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学位论文4

单位代码：

10313

学号：

090212中图分类号：

R473.73

硕士学位论文

Toll样受体4在长春瑞滨致静脉内皮损伤中

作用的初步研究

届别：

二○一二届

专业：

护理学

学位类型：

科学学位

研究方向：

血液病护理学

研究生姓名：

钱韦韦

导师姓名：

李振宇副教授高立艳副教授

起止日期：

2010年11月至2012年3月

2012年3月

目录

缩略词表………………………………………………………………………………1

中文摘要………………………………………………………………………………3

英文摘要………………………………………………………………………………5

前言………………………………………………………………………………7

第一部分Toll样受体4在长春瑞滨致小鼠静脉炎组织的表达及意义……………11

材料和方法…………………………………………………………………………11

1材料……………………………………………………………………………11

2方法……………………………………………………………………………12

3结果……………………………………………………………………………16

第二部分Toll样受体4在长春瑞滨致人脐静脉内皮细胞损伤中的作用研究

……………………………………………………………………………17

1材料……………………………………………………………………………17

2方法……………………………………………………………………………22

3结果……………………………………………………………………………27

讨论………………………………………………………………………………29

结论………………………………………………………………………………33

论文图片………………………………………………………………………………34

参考文献………………………………………………………………………………41

综述………………………………………………………………………………47

攻读硕士学位期间发表学术论文题目………………………………………………54

临床培训小结…………………………………………………………………………55

致谢………………………………………………………………………………57

论文声明………………………………………………………………………………59

论文审阅认定书………………………………………………………………………60

缩略词表

Abbreviation

缩略词

英文全称

中文全称

cDNA

compentaryDNA

互补脱氧核糖核酸

DEPC

Diethylpyrocarbonate

焦碳酸二乙酯

EDTA

Ethylenediaminetetra-aceticacid

乙二胺四乙酸

FBS

Fatalbovineserun

胎牛血清

FN

Fibronectin

纤维连接蛋白

GFP

Greenfluorescentprotein

绿色荧光蛋白

HEstain

Hematoxylinandeosinstain

苏木素伊红染色

HUVEC

Humanumbilicalvenousendothelialcells

人脐静脉内皮细胞

IL

Interleukin

白细胞介素

LPS

Lipopolysaccharide

脂多糖

NF-κB

Nuclearfactor-kappaB

核因子-κB

PBS

Phosphatebuffersaline

磷酸盐缓冲液

PCR

Polymerasechainreaction

聚合酶链反应

PPL

Poly-lysine

多聚赖氨酸

PDTC

Ammonium pyrrolidinedithiocarbamate

NF-κB抑制剂/抗氧化剂

rpm

Revolutionsperminute

转∕分

RNA

Ribonucleicacid

核糖核酸

TLR

Toll-1ikereceptor

Toll样受体

TLRs

Toll-1ikereceptors

Toll样受体家族

TLR4

Toll-likereceptor4

Toll样受体4

Tris

Hydroxymethylaminomethane

三羟甲基氨基甲烷

TNF-α

Tumornecrosisfactor-α

肿瘤坏死因子α

TIR

Toll-interleukin1receptorregion

Toll-白细胞介素1受体域

VIN

Vinorelbine

长春瑞滨

Toll样受体4在长春瑞滨致静脉内皮损伤中

作用的初步研究

中文摘要

目的初步探讨Toll样受体4在长春瑞滨致静脉内皮损伤中的作用。

方法1．Toll样受体4在长春瑞滨致小鼠静脉炎组织的表达及意义：

取20只BALB/c小鼠，按随机数字表随机分为2组，每组10只。

实验组按38mg/kg尾静脉注射3.2g/L长春瑞滨；对照组尾静脉注射相同体积的生理盐水。

于给药后48h颈椎脱臼处死小鼠，并取近心端距穿刺点1cm处鼠尾组织，4%多聚甲醛中固定后以0.5mol/LEDTA进行脱钙1周，常规石蜡包埋，切片，苏木精-伊红染色后显微镜下分析。

