聚赖氨酸测定方法的改进.docx

1、聚赖氨酸测定方法的改进 第 22卷 第 2期 2007年 6月V ol.22 No. 2 Jun. 2007 收稿日期:2006-10-30; 修回日期:2007-01-17基金项目:国家“十五”科技攻关项目(2004BA713B05-061 ;天津科技大学自然科学基金资助项目(20060207 作者简介:曹伟锋(1981 ,男,河南人,硕士研究生 .-聚赖氨酸测定方法的改进曹伟锋,谭之磊,袁国栋,贾士儒(天津科技大学生物工程学院,天津市工业微生物重点实验室,天津 300457摘 要 :研究了甲基橙法测定-聚赖氨酸的试验条件 , 得出结论:甲基橙从水中重结晶后 , 溶于 pH6.6、 0.1

2、mol/L磷 酸钠缓冲液中 , 终浓度为 1 mmol/L; 将 2 mL-聚赖氨酸溶液与 2 mL 1 mmol/L甲基橙溶液混合; 混合物在 30条件 下剧烈振荡 30 min , 4 000 r/min离心 15 min; 取 1 mL 上清液稀释 50倍 , 在 465 nm 波长下测吸光度 , 计算-聚赖氨酸 含量.关键词 :甲基橙; -聚赖氨酸;比色法中图分类号 :O657.3 文献标识码 :A 文章编号 :1672-6510(2007 02-0009-03Improvement of the Assay Method for-polylysineCAO Wei-feng , TA

3、N Zhi-lei , YUAN Guo-dong , JIA Shi-ru(College of Biotechnology, Tianjin University of Science & Technology, Tianjin Key Laboratory of Industrial Microbiology,Tianjin 300457, ChinaAbstract :The conditions of detecting -polylysine (-PL concentration by the methyl orange were studied in the paper. The

4、results were as follow. After recrystallization from water,methyl orange was dissolved in 0.1mol/L sodium phosphate buffer (pH6.6 at a final concentration of 1 mmol/L. Then 2ml -PL solution was mixed with 2ml methyl orange solution. The mixtureswere vigorously reacted on a reciprocal shaker at 30 fo

5、r 30min and then centrifuged for 15min at 4000 r/min. The absorbanceof the supernate diluted 50-fold was read at 465nm and the -PL content was calculated. Keywords :methyl orange; -polylysine;colorimetric method1972年 Itzhaki 1根据甲基橙与聚赖氨酸间形成复合物的特性 ,建立了用甲基橙测定聚赖氨酸含量的 方法 . 1973年 M.hatano 2 研究了聚-L -赖氨酸-甲基

6、 橙反应体系中的旋光性 , 证实依靠甲基橙分子磺酸基 上阴离子与聚赖氨酸氨基阳离子间形成的离子对 , 在pH310范围内聚赖氨酸能和甲基橙形成复合物 ,且 形成的离子对发生在一个或两个甲基橙分子与聚赖 氨酸一个氨基残基上 . 1977年日本学者 S.shima 3和 H.sakai 从放线菌培养过滤液中提取出一种含有 2530个赖氨酸残基的同型单体聚合物 , 这种赖氨酸聚合 物是赖氨酸残基通过 -羧基和与另一赖氨酸残基的 -氨基形成酰胺键连接而成 4 , 称为 -聚赖氨酸(-PL , -PL 的测定按照 Itzhaki 在 1972年建立的 测定方法进行 . 在国内 , 董惠钧 5和姜俊云 6

7、首先借鉴 Itzhaki 的方法 , 用甲基橙测定 -PL , 但由于发酵液成 分的复杂性 ,造成测定结果重现性差 . 因此 , 本文通过 研究测定条件及发酵液中存在因素对 -PL 测定的影 响 , 确定了甲基橙法测定 -PL 的条件 .1 材料与方法1.1 试剂及仪器甲基橙 ,天津市凯通化学试剂有限公司; 聚赖氨酸 标准品 , Sigma 公司 .752紫外光栅分光光度计 , 上海精密科学仪器有限 公司 .1.2 方法 6将从水中重结晶甲基橙 (methyl orange,MO 配成 不同浓度 ,分别与不同浓度的 -PL 在 30 反应 , 剧烈 震荡; 反应 30 min, 4 000 r

