红豆杉文献综述.doc

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武汉生物工程学院学士学位论文（设计）文献述

武汉生物工程学院

毕业论文（设计）文献综述

题目名称红豆杉无菌系的建立及愈伤组织诱导条件优化

题目类别毕业论文

系别生物工程系

专业班级0701410330

学生姓名李磊

指导教师韩晓红

辅导教师韩晓红

完成日期2010年05月01日

红豆杉无菌系的建立及愈伤组织诱导条件优化

摘要：

红豆杉是当前世界上研究最热门的药用植物之一，从中提取的紫杉醇为当前最具开发价值的植物来源的抗癌药。

本文研究了外植体和消毒方式的选择对无菌系的建立的影响。

探索了诱导其种子萌发的条件、丛生芽增殖和生根培育成试管苗的最佳激素组合。

优化了红豆杉嫩茎愈伤化诱导和愈伤组织继代的激素、抗褐化剂条件。

为红豆杉苗木的大规模生产和细胞悬浮培养高产紫杉醇提供了一定的理论依据。

关键词：

红豆杉（Taxus）；紫杉醇；愈伤组织；无菌系；芽增殖；生根；种子萌发

红豆杉是红豆杉科（Taxaceae）红豆杉属（Taxus）植物的总称，全球共有十一种，中国有4种及1变种，其中中国红豆杉和南方红豆杉为我国所特有。

由于红豆杉难以繁殖，生长极其缓慢且紫杉醇市场需求大，利润高，因此通过体外植物组织培养获得试管苗运用于观赏盆景和工业木材，细胞悬浮培养高产紫杉醇都有巨大的科研、商业前景。

红豆杉内生真菌约有300多种，而且大部分存在于茎中，种子存在休眠和后熟，难以萌发，愈伤组织易褐变及生长不稳定，本文探索了以南方红豆杉嫩茎、嫩芽为外植体最佳的消毒方式，种子试管萌发，经过丛生芽途径形成试管苗和愈伤组织诱导及继代的培养条件。