免疫组织化学染色观察Toll样受体4在小鼠尾静脉血管内皮细胞的表达。

2．Toll样受体4在长春瑞滨致人脐静脉内皮细胞损伤中的作用研究：

取长势良好的HUVEC，接种于FN处理的24孔板或无菌培养瓶中，待细胞生长至融合度为90%-95%时，加入长春瑞滨浓度为0.05ug/ml的EGM-2培养基，共同培养1h后，PBS洗涤，换入新鲜培养基继续培养0、6、12小时。

RT-PCR以及荧光定量PCR检测TLR4的转录情况；WesternBlot检测TLR4蛋白表达情况；免疫荧光检测NF-κBp65的核转位情况。

结果1．注射后48h，实验组小鼠尾静脉血管出现内皮细胞脱落、血栓形成和炎细胞浸润，损伤部位内皮细胞高表达Toll样受体4，对照组小鼠尾静脉血管无明显损伤表现，血管内皮细胞Toll样受体4阴性或弱表达，两组差异有统计学意义（P＜0.05）。

2．0.05ug/ml长春瑞滨干预1h后人脐静脉内皮细胞拉伸，延展，形态不规则，边界不清，排列紊乱，部分细胞悬浮脱落。

洗去长春瑞滨换入新鲜培养基继续培养6h、12h后，细胞形态逐渐恢复正常；荧光定量PCR法检测各组细胞TLR4基因表达水平，结果显示：

与空白对照组相比，各实验组TLR4表达量均升高，差异有统计学意义（P＜0.05），其中干预1h后升高幅度最大；WesternBlot检测各组细胞TLR4蛋白表达水平，结果显示：

与空白对照组相比，各实验组TLR4蛋白表达量均升高，差异有统计学意义（P＜0.05），随着时间的增长TLR4蛋白表达量递增；免疫荧光检测NF-κB的核转位情况，结果显示：

与空白对照组相比，长春瑞滨干预1h后以及洗去长春瑞滨继续培养6h、12h，NF-κB的核转位率明显升高（P＜0.05）。

结论1．小鼠尾部血管推注长春瑞滨可能造成静脉炎，出现程度不同的血管内皮细胞脱落、炎性细胞浸润、血栓形成等病理学改变。

2．小鼠以及HUVEC细胞试验表明在使用长春瑞滨导致药物性静脉炎过程中，内皮细胞TLR4表达增强；3．HUVEC细胞试验表明，VIN刺激上调HUVECTLR4蛋白及其mRNA的表达。

4．HUVEC细胞试验表明，VIN刺激促进HUVECNF-κB的活化及核转位。

5．上述研究表明，TLR4可能在长春瑞滨导致静脉炎发生中发挥着重要作用。

关键词Toll样受体；长春瑞滨；静脉炎；人脐静脉内皮细胞；机制

EffectMechanismofTLR4invascularendothelial

injurythatinducedbyVinorelbine

Abstract

ObjectiveToinvestigatetheeffectmechanismofTLR4invascularendothelialinjurythatinducedbyVinorelbine.

Methods1.20BALB/cmiceweredividedintototwogroups,vinorelbinewasinjectedintheexperimentalgroup.Thesame dose ofsalinewasinjectedinthevehiclecontrolgroup.Micewereeuthanized48hoursaftervinorelbineinjection,andinjectedmousetrailtissuenearthepuncturationsitewasfixedandfurtherevaluatedbypathology.SeverityofphlebitiswasscoredandtheexpressionofTLR4inphlebitistissueswasmeasuredbyimmunohistochemistry.2.Thecells,atadensityof5×104cells/mL,wereseededin25-cm2flasksor24-wellplates.Uponreachingcellconfluenceof90%-95%，thecellswerewashedtwicewithphosphate-bufferedsaline（PBS）,andre-fedwithVINsolutionatthefinalconcentrationof0.05mg/Lintheflasksorwells,Untreatedcontrolcellswerere-fedwithonlymedium.After60minincubationwithVIN,thecellswerewashedtwicewithPBSandre-fedwithmediumwithoutVINandgrownfor0,6or12h.After0,6or12h,cellswerewashedtwicewithPBS,andharvestedforPCR,Westernblotandimmunofluorescenceanalysis.Experimentswererepeatedatleastthreetimes.

