1、DNA提取和常见问题分析及对策DNA提取和常见问题分析及对策主讲人: 关锰DNA简单介绍DNA是遗传信息的载体,是最重要的生物信息分子,是分子生物学研究的主要对象。 为了进行测序、杂交和基因的表达,获得高 分子量和高纯度的DNA是非常重要的前提。DNA提取原则. 保证DNA结构的完整性. 纯化后不应存在对酶有抑制作用的物质. 排除有机溶剂和金属离子的污染. 蛋白质、多糖、酚类等降低到最低程度. 排除其他核酸分子的污染DNA提取的几种方法一、染色体DNA的提取CTAB法SDS法 其它DNA提取的几种方法二、非染色体DNA的提取质粒DNA的提取 碱裂解法 煮沸法线粒体、叶绿体DNA的提取 差速离心
2、结合SDS裂解法CTAB法原理(植物DNA提取经典方法)CTAB(hexadecyltrimethylammonium bromide,十六烷基 三甲基溴化铵),是一种阳离子去污剂,可溶解细胞膜, 并与核酸形成复合物。该复合物在高盐溶液中(0.7mol/L NaCl)是可溶的,通 过有机溶剂抽提,去除蛋白、多糖、酚类等杂质后加入乙 醇或异丙醇沉淀即可使核酸分离出来。注:CTAB溶液在低于15 时会形成沉淀析出,因此在将其加入冰冷的植物材料之前必须预热,且离心时温度不要低于15。CTAB法流程图植物材料 裂解液异丙醇沉淀液氮研磨 抽提离心洗涤DNA溶液细胞裂解上层溶液干燥溶解CTAB中各个组分的
3、作用CTAB提取缓冲液的经典配方. Tris-HCl (pH8.0)提供一个缓冲环境,防止核酸被破坏;. EDTA螯合Mg2+离子或Mn2+离子,抑制DNase活性;. NaCl 提供一个高盐环境,使DNP充分溶解,存在于液相中;. CTAB溶解细胞膜,并结合核酸,使核酸便于分离;. -巯基乙醇是抗氧化剂,有效地防止酚氧化成醌,避免褐变,使酚容易去除。CTAB提取缓冲液的改进配方PVP(聚乙烯吡咯烷酮)是酚的络合物,能与多酚形成一种不溶的络合物质,有效去除多酚,减少 DNA中酚的污染;同时它也能和多糖结合,有效 去除多糖。除蛋白质: 氯仿/异戊醇抽提(氯仿可使蛋白质变性并有助于液相与有机相的分
4、离;异戊醇则有助于消除抽提过程中出现的气泡)。 使用变性剂变性 (SDS.异硫氰酸胍等) 高盐洗涤 蛋白酶处理除多糖: 高盐法:用乙醇沉淀时,在待沉淀溶液中加入1/2体积的5M NaCl,高盐可溶解多糖。 用多糖水解酶将多糖降解。 在提取缓冲液中加一定量的氯苯(1/2体积),氯苯可以与多糖的羟基作用,从而去除多糖 。除酚类物质: 在抽提液中加入防止酚类氧化的试剂:-巯基乙醇.抗坏血酸.半胱氨酸.二硫苏糖醇等 加入易与酚类结合的试剂:如PVP.PEG(聚乙二 醇),它们与酚类有较强的亲和力,可防止酚类 与DNA的结合除盐离子:70的乙醇洗涤TE中成分的作用 TE中的EDTA能螯和Mg2+或Mn2
5、+离子,抑制DNase pH值为8.0,可防止DNA发生酸解称取样品,液氮研磨,加入预热的(65 ) CTAB及-巯基乙醇保温1h,期间不停的摇均吸取上清液,移至新的离心管中,加入等体积氯仿:异戊醇(24:1),轻缓颠倒 混匀,10000rpm,10min取上清液,移至新的离心管中,加等体积氯仿:异戊醇,颠倒混匀,10000rpm,10min取上清液,加入0.6-0.7V的异丙醇(预冷),后4 /-20 保温沉淀10000rpm,10min离心取沉淀,70%乙醇清洗两次,吹干用TE溶解DNA,然后低温保存应注意的问题材料准备:最好使用新鲜材料,低温保存的样品材料不要反复冻融。液氮研磨: 研磨样
6、品时要有液氮的保护,在整个过程中都不要让液氮 挥发干净。避免材料回温和反复冻融带来的降解。此外尽 量将样品研磨的很细,这样可以提高DNA产量。细胞裂解: 材料应适量,过多会影响裂解,导致DNA量少,纯度低。 高温温浴时,定时轻柔振荡。应注意的问题DNA沉淀:用乙醇或异丙醇都可以。异丙醇沉淀的效率要高于无水乙醇,试验中只需要0.6倍体积的异丙醇沉淀;而需要2倍体 积的无水乙醇。但是异丙醇沉淀容易将盐成分一起沉淀, 且在DNA沉淀中异丙醇难以挥发除去 。DNA干燥:晾干DNA,让乙醇充分挥发。DNA溶解:若长期储存建议使用TE缓冲液溶解。基因组DNA的检测 高质量的基因组DNA带型 单一无拖尾现象
7、 DNA浓度及纯度的检测 A260=1 约 50 g/ mL 双链 DNA, A260/280 约为1.8DNA提取常见问题问题一:DNA样品不纯,抑制后续酶解和PCR反应。原因1. DNA中含有蛋白、多糖、多酚类杂质2. DNA在溶解前,有酒精残留,酒精抑制 对后续酶解反应 策3. DNA中残留有金属离子4. 有RNA的存留 重新纯化DNA,过吸附 柱去除蛋白、多糖、 多酚等杂质 重新沉淀DNA,让酒精 充分挥发 增加70乙醇洗涤的 次数(2-3次) 加入RNase降解RNADNA提取常见问题问题二:DNA降解。原因1. 材料不新鲜或反复冻 融2. 未很好抑制内源核酸酶的活性 对策3. 提取
8、过程操作过于剧烈,DNA被机械打断4. 外源核酸酶污染5. 反复冻融1. 尽量取新鲜材料,低温保存材料避 免反复冻融2. 液氮研磨或匀浆组织后,应在解冻 前加入裂解缓冲液3. 在提取内源核酸酶含量丰富的材料 的DNA时,可增加裂解液中螯合剂 的含量,细胞裂解后的后续操作应 尽量轻柔4. 所有试剂用无菌水配制,耗材经高 温灭菌5. 将DNA分装保存于缓冲液中,避免反复冻融DNA提取常见问题问题三:DNA提取量少。原因1. 实验材料不佳或量少2. 破壁或裂解不充分 对 策3. 吸附或沉淀不完全4. 洗涤时DNA丢失1. 尽量选用新鲜(幼嫩)的材料2. 植物要匀浆研磨充分3. 增加吸附的时间,或低 温沉淀4. 小心操作
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