1红豆杉和紫杉醇产业发展的瓶颈

1.1红豆杉难以繁殖是制约红豆杉产业发展的瓶颈

随着红豆杉药用和材用价值的发现和提升，导致人类大量的滥砍滥发，到目前为止，野生资源已经锐减了80%，全国总资源数量108万株。

1.1.1繁殖困难的自身原因

由于植物本身的生理结构和生活习惯方面的原因，造成繁殖困难，生活能力低。

南方红豆杉种子休眠期长（12～15个月），成熟时，假种皮红色、微甜，易遭鸟鼠类侵害。

雌雄异株且搭配不合理，不利于结实。

结实大小年现象明显，多年结实一次，一般年限种子缺口很大。

种子落地后，还需要适宜的自然条件，才能发芽长出幼苗。

幼树在光照太差的情况下，也很难在高茎方面生长。

1.1.2繁殖困难的自然原因

南方红豆杉种子的传播，主要靠某些鸟鼠类进行，所以影响了树种空间布局，限制了南方红豆杉种群个体的扩展。

呈聚集性布局结构。

由于天然阔叶树不断采伐，适宜南方红豆杉幼树生长的环境逐渐减少，限制了南方红豆杉在面积和数量上的增加。

1.1.3人工播种繁殖困难的原因

南方红豆杉种子休眠属于典型的综合型休眠。

种皮可能是种子发芽的主要障碍，种皮结构由外至内为蜡质层覆盖，外种皮是一层厚壁细胞，表面角质化。

中种皮木质，厚0.4mm；内种皮膜质油质，厚3mm，形成了坚硬致密结构，不利于透水透气和种内抑制物的降解。

常需要一年多时间的变温层积和繁琐的贮藏、催芽才能少部分萌发，耗时耗力，效率低下。

1.1.4扦插育苗繁殖存在的问题

红豆杉扦插育苗成活率比较高，可达90%左右。

但仍存在着制约红豆杉产业发展的致命问题。

优良的含紫杉醇高、生物量大的单株与无性系选择工作滞后，扦插苗生长量和根系，不如种子繁育的实生苗。

扦插苗与实生苗对比，扦插苗呈灌木状，偏冠严重，呈爬地生长，空间利用率低。

扦插苗移栽造林，成活率也比较低，生产成本也比较高。

因此，当前条件下，大批量生产扦插苗，作为紫杉醇提取的原料基地，尚待做进一步深入研究。

1.2原料缺乏和合成途径低效是制约紫杉醇产业发展的瓶颈

1.2.1红豆杉来源缺乏

紫杉醇主要存在红豆杉的树皮、树枝和枝叶中。

随着人类不合理的过度开发，野生资源急剧锐减，我国在1999年将红豆杉物种列入一级保护植物，已经不具有工业开发价值。

而由于目前技术上的瓶颈，人工种植红豆杉，特别是定向选育高产紫杉醇的红豆杉还存在一系列亟待解决的问题。

即使将世界上现有的红豆杉全部砍伐，所提取的紫杉醇也只能挽救12.5万名癌症患者的生命。

高纯度紫杉醇价格昂贵，每公斤紫杉醇200万元人民币左右。

但是红豆杉生长缓慢，天然更新能力差，人工种植10亩仅能提炼1公斤1%纯度的紫杉醇。

1.2.2紫杉醇合成途径的低效

紫杉醇全化学合成路线极其复杂，成本大，产率低，尚无法应用于实际生产中。

微生物合成产量极低，不具有工业价值。

从红豆杉针叶中提取10-去乙酰浆果赤霉素Ⅲ，经四步反应合成紫杉醇的研究已取得重大进展，半合法成为目前工业生产紫杉醇的主要途径，但仍受制于红豆杉来源缺乏。

1.3针对目前红豆杉和紫杉醇产业发展瓶颈的解决方法

目前，保护现有资源，进行种条扦插育苗试验、植物组织培养快繁和愈伤组织培养研究，才是从根本上解决豆杉和紫杉醇产业发展瓶颈的途径。

2红豆杉组织快繁和组织愈伤化诱导，细胞悬浮培养产紫杉醇的现状

2.1植物组织培养植株再生的现状

2.1.1离体胚培养法

1968年LEPage-Degivry报道将休眠的欧洲红豆杉未成熟胚接种于培养基中，使其吸收营养并滤去胚中内源脱落酸（ABA），经过30天培养，胚萌发率可达28%。

1973年进一步证实可以通过在培养基中添加赤霉素以解除内源ABA对离体胚萌发的抑制作用。

1991年Flores等报道种子越成熟，其培养胚萌发率则越低。

1992年HuC-Y等研究表明，B5培养基上14天欧洲红豆杉与东北红豆杉未成熟胚生长很好，短叶红豆杉的成熟胚在MS培养基上生长较块。

1998年陈永勤等认为离体条件下红豆杉的成熟胚似乎没有休眠期，只要条件适宜，不需要任何预处理就有很高的萌发率与成苗率。

光照条件也是影响红豆杉属植物离体培养萌发的一个重要因素，陈永勤研究表明黑暗比光照有利，而Flones等见到光照下萌发结果更好。

2.1.2嫩芽增殖法

1981年Amos和McCown报道低质量浓度BA有利于嫩芽产生，高质量浓度的BA则抑制嫩芽的伸长。

不定芽的形成与BA/IBA比值和母树树龄有关，不定根的形成主要取决于IBA的质量浓度与母树树龄。

嫩芽增殖法相对于离体胚培养报道较少，而且由于红豆杉基因型不同，导致此种培养方法可行度不一致，最后似乎难于培养得到完整小植株。

2.1.3愈伤组织再生植株法

1997年王水等用云南红豆杉嫩枝做外植体研究结果表明，其外植体在含有2,4-D，NAA和KT的6,7-V培养基上产生了愈伤组织，进一步分化出芽，芽长成嫩枝后转移到含IBA或IBA和6-BA的White培养基上分化出根，形成小植株。

