聚赖氨酸测定方法的改进.docx

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聚赖氨酸测定方法的改进

第22卷第2期2007年6月

Vol.22No.2Jun.2007

收稿日期:

2006-10-30;修回日期:

2007-01-17

基金项目:

国家“十五”科技攻关项目（2004BA713B05-061;天津科技大学自然科学基金资助项目（20060207作者简介:

曹伟锋（1981—,男,河南人,硕士研究生.

ε-聚赖氨酸测定方法的改进

曹伟锋,谭之磊,袁国栋,贾士儒

（天津科技大学生物工程学院,天津市工业微生物重点实验室,天津300457

摘要:

研究了甲基橙法测定ε-聚赖氨酸的试验条件,得出结论:

甲基橙从水中重结晶后,溶于pH6.6、0.1mol/L磷酸钠缓冲液中,终浓度为1mmol/L;将2mLε-聚赖氨酸溶液与2mL1mmol/L甲基橙溶液混合;混合物在30℃条件下剧烈振荡30min,4000r/min离心15min;取1mL上清液稀释50倍,在465nm波长下测吸光度,计算ε-聚赖氨酸含量.

关键词:

甲基橙;ε-聚赖氨酸;比色法

中图分类号:

O657.3文献标识码:

A文章编号:

1672-6510（200702-0009-03

ImprovementoftheAssayMethodforε-polylysine

CAOWei-feng,TANZhi-lei,YUANGuo-dong,JIAShi-ru

（CollegeofBiotechnology,TianjinUniversityofScience&Technology,TianjinKeyLaboratoryofIndustrialMicrobiology,

Tianjin300457,China

Abstract:

Theconditionsofdetectingε-polylysine（ε-PLconcentrationbythemethylorangewerestudiedinthepaper.Theresultswereasfollow.Afterrecrystallizationfromwater,methylorangewasdissolvedin0.1mol/Lsodiumphosphatebuffer（pH6.6atafinalconcentrationof1mmol/L.Then2mlε-PLsolutionwasmixedwith2mlmethylorangesolution.Themixtureswerevigorouslyreactedonareciprocalshakerat30℃for30minandthencentrifugedfor15minat4000r/min.Theabsorbanceofthesupernatediluted50-foldwasreadat465nmandtheε-PLcontentwascalculated.Keywords:

methylorange;ε-polylysine;colorimetricmethod

1972年Itzhaki[1]根据甲基橙与聚赖氨酸间形成

复合物的特性,

建立了用甲基橙测定聚赖氨酸含量的方法.1973年M.hatano[2]研究了聚-L-赖氨酸-甲基橙反应体系中的旋光性,证实依靠甲基橙分子磺酸基上阴离子与聚赖氨酸氨基阳离子间形成的离子对,在

pH3~10范围内聚赖氨酸能和甲基橙形成复合物,

且形成的离子对发生在一个或两个甲基橙分子与聚赖氨酸一个氨基残基上.1977年日本学者S.shima[3]和H.sakai从放线菌培养过滤液中提取出一种含有25~30个赖氨酸残基的同型单体聚合物,这种赖氨酸聚合物是赖氨酸残基通过α-羧基和与另一赖氨酸残基的ε-氨基形成酰胺键连接而成[4],称为ε-聚赖氨酸

（ε-PL

ε-PL的测定按照Itzhaki在1972年建立的测定方法进行.在国内,董惠钧[5]和姜俊云[6]首先借鉴Itzhaki的方法,用甲基橙测定ε-PL,但由于发酵液成分的复杂性,

造成测定结果重现性差.因此,本文通过研究测定条件及发酵液中存在因素对ε-PL测定的影响,确定了甲基橙法测定ε-PL的条件.

1材料与方法

1.1试剂及仪器

甲基橙,

天津市凯通化学试剂有限公司;聚赖氨酸标准品,Sigma公司.

752紫外光栅分光光度计,上海精密科学仪器有限公司.

1.2方法[6]

将从水中重结晶甲基橙（methylorange,

MO配成不同浓度,

分别与不同浓度的ε-PL在30℃反应,剧烈震荡;反应30min,4000r/min离心15min,取上清液1

·10·第22卷第2期

mL稀释至50mL,在465nm[1]下测定稀释液的A465;反应体系含甲基橙溶液2mL,ε-PL溶液2mL.