8、/min离心 15 min, 取上清液 110 第 22卷 第 2期 mL稀释至 50 mL, 在 465 nm1下测定稀释液的 A 465; 反 应体系含甲基橙溶液 2 mL, -PL 溶液 2 mL.2 结 果2.1 甲基橙浓度的影响将重结晶甲基橙配成不同浓度的水溶液 ,测定其 A 465,以蒸馏水为对照 , 结果如表 1. 当甲基橙浓度为 0.08 mmol/L时 , 达到最大量程 . 因此 , 用分光光度计测 定甲基橙的浓度应小于 0.08 mmol/L.表 1 甲基橙浓度的影响Tab.1 Effect of methyl orange concentration甲基橙 /mmolL-

9、1A 4650.0010.0440.004 0.111 0.006 0.165 0.010 0.272 0.020 0.560 0.040 1.058 0.060 1.536 0.080-取不同浓度甲基橙溶液, 分别加入同体积同浓度 的 -PL 溶液 , 反应后的上清液用蒸馏水稀释 , 至甲基 橙浓度为 0.1 mmol/L, 测定结果见图1.图 1 不同甲基橙浓度下的上清液 A 465的变化 Fig. 1 Variation of A 465 of supernatants withmethyl orange concentration不同浓度甲基橙与 -PL 反应的程度存在差别 , 表 现

10、为离心后形成的 -PL -甲基橙复合物量上的多寡 ,或上清液 A 465不同(图 1a . 甲基橙浓度 0.11mmol/L(图 1b , A 465变化与之成线性 (R 2=0.99. -PL 的测定 是以甲基橙 A 465的减少值来换算的 . 当用 1 mmol/L甲 基橙溶液反应时 A 465为 0.410, -PL 与甲基橙稍有反应 , 即可使其反应后上清液的 A 465升高 , 处于线性区 . 2.2 pH的影响已知甲基橙水溶液中的变色间隔为 pH3.14.4, pH 小于 3.1时 , 甲基橙 呈 红 色; pH 3.14.4, 则 呈 橙色; pH 大于 4.4时 , 甲基橙 呈

11、 黄 色 7, pH 对甲基橙水溶液的 影响 情况 见表 2. 当 pH 大于 4.4, pH 对甲基橙溶液 A 465值影响不大 . 采 用 pH 6.6、0.1 mol/L磷 酸 钠缓冲 液 (用 35.8 g/L Na2HPO 412H2O 溶液 调节 15.6 g/L NaH 2PO 42H2O 溶液 pH 至 6.6来 维持 pH 的 稳 定是合 理 的 .表 2 pH的影响 pH 4.6 5.5 6.6 8.0 A 4651.3091.3091.2941.312注:甲基橙浓度为 0.05 mmol/L.2.3 磷酸钠缓冲液对 -PL 与甲基橙反应的影响甲基橙测定 -聚赖氨酸 主要

12、表现在其与 -PL 氨 基阳离子间的反应 2 , 磷 酸 钠缓冲 液可能影响 -PL 结 构 变化 , 这 里考察磷 酸 钠缓冲 液对 -PL 测定的影响 . 将 -PL 溶于 磷 酸 缓冲 液中 , 并 稀释成不同浓度进行 比色测定 ,考虑 到 -PL 结 构 的变化可能不是 瞬 间 完 成 , 因此 持续观察 7d , 观察磷 酸 钠缓冲 液对 -PL 测定的影 响 , 试 验期 间配成的溶液在 4 冰箱保 存 . 由表 3可知 , 测定 所 用 磷 酸 钠缓冲 液对甲基橙法测定 -PL 无 影响 .表 3 磷酸钠缓冲液对 -PL 测定 A 465的影响 Tab. 3 Effect of

13、sodium phosphate bufferon estimatom A 465 of -PL-PL/gL-1时间/d 0.10 0.08 0.06 0.04 1 0.190 0.204 0.222 0.236 2 0.192 0.204 0.222 0.238 3 0.188 0.205 0.224 0.236 4 0.190 0.202 0.224 0.231 5 0.190 0.204 0.220 0.236 6 0.191 0.205 0.225 0.237 70.1910.2060.2200.2362.4 发酵液成分对1 mmol/L甲基橙溶液的影响 2.4.1 MgSO 47H2

14、O的影响-PL 发酵培养基 8中 主要 的 二价 阳离子为 Mg 2+, 因此 考察 MgSO 47H2O 浓度对甲基橙溶液 A 465的影响 .由图 2b 中可知 ,当 MgSO 47H2O 浓度小于 0.06 g/L时 , MgSO 47H2O 浓度对甲基橙的影响可 忽略 不计 . 随2007年 6月 曹伟锋 , 等:-聚赖氨酸测定方法的改进 11MgSO 47H2O 浓度的 增 大 , 甲基橙与 MgSO 47H2O 反应且使 A 465急 剧减小(图 2a . 因此 , 用甲基橙测定 -PL时 , MgSO 47H2O 浓度应小于 0.06 g/L. 图 2MgSO 47H2O的影响F

