常用实验方法和所需试剂的配制.docx

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常用实验方法和所需试剂的配制

（一）Western-blot实验

1.Westernblot主要实验试剂

溴酚蓝（BromphenolBlue）

丽春红（PonceauS）

考马斯亮蓝（CoomassiebrilliantblueR-250）

吐温-20（Tween-20）

β-巯基乙醇（β-Mercaptoethanol）

十二烷基硫酸钠（SDS）

过硫酸铵（APS）

TEMED

聚丙烯酰胺凝胶单体贮备溶液

4×浓缩胶缓冲液

4×浓缩胶缓冲液

甘氨酸

Tris碱

脱脂奶粉

牛血清白蛋白（BSA）

硝酸纤维素膜（NC膜）

蛋白质Marker和预染Marker

通用蛋白裂解/提取试剂

BCA法蛋白定量试剂盒

Bradford法蛋白定量试剂盒

兔源性抗抗体

辣根过氧化物酶标记羊抗兔IgG

ECL超敏发光液

定影液、显影液、X光胶片曝光盒

其他试剂（乙醇、甲醇、冰醋酸、二甲苯、戊二醛等）

2.Western-blot主要实验试剂的配制方法

（1）10%SDS溶液:

SDS粉末1g,加双蒸水10mL使其溶解，室温保存。

（2）10%APS：

APS20mg,加双蒸水200μL,混匀，现配现用。

（3）10×电极缓冲液（PH8.3）:

SDS粉末10g、Tris碱30.4g、甘氨酸144g，双蒸水定溶至1000mL，4℃保存，用时10倍稀释。

（4）考马斯亮蓝固定液：

乙醇500mL、冰醋酸10mL、双蒸水定溶至1000mL。

（5）考马斯亮蓝脱色溶液：

95%乙醇250mL、冰醋酸80mL，双蒸水定溶至1000mL。

（6）考马斯亮蓝染色溶液：

0.29g考马斯亮蓝,溶解于250mL脱色液中，过滤后室温保存。

（7）转移缓冲液：

甘氨酸2.93g、Tris碱5.812g、甲醇200mL、去离子水定溶至1000mL，4℃保存。

（8）10×TBS溶液：

Nacl87.75g、Tris碱12.1g，用双蒸水溶至1000mL，4℃保存，用时10倍稀释。

（9）TBST溶液：

1×TBS溶液1000mL、Tween-20溶液1mL，混匀。

（9）丽春红溶液：

100g丽春红,5mL冰醋酸，双蒸水定溶至100mL，室温保存。

（11）5×上样缓冲液：

1mol/LTris-HCl（pH6.8）0.6mL、甘油2.5mL、10%SDS溶液2mL、β-巯基乙醇（使用前加）0.5mL、1%溴酚蓝溶液1mL，去离子水定溶至10mL，4℃保存。

（12）12%分离胶：

聚丙烯酰胺单体贮备液3.2mL、4×分离胶缓冲液0.5mL、10%SDS溶液80μL、10%APS溶液25μL、TEMED原液10μL、双蒸水溶至8mL。

（13）5%浓缩胶：

聚丙烯酰胺单体贮备液0.68mL、4×浓缩胶贮备液0.25mL、10%SDS溶液40μL、10%APS溶液15μL、TEMED原液5μL、双蒸水溶至4mL。

（14）NC膜封闭液：

脱脂奶粉1g，TBST溶液20mL中溶解，4℃保存。

（15）抗体稀释液：

TBST溶液20mL、小牛血清白蛋白1g，混匀，4℃保存。

（16）StripingBuffer：

β-巯基乙醇35μL、10%SDS溶液1mL、0.5MTris溶液（pH6.7）625μL，去离子水定溶至5mL，室温保存。

3.Western-blot实验步骤

（1）总蛋白的提取（采用北京普利莱公司蛋白质抽提试剂盒抽提）

电子天平精确称取组织50mg（±2mg），放入含有1mL细胞裂解液和适量的PMSF（终浓度为1mmoL/mL）的预冷玻璃匀浆器内，冰上匀浆。

取0.5mL匀浆液移入新的2mLEP管内，加1mL蛋白抽提试剂并混匀，静置10min后（偶有颠倒混匀），12000g4℃离心10min。

弃去上清保留蛋白质膜，加2%SDS溶液500μL，100℃水浴10min，4℃放置2小时使蛋白质膜充分溶解。

（2）总蛋白浓度的测定（BCA法）

配制统一的蛋白质标准品：

以牛血清白蛋白（bovineserumalbumin，BSA）的标准品溶液（浓度为1mg/mL）制作蛋白质标准曲线。

分别吸取BSA标准品溶液0、100、200、400、800、1200、1600和2000μL，各自加入0.01MPBS溶液补足到2000μL，配成梯度浓度的标准品溶液，分装后-20℃备用。

