二蛇伤的免疫学诊断.docx

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二蛇伤的免疫学诊断

（二）蛇伤的免疫学诊断

李云龙教授在研究新的蛇伤免疫学快速诊断方法

蛇伤的诊断，目前国内外普遍是根据咬伤时临床症状或捕获的蛇来确诊，但由于大多数的蛇伤是在晚间或山林草地中发生的，有时看不到蛇或看不清蛇种。

据国内外统计，只有20%左右的蛇伤病人能确定蛇种[1]。

这样只能根据被咬的牙痕、局部体征以及常规化验等进行诊断。

但在蛇伤早期，临床症状往往不明显、不典型，所以很难确诊，以至延误病人的治疗，失去及时抢救的良机。

因此，必须寻求一种快速、准确、敏感、简便的蛇伤化验诊断方法。

1．蛇伤的免疫学诊断研究进展

多年来，免疫学家们根据抗原抗体反应的原理，应用免疫学技术．检测病人标本中各种毒蛇的种特异性蛇毒成分，进行致伤蛇种的各种免疫学诊断方法的研究．随着现代免疫学技术的不断发展，蛇伤免疫诊断的迫切性，今天已成为可能性。

并在技术上逐渐取得了重大的进展和突破，早在五十年代末就有人提出这个问题。

但是它的主要研究进展还是在上世纪和八十年代后。

蛇伤的免疫诊断发展大致可分成3个阶段。

（1）免疫学诊断的出现期

1957年Muelling等[2]应用环状沉淀反应及双向琼脂扩散法论证了一个被眼镜蛇咬伤8h的17岁女孩组织中的眼镜蛇毒，首先提出了蛇伤的免疫诊断问题．Trethewie等[3]于1969年报告了他们成功地用凝胶免疫扩散法从豚鼠咬伤部位的盐水浸出液中检出了虎蛇毒和蝮蛇（Adder）毒。

1974年Greenwood等[4]应用免疫扩散和对流免疫电泳等法检测蛇伤中毒病人伤口吸出液、水泡液、血清和尿液中蛇毒的种特异性成分，进行蛇伤的致伤蛇种免疫诊断的研究。

在101例蛇毒中毒的病人（75例已见蛇种，26例蛇伤不明）免疫扩散的检查中，40例被捡出（检出率约40％）。

特别是膨身蛇（Puff）。

黑颈眼镜蛇（NajaNigricollis）即非洲喷唾沫眼镜蛇（Africumspittingcobra）的咬伤的诊断特别成功（全部检出）。

其中伤口吸出液的检出率为27／74，水泡液为9／13，血清为0／84,浓缩尿为19／76。

在不明蛇种的26例中也检出11例（其中眼镜蛇伤7例，膨身蛇伤2例，蝰蛇伤2例）并对44例阳性标本用对流免疫电泳法[5]复查，结果40例仍为阳性。

并且多数可在30min内得出结果。

因此，他们正式提出了蛇伤免疫诊断的可能性。

并认为对流免疫电泳法有希望作为蛇伤快速诊断的常规方法。

至此，蛇伤的免疫学诊断才真正问世。

引起了各国学者们的重视和研究。

李云龙等也曾用此法检测过实验性蛇伤动物[6]和79例早期蛇伤病人的咬伤局部吸出液,获得了较为满意的结果[7]。

但是，此法的敏感度不够理想，阳性检出率受检材的种类、取材的时间、方法、诊断抗体的质量等因素影响较大，所以要通过更特异的抗体和应用更敏感的免疫检测方法，才能解决蛇伤的免疫诊断问题。

（2）蛇伤免疫诊断敏感度的发展期

七十年代初，由于免疫学技术的水平限制，使免疫诊断在蛇伤中的应用受到了影响。

为了提高蛇伤免疫诊断的敏感度，必须采用高敏感的免疫检测方法，才能使蛇伤的免疫诊断得到提高。

因此，免疫诊断提出后，当时相继就出现了血凝、放射免疫测定（RIA）和酶联免疫吸附测定（ELISA）等敏感度较高的方法用于蛇伤的诊断。

1968年，Boche和Russell[8]应用a-重氮联苯胺法将响尾蛇（C.Viridisheller）毒致敏绵羊红细胞进行被动血凝试验和血凝抑制试验测定高稀释度的蛇毒抗体和蛇毒抗原，敏感度比对流免疫电泳高的多。

但此法结合物不稳定，滴定终点不清楚，试剂必须保存于冷处等缺点。

1974年Greenwood等又应用双抗体法放射免疫测定（RIA）进行蛇伤的诊断[9]，测出了毫微克量级（1ng／ml）的毒蛇，大大提高了检测的敏感度，但此法易发生非特异性反应和正常血清的抑制现象。