15、ig. 2 Effect of MgSO47H 2O2.4.2 (NH4 2SO 4的影响-PL 发酵培养基 8中 主要 的一 价 阳离子为 NH 4+,这 里考察 (NH4 2SO 4浓度对甲基橙溶液 A 465的影响 .由表 4可知 , (NH4 2SO 4浓度对 比 色测定 -PL 含量 无影响 .表 4 (NH4 2SO 4的影响424(NH 4 2SO 4/gL-11 2 4 6 8A 4650.247 0.250 0.249 0.252 0.245 0.252注:A 465平均值为 0.249, 相对偏差为 0.125%.2.4.3 葡萄糖的影响-PL 发酵培养基 8中的 碳源 为

16、 葡萄糖 , 由表 5可知 , 葡萄糖 对 比 色测定 -PL 含量 无 影响 .表 5 葡萄糖的影响葡萄糖 /gL-1A 465注:A 465平均值为 0.258, 相对偏差为 0.93%.2.5 L-赖氨酸的影响L -赖氨酸为 -PL 的单体 , 考察 L -赖氨酸是 否 与甲基橙反应 . 由表 6可知 , L -赖氨酸与甲基橙不反应 .表 6 L-赖氨酸对甲基橙的影响赖氨酸 /gL-10 0.1 0.2 0.4 0.6 0.8 1.0 A 465 0.239 0.240 0.242 0.245 0.242 0.248 0.238 注:A 465的平均值为 0.242, 相对偏差为 1.0

17、6%.将 L -赖氨酸溶液 添 加到含 -聚赖氨酸 (0.058 g / L 溶液中 , 与不加赖氨酸的 -聚赖氨酸 样 品溶液 作 对照 , 观察 赖氨酸是 否 对 -聚赖氨酸 样 品测定有影响 . 由表 7可知 , L -赖氨酸对 -PL 测定 无 影响 .表 7 L-赖氨酸对 -PL 测定的影响赖氨酸 /gL-10 0.1 0.2 0.4 0.6 0.8 1.0 A 465 0.186 0.185 0.185 0.186 0.189 0.185 0.186 注:A 465的平均值为 0.186, 相对偏差为 0.46%.2.6 验证综 合以上试 验 结果 , 用甲基橙测定 -PL 的测定

18、过 程如下 :甲基橙从水中重结晶 , 并干燥 至 恒 重 , 实 验前 溶于 0.1 mol/L磷 酸 钠缓冲 液中 (pH 6.6 ; 将 -聚赖氨 酸的标准品用 0.1 mol/L磷 酸 钠缓冲 液配成不同浓度 的溶液;将 2 mL标准品溶液与 2 mL 1 mmol/L 甲基橙 溶液 混 合; 所得混 合物在 30 条件下剧烈 振 荡 , 反应 30 min; 然 后 4 000 r/min离心 15 min, 除去产 生的 -PL 与甲基橙形成的复合物 . 取上清液 1 mL用 磷 酸 钠缓 冲 溶液稀释至 50 mL, 在 465 nm处测 吸 光度 . 标准 曲 线 如图 3.图

19、3 -PL 测定的标准曲线Fig. 3 Calibration curve for estimation of -polylysine 用 新 建立的方法测定发酵液中的 -聚赖氨酸含 量 , 得 其 -PL 含量为 2.263 g/L. 向 发酵液中加入标准 品 , 配成标准品 终 浓度为 2 g/L, 4 g/L, 6 g/L, 8 g/L和 10 g/L的发酵液 , 用 新 建立的方法测定 新 配成的发酵液 中 -PL 的含量(减 去 已知 原 发酵液中 -PL 含量 , 得 其浓度为 1.996 g/L、 3.991 g/L、 6.003 g/L、 7.992 g/L和 10.011 g

20、/L. 比较 用 新 建立方法 所 测 得数 值与已知加入 的标准品量可知 , 新 建立的方法是准确可靠的 . (下转第32页32第 22卷 第 2期参 考 文 献:1Mormann W, Brocher M. Liquid crystalline thermosets (LCT from diaromatic mesogenic diepoxides and aromatic diamines: synthesis and phase behaviour of model compounds and intermediate structuresJ. Polymer, 1998, 39(25