Results1.Aftervinorelbineinjection,theveinendotheniacellsweredisrupted,thrombusandinflamatorycellswerefounded,andTLR4waspositiveinendotheniacells.Incontrolgroupmice,theveinendotheniacellswereintactandTLR4expressioninendotheniacellswasnegativeorverylow.2.VIN treated cells stretch,extend, irregular,ill-defined disorder,partofthe cellsuspensionnoff. Washawaythe VIN tocontinuetofoster 6h,12h.The cellmorphology gradually returnedtonormal;ToverifyTLR4mRNAexpressionchangesintheHUVEC,RT-PCRandquantitativerealtimePCRwereperformed.TheTLR4mRNAexpressionlevelsweresignificantlyincreasedintheVIN-treatedHUVEC（P<0.05）,comparedwithvehicle-treatedgroup.TheeffectofVINreachedamaximumatthetimeafterexposure1h;WeperformedwesternblotfortherelativeproteinexpressionofTLR4inHUVECstoassesstheeffectaftertreatmentwithVIN.TheexpressionofTLR4proteininallVIN-treatedgroupswasincreasedsignificantlycomparedwithvehicle-treatedgroup（P<0.05）;NF-κBactivationasdeterminedbyNF-κBphosphorylationwasdetectedatdifferenttimeandwasnolongerdetectableatlatertimepoints.Asexpected,nucleartranslocationofp65occurredinHUVECtreatedwithVIN,andNF-κBactivationoccurredwithinaverynarrowwindowinHUVECduringthecourseofvascularendothelial injury.

Conclusions1.Pathohistologicalchangesofthemodelgroupwereobserved,suchaslossofvenousendothelialcells,inflammatorycellinfiltrationandthrombus.2.mouseandcellexperimentsindicatesthatTLR4expressionisup-regulatedinvascularendothelialinjurythatinducedbyVinorelbine.3.cellexperimentindicatesthatTLR4mRNAandproteinareup-regulatedbyVinorelbineinHUVEC.4.cellexperimentindicatesthatnucleartranslocationofp65occurredinHUVECtreatedwithVIN.5.Tegether,ourresultssuggestthatTLR4mayplayanimportantroleinthedevelopmentofvascularendothelialinjurythatinducedbyVinorelbine.

KeywordsToll-likereceptor;Vinorelbine;Phlebitis;HUVEC;Mechanism

前言

随着工业化的进展、环境污染的加剧，人们的生活节奏越来越快，不良生活习惯及不良饮食的影响，肿瘤的发病率也逐年增高，无论在发达国家还是发展中国家，恶性肿瘤的危害都不容忽视。