配制BCA工作液：

按50：

1的比例将BCA试剂盒内的A试剂与B试剂进行混合，配成BCA工作液。

室温保存，1d内使用。

样品处理：

取各样品10μL，加0.01MPBS溶液490μL，配成待测样品。

加样：

先于酶标板上样孔内加入200μLBCA工作液，再分别加入倍比稀释的标准品及待测样品各20μL，酶标仪上震荡3min，充分混匀。

测定：

将酶标板置于恒温水浴箱中，37℃孵育30min。

用MRK3型酶标仪测定562nm波长下各孔吸光度值（opticaldensity，OD），采用Softmax5.2软件计算各样本蛋白质浓度。

（3）样品浓度的配平和制备

配平：

按测定的各样品蛋白质浓度，用2%SDS溶液配平各样品总蛋白浓度。

根据预实验结果，将组织的总蛋白浓度调为1mg/mL。

制备：

将配平后的样品与5×上样缓冲液按4：

1的比例混合。

100℃水浴10min，部分4℃保存用于电泳，部分-20℃保存备用。

（4）样品内蛋白含量的检测

凝胶的配制：

配制12%分离胶和5%浓缩胶（配制方法见附录）。

上样：

分别用Eppendorf微量移液器吸取蛋白质Marker或样品各10μL，将枪尖的插入加样孔的底部，缓慢地将样品或Marker加入加样孔，避免有气泡产生。

电泳：

浓缩胶：

电压100V、电流400mA，电泳20min；分离胶：

120V，400mA，电泳50min，待溴酚蓝到达凝胶底部，关闭电源。

蛋白质转膜：

恒压转移，转膜参数：

电压100V，电流350mA，转移23min。

结束后，将硝酸纤维素膜（nitrocellulose，NC膜）于丽春红染液中染色10min，可见清晰的红色条带，表明转膜成功。

去离子水冲洗，根据蛋白质Marker的位置将含有目的蛋白的膜条带上下各0.5cm）裁下。

封闭：

把NC膜置于封闭液内室温封闭4h（摇床上进行），TBST液洗膜2min×3次。

免疫反应：

将封闭好的膜置于一抗溶液中4℃孵育过夜，TBST溶液洗3min×5次后，NC膜再于辣根过氧化物酶标记羊抗兔IgG溶液中孵4℃育1h，用TBST溶液洗膜3min×5次。