虽然再生植株的分化与移栽成活比较容易，然而从愈伤组织分化出芽及腋芽的萌发较慢，并且生根很困难。

2.1.4体细胞胚发生法

1993年Salandy等用红豆杉针叶诱导出的愈伤组织在含有1mg/L2,4-D和1g/L谷氨酰胺的MS培养基中进行细胞悬浮培养，出现了胚性结构细胞。

1995年Lee和Son也申请了体胚发生专利，东北红豆杉未成熟胚先在含NAA的改良B5培养基上培养后转至无激素培养基上诱导出现了体胚。

遗憾的是，所诱导出的体细胞胚的萌发能力如何，却未见报道。

2.2细胞培养产紫杉醇的现状

2.2.1愈伤组织的诱导及培养

欧洲红豆杉、短叶红豆杉、东北红豆杉愈伤组织的诱导率较高，并可产生较高含量的紫杉醇，其中以茎为最好的来源。

诱导培养基以B5，SH和6,7-V的效果最好，冯莹等研究发现SSS培养基对茎的诱导率更高。

培养基中含1.0～2.0mg/L2,4-D或含有2,4-D的激素组合对其诱导有利。

培养基中的碳源一般为2%左右的蔗糖。

2.2.2愈伤组织继代培养

大多用基本的或改良的B5培养基，少数适用的还有SH。

MS培养基可能由于氨离子浓度太高不适于红豆杉细胞生长。

一般而言培养基中1.0～2.0mg/L2，4-D或5mg/L左右的NAA对愈伤组织的正常生长是必需的。

2，4-D与激动素之比为1.0～8.0时，可使愈伤组织得到最好生长。

但是2，4-D有致癌活性，实验证明1.0mg/L的NAA与0.5mg/L的BA组合是替代2，4-D的适宜激素组合。

向培养基中添加GA3或ABA能提高红豆杉细胞的生长量。

3、细胞悬浮培养与紫杉醇的生产：

大多仍用B5培养基，只是去掉了琼脂。

甘烦远发现高浓度的蔗糖（40g/L）能提高培养细胞的紫杉醇含量，悬浮细胞的干生物量积累与糖浓度密切相关，糖的补充可明显缩短悬浮细胞生物量增加的时间。

磷起初快速吸收，而后速度减慢，Srinivasan认为磷的吸收与糖的利用密切相关。

2，4-D浓度在1.0～3.0mg/L时，对细胞生长较好，且培养细胞紫杉醇含量与2，4-D浓度呈负相关。

接种量对细胞生长和胞内外紫杉醇的积累有明显的影响。

悬浮细胞需要在转速120r/min左右的摇床上培养，其它培养条件基本同于固体培养的要求。

紫杉醇产量低是细胞培养技术实现工业化生产的最大障碍，主要原因有：

愈伤组织易褐变、细胞分化程度低、不适当的发育状态、前体转变的限制和脱分化细胞中紫杉醇合成酶活性受到抑制或缺乏适当的产物贮存部位等等。

可由以下途径提高紫杉醇产量：

添加VC、AC和柠檬酸等能一定程度上缓解褐变；诱导子的使用，常用的有茉莉酸甲酯（MJ）、花生四烯酸、稀土元素和一些生物或非生物诱导子（如：

座线孢属、青霉属、硫酸矾和3,4-二氯苯氧基二乙基胺等）等等；前体的饲喂：

Fett-Neto等发现苯丙氨酸、苯甲酸、N-苯甲酰甘氨酸、丝氨酸均可使愈伤培养或悬浮培养的细胞中紫杉醇含量增多。

甘烦远等发现前体虽能提高紫杉醇含量，但对细胞的生长作用不大，而紫杉醇的产量是由单位体积中细胞生长量和单位重量细胞中紫杉醇含量确定的；生长抑制剂的加入：

生长抑制剂（如5-MT、马来酸和丙二酸钠）的添加有利于紫杉醇的合成。

抑制剂适当地限制初级代谢，促进初级代谢向次生代谢转变；培养方式的改进：

Fett-Neto等发现红豆杉细胞生长和紫杉醇积累呈负相关，因此提出两相法，即细胞生长和生长分别在不同的培养基中进行，可以减少紫杉醇在胞内积累对于细胞代谢的反馈抑制作用和保护紫杉醇免受酶分解。

3总结

不同种类的红豆杉，不同生长地域的红豆杉，不同年龄的红豆杉，即使同一株红豆杉不同的取材时间和取材部位等对无菌系的建立，芽增殖的倍数和愈伤化诱导效果的影响很大。

特别是其内生菌数量和种类繁多，导致消毒方式的变化很大，因此，外植体的选择决定了实验能否顺利进展。

目前，种子在试管成功的萌发都需要一到三个月的变积温处理，如何找到最佳的激素及其组合水平和诱导子诱导种子短时间内萌发，提高生产效率和质量是今后需要探索的方向。

通过外植体直接产生植株，最可能的方式是丛生芽增殖，再诱导其生根的途径，但是由于红豆杉基因型不同，导致此种培养方法可行度不一致，最后似乎难于培养得到完整小植株，这也是今后亟待解决的问题。

愈伤组织在培养的过程中容易褐化，如何通过改变激素的种类及比例，添加何种抗褐化剂阻止褐化现象，同时，筛选高产紫杉醇的细胞群，这些都是今后需要努力的方向。

主要参考文献：

[1]李延红.红豆杉开发利用的研究现状[J].中国高新技术企业，2007（4）：

108-108，110

[2]吾彦，许维宏等.我国红豆杉资源现状和紫杉醇产业化对策[J].长江流域