实验 一大肠杆菌感受态细胞的制备内蒙古师范大学.docx

1、实验 一大肠杆菌感受态细胞的制备 内蒙古师范大学基因工程实验教案实验 一、大肠杆菌感受态细胞的制备1、实验目的了解制备感受态细胞的的意义掌握大肠杆菌感受态细胞的制备方法和技术掌握感受态细胞的保存方法2、相关知识及原理感受态及感受态细胞原理：受体细胞经过一些特殊方法（如：CaCl2等化学试剂法或电击法）的处理后， 细胞膜的通透性发生变化，成为能容许多有外源DNA的载体分子通过的感受态细胞基本方法：细菌经0 的低渗CaCl2处理，使细菌处于感受态，然后加入甘油-70 条件下保存 3、仪器、材料和试剂材料：大肠杆菌DH5 TOP10试剂：0.1molL CaCl2溶液 LB培养基（液态）仪器：超净工

2、作台 电热恒温水浴 分光光度计 低温离心机 制冰机4、操作步骤（1）从 DH5(或TOP10)菌平板上挑取一单落，接种于15ml LB液体培养基中，37振荡培 养12h左右。（2）取该菌悬液150l 转接于15ml LB液体培养基中，37振荡培养2h左右（ OD6000.5）（3）将菌液转移到10ml离心管（每管8ml），放冰上10min。（4）离心10min（4000r/min），回收细胞（从这一步开始，所有操作均在冰上进行，速度尽量快而稳） 。（5）倒净上清培养液(倒置1 min)，用1.6ml冰冷的0.1mo1L CaCl2溶液轻轻悬浮细胞，立即放在 冰上30 min 。 （6）4离心1

3、0min（5000r/min），弃上清液，回收细胞。（7）用320ul冰冷的0.1mo1L CaCl2溶液轻轻悬浮细胞，立即放在冰上 。（8）分装细胞，每管170ul细胞悬液再加30ul甘油（灭菌）。（9）作标记，-70保存。实验 二、大肠杆菌的转化及转化子的检测1、实验目的掌握感受态细胞转化的基本知识掌握大肠杆菌感受态细胞转化的方法了解感受态细胞转化的的意义2、相关知识及原理转化原理:转化混合物中的外源DNA形成抗DNA酶的羟基-钙磷酸复合物粘附于细胞表面，经42短时间热击处理，促进细胞吸收DNA复合物。转化是将异源DNA分子引入一细胞株系,使受体细胞获得新的遗传性状的一种手段，是基因工程等

4、研究领域的基本实验技术。转化方法：热击法、电转化法3、仪器、材料和试剂仪器：无菌超净台 电热恒温水浴 分光光度计 低温离心机 微型离心管移液器材料：感受态细胞、pUC18、pUC19试剂：CaCl2溶液 （0.1molL） LB培养基 氨苄青霉素4、操作步骤（1）分别取2个200l感受态细胞悬液 第一组转化实验组：0.5l(50ng)pUC18/pUC19 + 200l感受态细胞 第二组受体菌对照组：0.5l无菌水 + 200l感受态细胞悬液（2）将以上各样品轻轻摇匀，冰上放置30min，于42水浴中保温1.5min，然后迅速冰上冷却2min。 （3）立即向上述管中分别加入0.8ml LB液体

5、培养基（不需在冰上操作），使总体积到1ml，该溶液称为转化反应原液，摇匀后于37振荡培养约1.5h（170rpm）。（4）取各样品培养液 0.1ml，分别接种于含抗菌素LB平板培养基和普通LB平板培养基上，涂匀（如果用玻璃棒涂抹，酒精灯烧过后稍微凉一下再用，不要过烫）。（5）菌液完全被培养基吸收后，倒置培养皿，于37恒温培养箱内培养过夜(12-16小时)，出现菌落。5、实验结果实验三、碱变性法提取质粒DNA1、实验目的学习掌握碱裂解法提取质粒DNA的方法和技能2、相关知识及原理碱裂解法提取法是根据共价闭合环状DNA与线性染色体DNA在拓扑学上的差异来分离它们。pH介于12.012.5范围内，线

6、性的DNA双螺旋解开变性；质粒DNA的氢键会断，但两链彼此盘绕。当恢复到中性时，质粒DNA复性迅速而准确；线性染色体DNA复性不迅速，而且缠绕形成网状结构，通过离心使他们分离。3、仪器、材料和试剂仪器：恒温培养箱 摇床 电热恒温水浴 电泳仪 低温离心机 紫外线透射仪材料：pUC 18/19试剂：溶液/ 胰RNA酶 TE缓冲液4、操作步骤（1）15ml的含氨苄氰霉素LB培养基中接入上一实验得到的转化子，37 震荡培养8h,加入氯霉素（终浓度150 g/ml），培养过夜。（2）取1.5ml培养物倒入离心管中，4000r/min离心3min，吸去培养液，使细胞沉淀尽可能干燥。（3）将细菌沉淀悬浮于1

