过吸附 柱去除蛋白、多糖、 多酚等杂质 重新沉淀DNA，让酒精 充分挥发 增加70乙醇洗涤的 次数（2-3次） 加入RNase降解RNADNA提取常见问题问题二：DNA降解。原因1. 材料不新鲜或反复冻 融2. 未很好抑制内源核酸酶的活性 对策3. 提取

8、过程操作过于剧烈，DNA被机械打断4. 外源核酸酶污染5. 反复冻融1. 尽量取新鲜材料，低温保存材料避 免反复冻融2. 液氮研磨或匀浆组织后，应在解冻 前加入裂解缓冲液3. 在提取内源核酸酶含量丰富的材料 的DNA时，可增加裂解液中螯合剂 的含量，细胞裂解后的后续操作应 尽量轻柔4. 所有试剂用无菌水配制，耗材经高 温灭菌5. 将DNA分装保存于缓冲液中，避免反复冻融DNA提取常见问题问题三：DNA提取量少。原因1. 实验材料不佳或量少2. 破壁或裂解不充分 对 策3. 吸附或沉淀不完全4. 洗涤时DNA丢失1. 尽量选用新鲜（幼嫩）的材料2. 植物要匀浆研磨充分3. 增加吸附的时间，或低 温沉淀4. 小心操作