以上步骤均在摇床上进行。

曝光：

将ECL超敏发光液中的A液和B液按1：

1比例混合后滴于NC膜上，暗室内曝光30s，X-光片在显影液中显影2min，定影液中定影5min。

分析结果：

将NC膜上肌动蛋白染色条带结果扫描后输入电脑，IPP5.0图像分析系统分析结果。

（二）免疫组化（荧光）染色实验

1.免疫组化（荧光）染色主要实验试剂

防脱片剂

一抗抗体

免疫组化试剂盒（SP或SABC）

DAB试剂盒

罗丹明标记的羊抗兔IgG

组织自身荧光淬灭剂

其他试剂（乙醇、甲醇、冰醋酸、二甲苯、戊二醛等）均为国产分析纯

2.常用试剂的配制

（1）0.01MPBS溶液：

中衫公司的PBS粉末一包，加蒸馏水2000mL，混匀，室温保存。

（2）4%多聚甲醛溶液：

500ml0.01MPBS液加40g多聚甲醛在2000ml的烧杯内加热至60℃，边搅拌边加热，至溶液呈澄清，另加500ml0.01MPBS液至1000ml。

冷却后过滤，4℃冰箱保存备用。

（3）苏木素：

（4）伊红：

3.HE染色方法

（1）二甲苯

脱蜡10min

（2）二甲苯

、

脱蜡各5min

（3）无水乙醇洗1min×2次

（4）95％酒精1min

（5）90％酒精1min

（6）85％酒精1min

（7）自来水洗2min

（8）苏木素染色1～5min

（9）自来水洗1min

（10）1％盐酸酒精分化20s

（11）自来水洗1min

（12）稀氨水（1％）反蓝30s

（13）自来水洗或蒸馏水洗1min

（14）伊红染色20s～5min

（15）自来水洗30s

（16）85％酒精脱水20s

（17）90％酒精30s

（18）95％酒精1min

（19）95％酒精1min

（20）无水乙醇2min

（21）无水乙醇2min

（22）二甲苯

、

、

透明各5min

（23）中性树胶封片

4.免疫组化染色

（1）制作切片：

组织切片的制作、切片脱蜡、脱水过程按HE染色步骤进行；

（2）抗原修复：

0.01M的枸橼酸缓冲液内、中火微波修复15min，冷却至室温后，PBS溶液洗3min×3次；

（3）封闭：

封闭液室温封闭30min，弃去封闭液，不洗；

（4）免疫反应：

滴加一抗抗体，4℃孵育过夜（保湿盒内进行），PBS溶液洗切片3min×5次后，滴加二抗，室温4℃孵育30min，PBS溶液洗切片3min×5次；滴加DAB试剂、显色。

显微镜观察切片，蒸馏水终止显色反应。

脱水、透明、封片。

（5）观察：

每张切片随机选5个视野，扫描记录，并采用IPP5.0图像分析软件分析图像。

5.免疫荧光染色

（1）制作切片：

组织切片的制作、切片脱蜡、脱水过程按HE染色步骤进行；

（2）抗原修复：

0.01M的枸橼酸缓冲液内、中火微波修复15min，冷却至室温后，PBS溶液洗3min×3次；

（3）封闭：

封闭液室温封闭30min，弃去封闭液，不洗；

（4）免疫反应：

滴加一抗抗体，4℃孵育过夜（保湿盒内进行），PBS溶液洗切片3min×5次后，滴加罗丹明标记IgG，室温避光4℃孵育30min，PBS溶液洗切片3min×5次；滴加组织自发荧光淬灭剂，室温孵育30min，PBS溶液洗3min×3次；滴加抗荧光淬灭封片剂封片，4℃避光保存。

（5）观察：

荧光显微镜观察切片，每张切片随机选5个视野，扫描记录，并采用IPP5.0图像分析软件分析图像。

（三）RT-PCR实验

1.RT-PCR主要实验试剂

TRIzolReagent

DEPC

OneStepRNAPCRKit（AMV）

DNAMarker

琼脂糖

Tris

MOPS

MGP试剂

去离子甲酞胺

去离子甲醛

其他试剂（乙醇、甲醇、冰醋酸、二甲苯、戊二醛等）均为国产分析纯

2.常用试剂的配制

（1）DEPC水（v/v）：

在1000ml去离子水中加入DEPC1ml，37℃充分振荡过夜，高压灭菌。

浸泡实验器具的DEPC水：

在1000m去离子水中加入DEPC1ml，充分振荡后即可使用。

（2）75%乙醇（DEPC水配制）:

无水乙醉375ml，加入DEPC水定容至500ml。

（3）0.5MEDAT（pH8.0）:

EDAT-2Na186.1g，加DEPC水至800ml，充分搅拌。

用NaOH约20g调pH至8.0，用DEPC水定容至1000ml。

高温高压灭菌后分装,室温保存。

（4）1×Tri-HCl（pH8.0）:

Tris121.1g，加DEPC水800ml搅拌溶解后，用浓HCl约42ml调pH至8.0，用DEPC水定容至1000ml。

高温高压灭菌后分装，室温保存"

（5）10×TE（pH8.0）:

100mMTris-HCI（pH8.0）,1mMEDAT（pH8.0）,加800mlDEPC

水混合均匀后定容至IL。

高温高压灭菌后分装,室温保存。

（6）EB染液（200μg/μl）I:

澳化乙锭2.0mg，,加DEPC水至10ml,充分搅拌数小时完全溶解后室温避光保存。

（7）1MM乙酸钠:

68g乙酸钠,加DEPC水400ml，搅拌,用DEPC水定容至500ml。

（8）10×MOPS电泳缓冲液:

41.8gMOPS溶解于700ml灭菌的DEPC水中,用2M的NaOH调整到pH7.0,加20ml乙酸钠和20mlMEDAT（pH8.0）,用DEPC水调整到1L,避光保存。