21、:65976603.2Farren C, Akatsuka M, Takezawa Y, et al. Thermal and mechanical properties of liquid crystal-line epoxy resine as a function of mesogen concentration J. Polymer, 2001, 42 (4:15071514.3Sue H J, Earls J D, Hefner R E Jr, et al. Morphology of liquid crystalline epoxy composite matrices based

22、 on the diglycidyl ether of 4,4 -dihydroxy-methylstilbene J. Polymer, 1998, 39(20:47074714.4Ribera D, Serra A, Mantecon A. New dimeric LC-epoxy -imine monomers with oxyethylene central spacers crosslin-king study J.Polymer, 2003, 44(9 :26212629. 5赵 凌, 王跃川. 超支化聚酯型环氧树脂的合成及表征 J. 热固性树脂,2003, 18(2:1214.6

23、曹优明. 酚基丙烷环氧树脂的合成J. 渝西学院学报:自然科学版,2004,3(1:3637.7Choi E J, Ahn H K, Lee J K, et al. Liquid crystalline twin epoxy monomers based on azomethine mesogen:synthesis and curing with aromatic diaminesJ. Polymer, 2000, 41:76177625.8Lee J Y, Jang J, Hwang S S, et al. Synthesis and curing of liquid crystalline

24、 epoxy resins based on 4,4biphenolJ. Polymer,1998,39(24 :61216126.9刘振海, 陈学思. 聚合物量热测定M. 北京: 化学工业 出版社,2002:216218.10李新贵, 黄美荣. 高级液晶聚合物材料工程M. 上海: 华东师范大学出版社,2000:2425.11金日光, 华幼卿. 高分子物理M. 2版. 北京:化学工 业出版社,2000:4647.(上接第11页 3 结 论(NH 4 2SO 4、 葡萄糖 、 L -赖氨 酸和 磷 酸钠 缓 冲液 对 -PL 的 测 定无 影响 , pH 、 MgSO47H2O 、 甲基 橙浓

25、度 等 会 对 -PL 的 测 定 产生影响 . 因此 , 本文 测 定 过程 中 采 用 pH 6.6、 0.1 mol/L磷 酸钠 缓 冲液来 维持溶 液的 pH , 实验确 定 选 用的甲基 橙浓 度为 1 mmol/L, 溶 液中 MgSO 47H2O 的 浓 度小于 0.06 g/L时将不 影响 -PL 的 测 定 . 当溶 液中 MgSO 47H 2O 的 浓 度大于 0.06 g/L时 , 须 将 溶 液进行 稀释 然后 测 定 . 为了准 确测 定 -PL 的含 量 , 探讨 了甲基 橙 与 -PL 反应线性 关 系 , 经反复 测 定 比 较 发 现 , 当 -PL 浓 度小

26、于 0.1 g/L时 , 线性 关 系 较 好 , 相 关 系数 R 2 0.9. 而文 献 1,5,6报道 甲基 橙测 定 -PL 的 方 法 , 未描述测 定 过程 中 MgSO 47H 2O 及 其 他 相 关实 验因素 的 影响 .参 考 文 献 :1Itzhaki R F. Colorimetric method for estimating polylysineand polyarginine J. Anal Biochem,1972, 50:569574. 2M Hatano, M Yoneyama, Y Sato, et al. Induced optical activity

27、 in poly-L-lysine-methyl orange system J. Biopo-lymers, 1973, 12:24232430.3Shoji Shima, H Sakai. Polylysine produced by Streptom -ycesJ. Agric Biol Chem.1977, 41(9 :18071809. 4Shoji Shima, H Sakai. Poly-L-lysine produced by Strepto-myces.Part .Chemical studies J. Agric Biol Chem, 1981, 45: 25032508.

28、5董惠钧. 生物防腐剂-聚赖氨酸的初步研究D. 天 津:天津科技大学, 1999.6姜俊云. -聚赖氨酸生产菌株的选育与发酵工艺的研 究D. 天津:天津科技大学, 2004.7童沈阳. 甲基橙在酸性溶液中的变色机理J. 化学通 报, 1980, 160:3239.8Prihardi kahar, Toshiharu Iwata, Jun Hiraki, et al. Enhanc-ement of -PL production by streptomyces albulus strain 410 using pH control J. Journal of Bioscience and Bioeng-ineering, 2001, 91(2:190194.