静脉输注抗肿瘤药物是治疗恶性肿瘤的主要方法之一，但往往引起严重的毒副反应，除对造血系统及全身重要脏器具有毒性以外，对血管周围组织还可引起严重的炎性刺激反应。

局部组织表现红、肿、热、痛等炎症反应，有时沿静脉走向出现条索状改变，严重者局部组织糜烂、坏死。

肿瘤患者长期放、化疗，机体免疫力低下时，常导致全身感染而危及生命。

长春瑞滨是临床常见的抗肿瘤药物，属于长春花生物碱类药物，它的抗肿瘤活性主要通过干扰微管蛋白而抑制中期有丝分裂，目前主要用于非小细胞肺癌以及其他实体瘤等。

然而在长春瑞滨给病人带来抗肿瘤疗效的同时，它作为中度发疱剂的一种，也常常引起局部毒副反应，局部组织发红，疼痛、肿胀甚至糜烂坏死。

据报道[1]，其致静脉炎的发生率可达24-33%，国内学者报道其发生率甚至可达87%[2]。

虽然这种药物性静脉炎在临床常见，但是其确切机制仍不明确，目前普遍的观点认为药物性静脉炎是由于药物对血管内皮细胞的化学性刺激而引起的无菌性炎症。

药物性静脉炎的形成因素包括药物种类、药液的温度、药液的PH值、药液的渗透压、药物本身的毒性作用、药物引起的变态反应以及药液的输液微粒等。

另外药物性的静脉炎发生还与输入药液的剂量、浓度、输入速度、时间以及输注方法等有关[2-28]。

抗生素和抗肿瘤药物导致的静脉炎的发生率最高[29-30]，抗肿瘤药物中以长春瑞滨最为严重。

尽管临床工作者采取了许多防范措施，例如给药部位热敷、冷敷的方法，以及局部给予糖皮质激素、非甾体抗炎药、抗组胺药、血管扩张剂、局部麻醉药、抗凝药、溶栓药甚至活血化瘀类中药等，但遗憾的是由于缺乏相应的基础研究支持，使得这些措施针对性不强，临床效果不明显，这种由药物自身因素引起的静脉炎并未得到改善。

近年来有关静脉炎的基础研究主要是针对抗生素类药物的。

目前国内外资料尚缺乏对化疗药物，特别是长春碱类化疗药物所致静脉炎的基础研究，化疗药物所致静脉炎的基础研究也仅局限于动物病理学水平，深入的机制研究鲜见报道，由此可见，深入研究药物静脉炎发病机制的需求非常迫切，在此基础上寻找临床上更为特异和有效的预防或治疗药物，对提高合理用药水平，减少药源性疾病损害，改善患者的生活质量具有重要的理论和实际意义。

国外学者研究[31-32]表明血管内皮细胞在一定浓度的高细胞毒性的抗生素的刺激下，细胞间黏附分子1（intercellularadhesionmolecule-1，ICAM-1）、E-选择素（E-selectin）等黏附分子的表达增高，而这些细胞间相互作用相关的细胞表面标记物的表达，可能是药物性静脉炎重要的发生机制。

那么临床常见的长春瑞滨所致的静脉炎中是否也存在这些细胞因子的表达变化？

亦或存在其他炎症相关细胞因子的表达呢？

Toll样受体（Toll-likereceptor,TLR）是一类介导天然免疫的跨膜信号传递受体家族，在细胞活化信号的转导中起重要作用，是联系天然免疫与获得性免疫的桥梁[33]。

被认为是目前哺乳动物唯一将细胞外抗原识别信息向细胞内传递并引发炎症反应的关键跨膜蛋白[34]。

哺乳动物中已发现至少13种TLR和一系列TLR配体，其中人TLR为TLR1～10，它们分别在不同的免疫应答机制中扮演各自的重要角色。

免疫细胞通过其表面的Toll样受体家族（Toll-likereceptors,TLRs）识别病原微生物启动天然免疫反应。

各种不同的病原体，包括革兰阳性菌、革兰阴性菌、真菌、病毒和衣原体均可以被TLRs识别。

在天然免疫过程中，TLRs捕获病原体上相应配体，启动细胞内信号途径，导致一系列酶的激活、核因子-κB（nuclearfactor-κB，NF-κB）途径活化及炎症因子的释放。

TLR4在该受体家族中最早被发现，定位于人染色体9q32-q33上，组织分布较广泛，见于血管内皮细胞、单核细胞、中性粒细胞、树突细胞、小肠上皮细胞、呼吸道上皮细胞、人齿龈成纤维细胞、人子宫颈平滑肌细胞、大鼠脾和心肌细胞等，主要功能是作为脂多糖（lipopolysaccharides，LPS）的信号转导受体，在宿主的防御反应中发挥重要作用[35-36]。

