实验 一大肠杆菌感受态细胞的制备内蒙古师范大学.docx

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实验一大肠杆菌感受态细胞的制备内蒙古师范大学

基因工程实验教案

实验一、大肠杆菌感受态细胞的制备

1、实验目的

了解制备感受态细胞的的意义

掌握大肠杆菌感受态细胞的制备方法和技术

掌握感受态细胞的保存方法

2、相关知识及原理

感受态及感受态细胞

原理：

受体细胞经过一些特殊方法（如：

CaCl2等化学试剂法或电击法）的处理后，

细胞膜的通透性发生变化，成为能容许多有外源DNA的载体分子通过的感受态细胞

基本方法：

细菌经0℃的低渗CaCl2处理，使细菌处于感受态，然后加入甘油-70℃

条件下保存

3、仪器、材料和试剂

材料：

大肠杆菌DH5αTOP10

试剂：

0.1mol／LCaCl2溶液LB培养基（液态）

仪器：

超净工作台电热恒温水浴分光光度计低温离心机制冰机

4、操作步骤

（1）从DH5α（或TOP10）菌平板上挑取一单落，接种于15mlLB液体培养基中，37℃振荡培养12h左右。

（2）取该菌悬液150μl转接于15mlLB液体培养基中，37℃振荡培养2h左右（OD600≤0.5）

（3）将菌液转移到10ml离心管（每管8ml），放冰上10min。

（4）离心10min（4000r/min），回收细胞（从这一步开始，所有操作均在冰上进行，速度尽量快而稳）。

（5）倒净上清培养液（倒置1min），用1.6ml冰冷的0.1mo1／LCaCl2溶液轻轻悬浮细胞，立即放在冰上30min。

（6）4℃离心10min（5000r/min），弃上清液，回收细胞。

（7）用320ul冰冷的0.1mo1／LCaCl2溶液轻轻悬浮细胞，立即放在冰上。

（8）分装细胞，每管170ul细胞悬液再加30ul甘油（灭菌）。

（9）作标记，-70℃保存。

实验二、大肠杆菌的转化及转化子的检测

1、实验目的

掌握感受态细胞转化的基本知识

掌握大肠杆菌感受态细胞转化的方法

了解感受态细胞转化的的意义

2、相关知识及原理

转化

原理:

转化混合物中的外源DNA形成抗DNA酶的羟基-钙磷酸复合物粘附于细胞

表面，经42℃短时间热击处理，促进细胞吸收DNA复合物。

转化是将异源DNA分子引入一细胞株系,使受体细胞获得新的遗传性状的一种手段，是基因工程等研究领域的基本实验技术。

转化方法：

热击法、电转化法

3、仪器、材料和试剂

仪器：

无菌超净台电热恒温水浴分光光度计低温离心机微型离心管

移液器

材料：

感受态细胞、pUC18、pUC19

试剂：

CaCl2溶液（0.1mol／L）LB培养基氨苄青霉素

4、操作步骤

（1）分别取2个200µl感受态细胞悬液

第一组——转化实验组：

0.5µl（50ng）pUC18/pUC19+200µl感受态细胞

第二组——受体菌对照组：

0.5µl无菌水+200µl感受态细胞悬液

（2）将以上各样品轻轻摇匀，冰上放置30min，于42℃水浴中保温1.5min，然后迅速冰上冷却2min。

（3）立即向上述管中分别加入0.8mlLB液体培养基（不需在冰上操作），使总体积到1ml，该溶液称为转化反应原液，摇匀后于37℃振荡培养约1.5h（170rpm）。