2结果

2.1甲基橙浓度的影响

将重结晶甲基橙配成不同浓度的水溶液,

测定其A465,

以蒸馏水为对照,结果如表1.当甲基橙浓度为0.08mmol/L时,达到最大量程.因此,用分光光度计测定甲基橙的浓度应小于0.08mmol/L.

表1甲基橙浓度的影响

Tab.1Effectofmethylorangeconcentration

甲基橙/mmol·L

-1

A4650.0010.0440.0040.1110.0060.1650.0100.2720.0200.5600.0401.0580.0601.5360.080

-

取不同浓度甲基橙溶液

分别加入同体积同浓度的ε-

PL溶液,反应后的上清液用蒸馏水稀释,至甲基橙浓度为0.1mmol/L,测定结果见图

1.

图1不同甲基橙浓度下的上清液A465的变化Fig.1VariationofA465ofsupernatantswith

methylorangeconcentration

不同浓度甲基橙与ε-PL反应的程度存在差别,表现为离心后形成的ε-PL-甲基橙复合物量上的多寡,

或上清液A465不同（图1a.甲基橙浓度0.1~1mmol/L（图1b,A465变化与之成线性（R2=0.99.ε-PL的测定是以甲基橙A465的减少值来换算的.当用1mmol/L甲基橙溶液反应时A465为0.410,ε-PL与甲基橙稍有反应,即可使其反应后上清液的A465升高,处于线性区.2.2pH的影响

已知甲基橙水溶液中的变色间隔为pH3.1~4.4,pH小于3.1时,甲基橙呈红色;pH3.1~4.4,则呈橙色;pH大于4.4时,甲基橙呈黄色[7],pH对甲基橙水溶液的影响情况见表2.当pH大于4.4,pH对甲基橙溶液A465值

影响不大.采用pH6.6、

0.1mol/L磷酸钠缓冲液（用35.8g/LNa2HPO4·12H2O溶液调节15.6g/LNaH2PO4·2H2O溶液pH至6.6来维持pH的稳定是合理的.

表2pH的影响pH4.65.56.68.0A465

1.309

1.309

1.294

1.312

注:

甲基橙浓度为0.05mmol/L.

2.3磷酸钠缓冲液对ε-PL与甲基橙反应的影响

甲基橙测定ε-聚赖氨酸主要表现在其与ε-PL氨基阳离子间的反应[2],磷酸钠缓冲液可能影响ε-PL结构变化,这里考察磷酸钠缓冲液对ε-PL测定的影响.将ε-PL溶于磷酸缓冲液中,并稀释成不同浓度进行比

色测定,

考虑到ε-PL结构的变化可能不是瞬间完成,因此持续观察7d,观察磷酸钠缓冲液对ε-PL测定的影响,试验期间配成的溶液在4℃冰箱保存.由表3可知,测定所用磷酸钠缓冲液对甲基橙法测定ε-PL无影响.

表3磷酸钠缓冲液对ε-PL测定A465的影响Tab.3Effectofsodiumphosphatebuffer

onestimatomA465ofε-PL

ε-PL/g·L-1

时间/d0.100.080.060.0410.1900.2040.2220.23620.1920.2040.2220.23830.1880.2050.2240.23640.1900.2020.2240.23150.1900.2040.2200.23660.1910.2050.2250.2377

0.191

0.206

0.220

0.236

2.4发酵液成分对1mmol/L甲基橙溶液的影响2.4.1MgSO4·7H2O的影响

ε-PL发酵培养基[8]中主要的二价阳离子为Mg2+,因此考察MgSO4·7H2O浓度对甲基橙溶液A465的影响.

由图2b中可知,

当MgSO4·7H2O浓度小于0.06g/L时,MgSO4·7H2O浓度对甲基橙的影响可忽略不计.随

2007年6月曹伟锋,等:

ε-聚赖氨酸测定方法的改进·11·

MgSO4·7H2O浓度的增大,甲基橙与MgSO4·7H2O反应

且使A465急剧减小（图2a.因此,用甲基橙测定ε-PL

时,MgSO4·7H2O浓度应小于

0.06g/L.