另一个缺点是检出时间太长（24～48小时）。

得不到快速诊断的目的。

后来Coulter等（1974）[10]Sutherland等（1975）[11]又应用固相夹心法放射免疫测定对蛇伤病的蛇毒人的血清，尿液，组织液中的检测研究。

不仅敏感度高，还可作蛇毒的定性定量分析。

而且缩短了检测时间（十几小时可得出结果）。

随后，Pukrittayakammee等[12]用McAbMp2作竞争RIA测定蛇伤病人体液中的蝰蛇（Daboiarusselli）毒。

其敏感度：

尿：

4ng/ml，血清：

5μg/ml。

但在不同蛇毒之间有交叉反应。

从此使蛇伤的免疫诊断进入了高敏感度水平，大大扩大了该免疫诊断的应用范围。

放射免疫测定的缺点是：

设备昂贵，试剂对人体有害，检测时间仍较长，还不能适应快速诊断的要求，也不易普及。

也不能在野外现场使用。

为了探索另一种高敏感度方法。

1977年，Theakston等[13]以双抗体夹心法酶联接免疫吸附测定（ELISA）进行实验动物和蛇伤病人的蛇毒和蛇毒抗体的定性定量的研究，其敏感度达到了RIA的水平，从实验动物血清中可测定1～5ng/ml的蛇毒，而设备和方法比RIA简单，检测时间也缩短到8～10小时。

此法基本原理和程序：

检测蛇毒

①特异性蛇毒Ig包盖聚苯乙酰平板孔，37℃，5小时，水洗．

②孔中加被测血清（含蛇毒），4℃过夜、水洗。

③加碱性磷酸酶（或辣根过氧化物酶）标记的蛇毒IgG37℃，孵育4小时，水洗。

④加底物，作用20～60分钟，用碱终止反应。

比色。

检测蛇毒抗体.

应用间接法、用蛇毒包盖平板孔，酶抗体是酶同抗人Ig（如测兔抗体则同抗免Ig结合物），其他过程基本同上。

由于这一时期一些高敏感免疫检测技术的出现使蛇伤诊断的敏感度得到很大的提高，成为蛇伤免疫学诊断的一个转折点。

但是，这些方法的时间还较长，或易出现交叉反应。

还不能适应农村和野外现场使用。

（3）蛇伤免疫诊断的高敏感度、快速、简便发展阶段

从上世纪八、九十年代以来，由于免疫学和免疫学技术不断发展，蛇伤的蛇种免疫学检测技术已发展了多种方法，主要适用的有放射免疫测定、凝集反应、酶联免疫吸附测定和荧光免疫测定等。

这些技术皆具有一定的敏感度，一般可达到10-7～10-9g/ml，其中ELISA可达到微微克（Pg）量级水平。

由于蛇毒McAb和亲和纯化特异性蛇毒抗体等的应用和方法的改进使某些蛇伤诊断方法，特别是ELISA向着高敏感度，高特异性、快速性和简便性方面大大发展了一步，出现了一些适合蛇伤早期快速诊断、测定蛇毒中毒量和追溯诊断不同要求的好方法。

为了提高简便的凝集反应在蛇伤早期快速诊断上的应用，1991年Chinonavanig等[14]用A蛋白纯化的兔抗蛇毒IgG致敏的胶乳建立反向胶乳凝集反应诊断泰国常见的眼镜蛇、金环蛇、眼镜王蛇等6种蛇毒。

敏感度为159～1221ng/ml，可在40min内得出结果，对蛇伤病人血清的检出阳性率为52.5%，此致敏胶乳稳定，在一般浓度下不出现交叉反应。

以后Kittigul和Ratanabanangkoon（1993）[15]用同样方法致敏3种（绵羊、人和鸡）血球，作反向被动血凝试验测定泰国6种毒蛇毒，其敏感度为2～635ng/ml，1～2h能得出结果。

此法费用低廉、快速、操作简便，可以在发展中国家农村医疗单位应用。

近20年来围绕着简化ELISA的方法，缩短检测时间，提高特异性方面做了大量的研究。

1980年Coulter等〔1〕应用夹心法酶免疫分析（ElA）检测蛇毒，不仅保持了高敏感度（0.5～2ng／ml蛇毒），并能在30～90分钟内得出结果。

此法和ELISA检测抗原（蛇毒）主要区别是：

大大缩短了每个孵育时间（37℃水浴只需5～30分钟）。

为了避免辣根过氧化物酶，碱性磷酸酶等作酶标时机体内源酶的干扰，1982年Chandler等[16]应用尿素酶作酶标，尿素作底物，用PH指示剂（溴甲酚紫）显色，肉眼可以直接判断结果．此法特别适合组织内的抗原定性检查以及测定细胞协同抗原及其抗体．此酶价格便宜．不被叠氮钠所抑制。