（9）10×甲醛变性琼脂糖凝胶：

加1.5g琼脂糖到72ml灭菌去离子水中，煮沸溶解琼脂糖，将溶液冷却到55℃同时加入10ml10xMOPS电泳缓冲液和18ml去离子甲醛后灌胶。

（10）10×甲醛凝胶缓冲液：

甘油5ml,25mg固体澳酚蓝,25mg二甲苯青FF,10mMEDAT（PH8.0）5ml定容至10m。

（11）1.5%琼脂糖凝胶：

琼脂糖1.5g，加入100mll×TBE电泳缓冲液P（H8.3）后在微波炉内加热溶解，冷却至55℃左右加入EB染液（终浓度0.5μg/μl）充分混匀后灌胶。

（12）5×TBE电泳缓冲液（pH8.3）:

54gTris碱，27.59硼酸，20ml0.5MEDAT（pH8.0）,定容至1L。

（13）6×凝胶载样缓冲液：

0.25%嗅酚蓝（m/v）、0.25%二甲苯青（m/V）,30%甘油水溶液，4℃保存。

3.RNA提取方法

（1）组织取出后立刻至于液氮中。

（2）脑组织称取后在液氮存在下研磨3次成粉末状（需要磨成非常细的粉末,否则抽提效率会降低）。

（3）待液氮挥发干，立即加入TRIzol，每100mg组织加1mlTRIzol，用加样枪吹吸，使样品充分裂解，移入1.5mlEP管中，静止5min，以使核酸蛋白复合体完全分离。

（4）在EP管中加200μL氯仿，剧烈振荡15秒，静置5min。

（5）将EP管在4℃12000g，离心15min，离心后混合物分离成一个较低的红色苯酚-氯仿的有机相，一个中间相和一个无色的上层的水相。

（6）用移液器小心吸出上层水相（不要吸取中间白色的中间层）300ml，加入另一EP管中。

（7）加入500μL预冷过的异丙醇，振荡混匀。

-20℃沉淀过夜。

（8）4℃12000g，离心15min，此时在EP管中常常能看到白色沉淀，小自移出

上清。

（9）沉淀中加入lml预冷过的75%乙醇，振荡混匀后4℃7500g，离心5min。

（10）重复用75%乙醇洗涤RNA沉淀一次。

（11）去上清，RNA沉淀于空气干燥5-10min，,加入DEPC水充分济解（难溶时可在55-60℃孵育10min助溶。

4.RNA定量检测

（1）提取适量总RNA用1×xTE稀释200倍，以1xTE作为空白对照。

（2）分别测定在260nm和280nm处的吸光值，纯RNA的OD260/OD280比值应接近2.0（比值最好在1.7-2.0之间）。

（3）在260nm处的吸光度，1OD=40μg/mlNRA。

浓度计算公式如下：

A260光密度值×40×稀释倍数/1000=μg/μlRNA。

5、琼脂糖变性凝胶电泳质检RNA

（1）在EP管内建立变性反应:

对照组总RNA（约5μg）2.0μl

10×MOPS电泳缓冲液2.0μl

去离子甲醛4.0μl

去离子甲酰胺10.0μl

澳化乙锭（200μg/μl）1.0μl

（2）将EP管置于水浴恒温器中65℃温育5min，取出立刻置丁冰上10min，然后离心5s，将所有液体沉淀到EP管内底部。

（3）加2.0μl10×甲醛凝胶缓冲液并重新置于冰上。

（4）将1.5%甲醛变性琼脂糖凝胶放入水平电泳槽内，加入足量1×MOPS电泳缓冲液覆盖凝胶约lmm，加RNA样品到凝胶加样孔中。

（5）5V/cm电压下电泳，直到溴酚蓝移出约8厘米，由于电泳过程中电泳缓冲液的pH值会发生变化，需每小时人工转变缓冲液。

（6）紫外线下观察，拍照。

提取质量较好RNA电泳结果为5s、18s和28s三条带清晰，没有明显的降解，28sRNA条带是18sRNA条带亮度的两倍。

6、RT-PCR反应

（1）按照试剂盒说明书加入试剂。

（2）RT-PCR反应。

（3）反应结束后，取PCR反应液各5μl进行1.5%琼脂糖凝胶（含EB）电泳。

（4）5V/em电压下电泳40min。

（5）紫外线下观察，拍照。

（四）ElISA实验

1.RT-PCR主要实验试剂

2.ElISA操作步骤

（1）取右心血液,在4℃下2000r/min离心10min,取上层血清。

（2）取出ELISA试剂盒平衡至室温。

（3）取出反应板每孔分别加入20μl标准品、20μl血清于反应板孔中。

（4）每孔加入100μlZeroBuffer,轻轻混匀30秒,室温温育30min。

（5）洗板:

甩尽板内液体,用蒸馏水或者洗涤液洗涤反应板,并去除水滴（在厚叠吸水纸上拍干）,这样反复洗涤5次。

（6）每孔加入150ul酶联物（Reagent）,轻轻混匀10秒,室温温育30min。

（7）洗板：

与步骤5相同。

（8）每孔加入IO0μlTMB显色液，轻轻混匀10秒钟，置暗处室温温育20min。

（9）每孔加入50μl终止液（stopsolution），轻轻混匀30s；确定兰色变为黄色（重要），30min内在45Onm处读OD值。

（10）以OD值为纵坐标，以标准品浓度为横坐标，绘制标准曲线。

根据豚鼠血清样品的OD值可在标准曲线上查出其浓度。

（五）原位杂交实验

1.原位杂交实验所需试剂

TriS

曲拉通X-100

吐温-20

DEPC

mRNA原位杂交试剂盒及专用盖玻片

原位杂交寡核昔酸探针

2.原位杂交所需试剂的配制方法

（1）DEPC水：

在1000ml去离子水中加入DEPC1ml，37℃下充分振荡过夜，高温高压灭菌，浸泡实验器具的DEPC水：

在1000ml去离子水中加入DEPC1ml而，充分振荡后即可使用。

（2）组织细胞打孔液：

DEPC处理的构椽酸缓冲液（0.01mol）99.5ml,加入曲拉通X-1000.5ml，混匀即可。

（3）DEPC处理的PBS缓冲液：

1000mlPBS缓冲液（0.01mol）中加入DEPC1ml，

荡过夜，高温高压灭菌。

（4）0.1molTBS:

8.5gNaCI、l.2gTris用DEPC处理的去离子水定容至I000ml,混匀,用乙酸调pH至7.5。

（5）过氧化氢封闭液:

市售30%的过氧化氢10ml，加DEPC处理的PBS缓冲液定容至100ml,此液现用现配。

（6）4%多聚甲醛:

4g多聚甲醛溶于DEPC处理的双蒸水100ml中,50℃加热搅拌，滴加IN氢氧化钠直至白色的多聚甲醛完全溶解，3号定性滤纸过滤备用。

（7）20×SSC缓冲液的配制：

氯化钠175.3g、柠檬酸三钠88.2g加DEPC处理的去离子水混合均匀后定容至1L。

2×SSC、0.2×SSC依次稀释10倍。

3.原位杂交实验步骤

（1）取组织，于DEPC处理的4%多聚甲醛中固定2h，15%蔗糖（4℃）脱水1天,冰冻切片12μm。

（2）原位杂交合成探针（8μg/ml,地高辛标记）

（3）切片丙酮中浸泡10min，DEPC处理的PBS（0.01M,pH7.4）冲洗3min。

（4）置打孔液中室温10分钟，以改变组织细胞的通透性使探针快速顺利地穿透细胞膜，0.01MPBS冲洗3次,每次3min。

（5）加过氧化氢封闭液室温20分钟，以封闭内源性过氧化氢酶，0.01MPBS冲洗3min。

（6）滴加复合消化工作液覆盖组织表面，4℃20min，0.01MPBS冲洗3次，0.2×

SSC冲洗一次（室温3min）。

（7）滴加预杂交工作液（25μl/张）覆盖组织，37℃孵育盒孵育过夜。

（8）预杂交后，揭去盖玻片，以0.2×SSC37℃洗3次,每次5min。

以上步骤所

用洗液均经DEPC处理。

（9）滴加杂交工作液（25μl/张）覆盖组织，37℃孵育盒孵育6h。

（10）揭去盖玻片以2×SSC37℃洗3次,每次5min；0.2×SSC37℃洗3次,每次5min；0.lmolTBS37℃洗4次,每次5分钟。

（11）滴加小鼠抗地高辛生物素标记的抗体工作液，37℃孵育30min，0.0lMPBS

冲洗3次,每次5min。

（12）滴加高敏过氧化物酶链亲和素复合工作液，37℃孵育30min，0.0lMPBS冲洗3次,每次5min。

（13）DAB显色，光镜下观察，当细胞浆内阳性颜色与细胞外背景色对比度反差明显时，蒸馏水洗终止反应。

胞浆显棕黄色颗粒为阳性反应。

80%酒精-90%酒精-无水乙醇-二甲苯脱水,每步4分钟,中性树胶封片，4℃保存。

或（13）滴加高敏荧光链亲和素复合物（FITC）工作液，4℃湿盒孵育2h。

0.01MPBS冲洗，5min×3次。

甘油封片。