图2MgSO4·7H2O的影响

Fig.2EffectofMgSO4·7H2O

2.4.2（NH42SO4的影响

ε-PL发酵培养基[8]中主要的一价阳离子为NH4+,

这里考察（NH42SO4浓度对甲基橙溶液A465的影响.

由表4可知,（NH42SO4浓度对比色测定ε-PL含量无

影响.

表4（NH42SO4的影响

424

（NH42SO4/g·L-112468

A4650.2470.2500.2490.2520.2450.252

注:

A465平均值为0.249,相对偏差为0.125%.

2.4.3葡萄糖的影响

ε-PL发酵培养基[8]中的碳源为葡萄糖,由表5可

知,葡萄糖对比色测定ε-PL含量无影响.

表5葡萄糖的影响

葡萄糖/g·L-1

A465

注:

A465平均值为0.258,相对偏差为0.93%.

2.5L-赖氨酸的影响

L-赖氨酸为ε-PL的单体,考察L-赖氨酸是否与

甲基橙反应.由表6可知,L-赖氨酸与甲基橙不反应.

表6L-赖氨酸对甲基橙的影响

赖氨酸/g·L-100.10.20.40.60.81.0A4650.2390.2400.2420.2450.2420.2480.238注:

A465的平均值为0.242,相对偏差为1.06%.

将L-赖氨酸溶液添加到含ε-聚赖氨酸（0.058g/L溶液中,与不加赖氨酸的ε-聚赖氨酸样品溶液作对照,观察赖氨酸是否对ε-聚赖氨酸样品测定有影响.由表7可知,L-赖氨酸对ε-PL测定无影响.

表7L-赖氨酸对ε-PL测定的影响

赖氨酸/g·L-100.10.20.40.60.81.0A4650.1860.1850.1850.1860.1890.1850.186注:

A465的平均值为0.186,相对偏差为0.46%.

2.6验证

综合以上试验结果,用甲基橙测定ε-PL的测定过程如下:

甲基橙从水中重结晶,并干燥至恒重,实验前溶于0.1mol/L磷酸钠缓冲液中（pH6.6;将ε-聚赖氨酸的标准品用0.1mol/L磷酸钠缓冲液配成不同浓度的溶液;将2mL标准品溶液与2mL1mmol/L甲基橙溶液混合;所得混合物在30℃条件下剧烈振荡,反应30min;然后4000r/min离心15min,除去产生的ε-PL与甲基橙形成的复合物.取上清液1mL用磷酸钠缓冲溶液稀释至50mL,在465nm处测吸光度.标准曲线如图

3.

图3ε-PL测定的标准曲线

Fig.3Calibrationcurveforestimationofε-polylysine用新建立的方法测定发酵液中的ε-聚赖氨酸含量,得其ε-PL含量为2.263g/L.向发酵液中加入标准品,配成标准品终浓度为2g/L,4g/L,6g/L,8g/L和10g/L的发酵液,用新建立的方法测定新配成的发酵液中ε-PL的含量（减去已知原发酵液中ε-PL含量,得其浓度为1.996g/L、3.991g/L、6.003g/L、7.992g/L和10.011g/L.比较用新建立方法所测得数值与已知加入的标准品量可知,新建立的方法是准确可靠的.（下转第32页

·32·第22卷第2期

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（上接第11页

3结论

（NH42SO4、葡萄糖、L-赖氨酸和磷酸钠缓冲液对ε-PL的测定无影响,pH、MgSO4·7H2O、甲基橙浓度等会对ε-PL的测定产生影响.因此,本文测定过程中采用pH6.6、0.1mol/L磷酸钠缓冲液来维持溶液的pH,实验确定选用的甲基橙浓度为1mmol/L,溶液中MgSO4·7H2O的浓度小于0.06g/L时将不影响ε-PL的测定.当溶液中MgSO4·7H2O的浓度大于0.06g/L时,须将溶液进行稀释然后测定.为了准确测定ε-PL的含量,探讨了甲基橙与ε-PL反应线性关系,经反复测定比较发现,当ε-PL浓度小于0.1g/L时,线性关系较好,相关系数R2>0.9.而文献[1,5,6]报道甲基橙测定ε-PL的方法,未描述测定过程中MgSO4·7H2O及其他相关实验因素的影响.

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