（4）取各样品培养液0.1ml，分别接种于含抗菌素LB平板培养基和普通LB平板培养基上，涂匀（如果用玻璃棒涂抹，酒精灯烧过后稍微凉一下再用，不要过烫）。

（5）菌液完全被培养基吸收后，倒置培养皿，于37℃恒温培养箱内培养过夜（12-16小时），出现菌落。

5、实验结果

实验三、碱变性法提取质粒DNA

1、实验目的

学习掌握碱裂解法提取质粒DNA的方法和技能

2、相关知识及原理

碱裂解法提取法是根据共价闭合环状DNA与线性染色体DNA在拓扑学上的差异来分离它们。

pH介于12.0—12.5范围内，线性的DNA双螺旋解开变性；质粒DNA的氢键会断，但两链彼此盘绕。

当恢复到中性时，质粒DNA复性迅速而准确；线性染色体DNA复性不迅速，而且缠绕形成网状结构，通过离心使他们分离。

3、仪器、材料和试剂

仪器：

恒温培养箱摇床电热恒温水浴电泳仪低温离心机紫外线透

射仪

材料：

pUC18/19

试剂：

溶液Ⅰ/Ⅱ/Ⅲ胰RNA酶TE缓冲液

4、操作步骤

（1）15ml的含氨苄氰霉素LB培养基中接入上一实验得到的转化子，37℃震荡培养8h,加入氯霉素（终浓度150µg/ml），培养过夜。

（2）取1.5ml培养物倒入离心管中，4000r/min离心3min，吸去培养液，使细胞沉淀尽可能干燥。

（3）将细菌沉淀悬浮于100µl溶液Ⅰ（冰上预冷）中，剧烈振荡，室温放置5min。

（4）加200µl溶液Ⅱ（新鲜配制），盖紧管皿，快速颠倒离心管5次，混匀内容物，将离心管放冰上5min。

（5）加150µl溶液Ⅲ（冰上预冷），盖紧管皿，颠倒数次使其混匀，冰上放置10min。

（6）12000r/min，离心5min，将上清液转至另一离心管。

（7）向上清中加入等体积（约450µl）酚：

氯仿：

异戊醇（25：

24：

1）（去蛋白），混合有机相和水相，12000rpm,离心5min，将上清用移液器集中转移到另一离心管（7ml）中（小心移液，不要把分界面的蛋白质吸入）。

（8）向上清加入2倍体积（约3200µl）无水乙醇，混匀后，室温放置10min，12000rpm离心5min。

去上清液，把离心管倒扣在吸水纸上，吸干管壁液体。

（9）用4ml70%乙醇（-20℃预冷）洗涤质粒DNA沉淀，振荡并离心（12000rpm,5min），倒去上清夜，晾干。

（10）加100µlTE缓冲液，其中含有20µg/ml的胰RNA酶（2ml，1mg/mlRNA酶），使DNA完全溶解，–20℃保存。

实验四、DNA的纯度、浓度及分子量的测定

1、实验目的

学习掌握琼脂糖凝胶电泳检测DNA的方法和技术

学习掌握凝胶成像系统、琼脂糖凝胶电泳系统、紫外-可见分光光度计的使用方法

2、相关知识及原理

琼脂糖凝胶电泳：

DNA分子在琼脂糖凝胶中泳动时有电荷效应和分子筛效应

分子筛效应DNA分子的大小和构型

质粒构型：

cccDNAL-DNAOC-DNA

3、仪器、材料和试剂

仪器

琼脂糖凝胶电泳系统凝胶成像系统紫外-可见分光光度计

材料：

pUC18

试剂：

DNAMarkerTAE/TBE缓冲液点样缓冲液溴化乙锭（EB）琼脂糖

4、操作步骤

DNA的浓度、纯度测定

稀释DNA（350倍）10µlDNA+3490µlTE

紫外-可见分光光度计用TE作对照，石英比色皿

浓度计算：

OD260=1时DNA的浓度=50µg/ml

DNA的浓度=稀释倍数（350）×OD260×50

纯度计算：

OD260/OD280

DNA分子量测定

（1）琼脂糖凝胶的制备取0.7g琼脂糖，放入锥形瓶中，加100ml0.5倍TBE/TAE缓冲液，置微波炉加热至完全溶化，取出摇匀，则为0.7%琼脂糖凝胶。

待凝胶冷却至60℃，加入EB，使终浓度为0.5μg/ml。

（2）胶板的制备

①将有机玻璃内槽、梳子等洗净烘干。

②将有机玻璃放置于凝胶槽内，并放好梳子。

③将60℃左右的琼脂糖凝胶液缓慢而连续地倒入有机玻璃内槽，直至有机玻璃板上形成一层均匀的胶板（注意：

若有气泡产生，用小枪头吸出）。

④待胶凝固后，取出梳子（竖直、迅速拔出），取有机玻璃内槽（带胶板），放在电泳槽内。

⑤加电泳缓冲液至稍没过胶面（不要太多或太少）。

（3）加样

①用移液枪将样品DNA与上样缓冲液混匀。

②将吸有混合液的枪头缓慢插入加样孔液面以下，缓慢将液体加入（注意：

加样后枪头离开液面后再松开枪）。

注意：

记录点样顺序及点样量

（4）电泳

①接通电泳槽与电泳仪的电源（DNA带负电）。

②当溴酚蓝染料移动到距胶前沿1—2cm处，停止电泳。

5、实验结果

计算DNA浓度、纯度

浓度计算：

OD260=1DNA浓度=50ng/ml

DNA的浓度=稀释倍数（350）×OD260×50

纯度计算：

OD260/OD280＜1.9蛋白多

OD260/OD280＞2RNA多

在紫外灯（360nm，312nm或254nm）下观察染色后的电泳凝胶

实验五、DNA的酶切、连接与转化

1、实验目的

学习掌握重组DNA连接以及鉴定重组子的方法。

学习掌握X-gal等试剂的配制保存。

2、相关知识及原理

重组子

T4噬菌体DNA连接酶催化DNA连接反应:

（1）酶+ATP=酶-AMP复合物

（2）酶-AMP复合物结合DNA切口上，使DNA腺苷化

（3）形成新的磷酸二酯键，封闭切口

蓝白斑选择（Xgal、IPTG）、α互补

3、仪器、材料和试剂

仪器

电热恒温水浴

台式/低温离心机

恒温摇床

恒温培养箱

恒温水浴

材料

DH5α、TOP10pUC18/19植物DNA

试剂

X-galIPTG

BamHIT4DNA连接酶

4、操作步骤

制备重组DNA

（1）在灭菌的Eppendorf管（0.5ml）中,加入15μlpUC18,2μl酶切缓冲液，1μl（2U）BamHI酶,2μlBSA（酶和缓冲液放在冰上）,混合物总体积20μl，离心混匀，37℃反应3h。

（2）在另一无菌管中，加入植物DNA1.5μg，1μl酶切缓冲液，1μl（2U）BamHI酶,2μlBSA，无菌水6.5μl，混合物总体积10μl,离心混匀，37℃反应3h。

（3）各取2μl酶解液做电泳分析。

（4）剩余酶解液加入1/10体积的3mol/lKAc（PH5.2）溶液，再加2倍体积的无水乙醇，置-20℃冰箱2h（沉淀DNA）。

12000rpm4℃离心15min,弃上清，加70%乙醇洗沉淀物，再离心，去上清，倒置干燥，加5μlTE溶液溶解。

（替代方案：

剩余酶解液65℃,保温15min）

（5）将酶切后的2个DNA片段混合于一管中，加T4DNA连接酶缓冲液1μl，T4DNA连接酶1μl，14℃保温14h。

（6）制备感受态细胞（Top10）。

（7）同时制备含100μg/ml氨苄青霉素的固体LB培养基，待培养基冷却，培养基（90mm）中央滴加40μl2%X-gal和7μl20%IPTG（Top10不加），用无菌涂棒

使之均匀涂布于培养基表面，然后37℃温浴直至液体全部消失。

（8）转化

第一组：

5μl（50ng）重组子+200µl感受态细胞，此管为转化实验组。

第二组：

5μl无菌水+200µl感受态细胞悬液。

（9）实验组、对照组分别取80μl悬液均匀涂布在含X-gal、Amp的固体LB培养基和含Amp的固体LB培养基上；再取40μl悬液均匀涂布普通固体LB培养基上，37℃过夜培养

5、实验结果

含X-gal、Amp的固体LB培养基

白色菌落（重组子）和兰色菌落（pUC18）成功

兰色菌落（pUC18）或无菌落成功

含Amp的固体LB培养基

有菌落成功

无菌落失败

普通固体LB培养基

有菌落成功

无菌落失败

实验六、动物基因组DNA的提取和检测

1、实验目的

学习掌握从动物组织提取基因组DNA的原理和方法，以及相对分子质量较大的DNA的琼脂糖凝胶电泳技术。

2、相关知识及原理

在EDTA和SDS等去污剂存在下，用蛋白酶K消化细胞，随后用酚抽提，可以得到哺乳动物基因组DNA，用此方法得到的DNA长度为100〜150kb，适用于λ噬菌体构建基因组文库和Southern分析。

3、仪器、材料和试剂

仪器

台式离心机玻璃匀浆器高压灭菌锅恒温水浴器

材料

兔肝

试剂

蛋白酶K组织匀浆液酶解液RNA酶TE溶液

4、操作步骤

1、取0.4g兔肝，用冰冷的生理盐水洗3次，然后置于4ml匀浆液中，用玻璃匀浆器匀浆至无明显组织块存在（冰浴操作）。

2、将组织细胞移至10ml离心管中,4℃4000rpm离心1.5min,弃上清。

3、沉淀加1ml无菌水迅速吹散，再加1ml酶解液，翻转混匀（动作一定要轻）55℃水浴处理12〜18h。

4、加RNase至终浓度100μg/m（222μl）,37℃水浴2h。

5、加入等体积酚（约2ml）抽提一次，（慢慢旋转混匀，水平摇床摇10min），4℃8000rpm离心10min。

6、用扩口吸头移出含DNA的水相（注意勿吸出双相界面蛋白层），加等体积（约2ml）氯仿：

异戊醇（24：

1）4℃10min,8000rpm离心10min。

（有时如果DNA含量过高，水相在下层，实验时注意观察）

7、用扩口吸头小心吸出上层含DNA的水相，移入10ml离心管，加入250μl5mol/lNaCI（终浓度0.1---0.25mol/l）,小心混匀（要充分），在向每管中加入2.5倍体积（约6ml）的无水乙醇-20℃2h。