TLR4主要识别革兰阴性菌成份LPS，LPS通过激活宿主细胞膜上的CD14和TLR4受体，进一步活化NF-кB，使单核和巨噬细胞产生IL-21、6、8和肿瘤坏死因子α（Tumornecrosisfactor-α，TNF-α），趋化炎性细胞浸润，诱发炎症，刺激树突状细胞成熟，启动先天和后天免疫。

研究表明，TLR4不仅通过识别革兰氏阴性菌的LPS启动细胞内信号转导，同时也识别结核分枝杆菌、烟曲菌、新型隐球菌和白色念珠菌等其他微生物的病原相关分子模式[37]。

大量研究已证实TLR4在败血症、脓毒症、肠炎、阑尾炎、胰腺炎等感染性炎症反应中都发挥了重要作用。

越来越多的证据显示，即使没有感染存在，内源性配体也可以刺激TLR4并引发免疫反应[38]。

为区别微生物来源的外源性分子（如LPS等），将其命名为TLRs的内源性配体。

目前发现TLR4可以识别多种内源性配体，如透明质酸、硫酸肝素、纤维蛋白素原、高迁移率族蛋白1和热休克蛋白等。

研究发现除了外源性配体以外,内源性分子，比如热休克蛋白60（HSP60）、纤维结合素、纤维蛋白原和透明质烷低聚糖也能够通过TLR4诱导促炎细胞因子的产生[39]。

另一项研究也表明，某些创伤和手术等引起的全身炎症反应综合症和远离组织器官损伤时，循环中并未检测到细菌和内毒素，而应用TLR4阻断剂可明显减轻炎症反应和组织损伤，因此可能不是内毒素，而是内源性配体激活了TLR4[40]。

机体受到刺激时，体内某些内源性分子能从激活的免疫细胞、肠上皮细胞主动分泌或者从坏死或损伤的细胞中被动释放出来。

这些内源性分子可被TLR4识别并结合，进一步诱导单核-巨噬细胞系统及树突状细胞的活化和成熟，促进炎症因子的释放[41]。

以上研究均表明TLR4在非感染性免疫炎症反应中也发挥了重要作用。

虽然迄今尚无TLR4参与药物性静脉炎形成的相关报道，目前也尚不知道TLR4是否参加了VIN引发组织损伤的信号转导。

但是基于药物性静脉炎的本质是由于药物对血管内皮细胞的刺激而引起的一种化学性炎症反应，而TLR4不仅可启动机体抗感染性免疫炎症反应，它还在非感染性免疫炎症反应的介导和信号转导中发挥重要作用[42-46]。

我们提出如下设想：

TLR4在长春瑞滨致静脉炎过程中发挥着重要作用。

长春瑞滨致静脉炎的可能机制是：

长春瑞滨刺激血管内皮细胞膜上的TLR4受体后，导致NF-κB信号转导途经被激活，内皮细胞被活化；活化的内皮细胞与其配体结合，从而与白细胞黏附，导致内皮损伤和白细胞渗出，激发炎症过程，并继而通过一系列反应激活血小板聚集与血栓形成过程。

为验证上述假设，本研究拟选择临床反应强烈、具有一定代表性的长春碱类药物长春瑞滨为研究对象，通过体内体外实验观察VIN对小鼠尾静脉血管内皮细胞以及人脐静脉内皮细胞（Humanumbilicalvenousendothelialcells，HUVEC）TLR4表达及下游NF-κB活化的影响，初步探讨TLR4在VIN损伤血管中的作用。

本课题采用动物组织病理学及细胞形态学明确长春瑞滨对血管内皮细胞的损伤作用；分别采用动物和细胞的免疫组织化学、荧光定量PCR、Western-blot