底物较稳定而无毒等特点，是一个较好的酶标新法。

Chandler等已把它做成野外应用的检测蛇毒诊断试剂盒。

基本上得到了简便化、高敏感、快速（30～60分钟）。

Chandler诊断试剂盒的主要装置如图5-2-1。

其原理是夹心法。

图5-2-1

（1～5玻璃是蛇伤诊断管，检查前，里面分别用各种特异性免抗蛇毒IgG包盖）

-

图5--1

2检测程序如下：

吸取稀释标本（病人尿、全血、伤口部棉拭子洗液）进入一系列毛细管内（血液用抗凝缓冲液稀释）。

毛细管内稀释的标本置室温中10分钟。

排出毛细管内稀释的标本，并用洗涤缓冲液洗3次（吸进、

打出3次）。

④将兔抗蛇毒抗体尿素酶结合物吸进毛细管内，并置室温中10分钟。

⑤排出毛细管内的结合物，再用盐水同③法洗3次。

⑥将底物溶液吸入毛细管内，在室温下，对着白色背景观察颜色的改变，变紫色者即为阳性。

继他们之后，特别是近十多年来，许多学者如Doellgast（1987）[17]Pugh和Theakston（1987）[18]、Silamut等（1987）、Bober等（1988）[19]Watanabe等（1988）[20]、Barral—Netto等（1990）[21]、Hatsuse等（1990）[22]、Barral—Netto等（1991）[23]、Stiles（1991）〔24〕、Audebert等（1992）[25]（1993）[26]、（1994ab）[27][28]、Gillissen等（1994）[29]、Lalloo等（1994）[30]、Pe等（1991）[31]、（1994）[32]、（1995）[33]、Alape—Giron等（1996）[34]、Moisidis等（1996）〔35〕在使ELISA在高敏感性、高特异性、快速性、简便性方面做了大量的改进。

从1979年报道的第一个蛇伤诊断药盒以来，相继已有很多研究报道，但真正适合在农村和野外使用的尚不太多。

1982年Chandler和Harrell（1982）[36]建立的一种可以在野外应用的毛细管酶免疫测定改良系统（药盒）。

但因贮存期短，费用较高，操作也较困难等问题。

1991年被更加简便，更加有效的澳大利亚国家血清实验室（Cox等，1992）[37]建立的药盒所代替。

此法可测定出2.5ng/ml的蛇毒，20min可得出结果。

对于澳大利亚五种毒蛇毒测定的特异性在PBS中是10～40ng/ml。

这个研究的结果显示所有五种蛇毒都明显的在10ng/ml被测出，并出现交叉反应，但比特异性反应要弱的多。

近年来Selvanayagam[38]和De[39]建立了快速的种特异性AB—微滴定ELISA药盒测定印度4种毒蛇（B.Caeruleus,N.naja，E.carinatus和D.r.russelli）的蛇毒。

此法只需0.6ml的抗凝血，不需任何器械，完全可在30min内得出结果（包括抽血和整个操作时间和观察时间在内），所有操作都在室温中进行，颜色反应明显，敏感度：

10ng/ml，其效用已通过27例蛇伤病人的血、血清和咬伤部位的拭子液的检查得到了证实。

下一步将观察和研究该药盒在野外现场的应用价值。

国内1981年广西医学院附院蛇伤科开始用酶标玻片法（DASS）进行银环蛇伤的诊断研究[40]，已取得一定进展。

1996年他们又报道了用快速斑点EIA法和快速ELISA法[41]在蛇伤诊断上的初步应用。

前者整个反应时间仅需12min可测出10ng/ml抗原样品，后者，整个反应时需要23min，可测到30ng/ml的蛇毒样品。

安徽中医学院李云龙等[42]从1980年底开始创用天然胶乳凝集抑制试验（NLAlT）进行我国主要的8种蛇伤的蛇种快速鉴定．该法已生产成蛇种诊断试剂盒，使用很方便。

可以在农村或野外快速诊断致伤蛇种。

与以上一些方法比较，它具有操作极其简便、快速、准确，阳性检出率高，试剂稳定．有效期长（1年）等特点。

1981～1988年在我国南方8省临