8、12000rpm离心15min，弃上清，70%冷乙醇洗涤一次，12000rpm离心15min，室温干燥，加入100μlTE缓冲液，轻摇混匀，存放4℃过夜（或2h）。

9、电泳鉴定（0.7%的琼脂糖凝胶）。

5、实验结果

提取的DNA应为靠近点样孔的一条带，

实验七、植物基因组DNA的提取和检测

1、实验目的

学习掌握从植物组织中提取DNA的方法

学习掌握液氮的使用

2、相关知识及原理

利用液氮对植物组织进行研磨破碎细胞。

细胞提取液中含有的SDS溶解膜蛋白而破坏细胞膜，使蛋白变性而沉淀下来。

EDTA抑制DNA酶的活性。

再用酚、氯仿提取的方法去除蛋白，得到的DNA溶液经乙醇沉淀。

3、仪器、材料和试剂

仪器

低温离心机恒温水浴器台式离心机琼脂糖凝胶系统

材料

植物基因组DNA

试剂

CTAB提取缓冲液TE

4、实验步骤

CTAB提取法：

（1）称取0.5克植物材料放入预冷至-20℃的研钵中（提前灭菌），加入少量石英沙，再倒入液氮（分批加入），研成粉末状，置于灭菌的10ml离心管中。

（2）加入2ml65℃预热的CTAB提取缓冲液充分混匀后在65℃保温90min;

CTAB提取缓冲液:

2%（w/v）十六烷基三甲基溴化铵（CTAB）:

1.4MNaCl；20mMEDTApH8.0；

100MmTris-HClpH8.0；

2%（w/v）聚乙烯吡咯烷酮（PVP）；

5%（v/v）巯基乙醇（使用前加入）

（3）加入等体积氯仿：

异戊醇（24：

1）充分摇匀后，4℃6000r/min离心15min。

（4）用扩口吸头取上清液移入另一10ml离心管中，加入2/3体积-20℃预冷的异丙醇，轻轻颠倒摇匀后，-20℃放置20min,在冷冻离心机上于4℃5000r/min离心10min,缓慢倾倒出上清液。

（5）在沉淀中加入1ml65℃预热的CTAB提取缓冲液，温浴1h,待沉淀充分溶解后，加入等体积氯仿：

异戊醇，充分混匀，4℃6000r/min离心10min。

（6）重复第4步；

（7）用70%乙醇洗沉淀两次，在室温晾干，加入200μlTE缓冲液溶解DNA2h。

（8）配制0.7%的琼脂糖凝胶电泳分析，取5μl的样品电泳。

实验八、聚合酶链式反应实验——随机扩增多态性DNA分析

1、实验目的

学习掌握PCR反应的基本原理与实验技术

学习掌握PCR仪的使用方法

2、相关知识及原理

聚合酶链式反应（polymerasechainreaction,PCR）的原理类似于DNA的天然复制过程。

在待扩增的DNA片段两侧和与两侧互补的两个寡核苷酸引物，经变性、退火和延伸若干个循环后，DNA扩增2n倍。

3、仪器、材料和试剂

仪器：

PCR仪琼脂糖凝胶电泳系统

材料：

兔基因组DNA随机引物

试剂：

PCR缓冲（10×）dNTPTaq酶矿物油

4、操作步骤

1、在0.2mLEppendorf管内配置20μL反应体系：

反应物体积/μL

ddH2O12

10×PCR缓冲2.0

2.5mmol/LdNTP2.0

随机引物1.0

模版DNA2.0

Taq酶1.0（1U）

点动混匀，加10μL矿物油。

2、按下述程序进行扩增反应条件：

（1）94ºC预变性4min；

（2）94ºC变性30sec；

（3）36ºC退火40sec；

（4）72ºC延伸100s；

（5）重复步骤

（2）〜（4）35次；

（6）72ºC延伸7min。

3、琼脂糖凝胶电泳分析PCR结果配置1.4%琼

脂糖凝胶，取10μL扩增产物电泳。