7、00 l溶液 （冰上预冷）中，剧烈振荡，室温放置5 min。（4）加200 l溶液（新鲜配制），盖紧管皿，快速颠倒离心管5次，混匀内容物，将离心管放冰上5 min。（5）加150 l溶液（冰上预冷），盖紧管皿，颠倒数次使其混匀，冰上放置10 min。（6）12000r/min，离心5 min，将上清液转至另一离心管。（7）向上清中加入等体积(约450 l) 酚：氯仿：异戊醇（25：24 ： 1）（去蛋白），混合有机相和水相，12000rpm,离心5 min，将上清用移液器集中转移到另一离心管 （7ml）中（小心移液，不要把分界面的蛋白质吸入）。（8）向上清加入2倍体积（约3200 l）无水乙醇

8、，混匀后，室温放置10min，12000rpm离心5min。去上清液，把离心管倒扣在吸水纸上，吸干管壁液体。（9）用4ml70%乙醇（-20 预冷）洗涤质粒DNA沉淀，振荡并离心(12000rpm,5min)，倒去上清夜，晾干。（10）加100l TE缓冲液，其中含有20 g/ml的胰RNA酶(2ml， 1mg/ml RNA酶)，使DNA完全溶解，20 保存。实验四、DNA的纯度、浓度及分子量的测定1、实验目的学习掌握琼脂糖凝胶电泳检测DNA的方法和技术学习掌握凝胶成像系统、琼脂糖凝胶电泳系统、紫外-可见分光光度计的使用方法2、相关知识及原理琼脂糖凝胶电泳：DNA分子在琼脂糖凝胶中泳动时有电荷

9、效应和分子筛效应分子筛效应 DNA分子的大小和构型质粒构型：cccDNA L-DNA OC-DNA3、仪器、材料和试剂仪器琼脂糖凝胶电泳系统 凝胶成像系统 紫外-可见分光光度计材料：pUC18试剂：DNA Marker TAE/TBE缓冲液 点样缓冲液 溴化乙锭（EB） 琼脂糖4、操作步骤DNA的浓度、纯度测定稀释DNA (350倍) 10 l DNA + 3490 l TE紫外-可见分光光度计用TE作对照，石英比色皿浓度计算：OD 260 =1时DNA的浓度 = 50g/ml DNA的浓度=稀释倍数(350)OD260 50 纯度计算： OD260/ OD280DNA分子量测定 （1）琼脂糖

10、凝胶的制备取0.7g 琼脂糖，放入锥形瓶中，加100ml 0.5倍TBE/TAE缓冲液，置微波炉加热至完全溶化，取出摇匀，则为0.7%琼脂糖凝胶。待凝胶冷却至60 ，加入EB，使终浓度为0.5g/ml。（2）胶板的制备 将有机玻璃内槽、梳子等洗净烘干。 将有机玻璃放置于凝胶槽内，并放好梳子。 将60左右的琼脂糖凝胶液缓慢而连续地倒入有机玻璃内槽，直至有机玻璃板上形成一层均匀的胶板（注意：若有气泡产生，用小枪头吸出）。 待胶凝固后，取出梳子（竖直、迅速拔出），取有机玻璃内槽（带胶板），放在电泳槽内。 加电泳缓冲液至稍没过胶面（不要太多或太少）。 （3）加样 用移液枪将样品DNA与上样缓冲液混匀。

11、 将吸有混合液的枪头缓慢插入加样孔液面以下，缓慢将液体加入（注意：加样后枪头离开液面后再松开枪）。 注意：记录点样顺序及点样量 （4）电泳 接通电泳槽与电泳仪的电源（DNA带负电）。 当溴酚蓝染料移动到距胶前沿12cm处，停 止电泳。5、实验结果计算DNA浓度、纯度 浓度计算：OD 260=1 DNA浓度=50ng/ml DNA的浓度=稀释倍数(350)OD 260 50 纯度计算： OD 260/ OD 280 1.9 蛋白多 OD 260/ OD 280 2 RNA多 在紫外灯（360nm，312nm或254nm） 下观察染色后的电泳凝胶实验五、 DNA的酶切、连接与转化1、实验目的学习掌

12、握重组DNA连接以及鉴定重组子的方法。学习掌握X-gal 等试剂的配制保存。2、相关知识及原理重组子T4噬菌体DNA连接酶催化DNA连接反应: （1）酶 + ATP = 酶-AMP复合物 （2）酶-AMP复合物结合DNA切口上，使DNA腺苷化 （3）形成新的磷酸二酯键，封闭切口蓝白斑选择（ Xgal 、IPTG ）、 互补3、仪器、材料和试剂仪器 电热恒温水浴 台式/低温离心机 恒温摇床 恒温培养箱 恒温水浴材料 DH5、TOP10 pUC18/19 植物DNA试剂 X-gal IPTG BamHI T4DNA连接酶4、操作步骤制备重组DNA （1）在灭菌的Eppendorf管（0.5ml）中

13、,加入15l pUC18,2l酶切缓冲液，1l（2U）BamHI酶, 2l BSA （酶和缓冲液放在冰上),混合物总体积20l，离心混匀，37 反应3h。（2）在另一无菌管中，加入植物DNA 1.5g，1l酶切缓冲液，1l（ 2U） BamHI酶, 2l BSA ，无菌水6 .5l，混合物总体积10l,离心混匀，37反应3h。（3）各取 2l酶解液做电泳分析。（4）剩余酶解液加入1/10体积的3mol/l KAc(PH5.2)溶液，再加2倍体积的无水乙醇，置-20 冰 箱 2h（沉淀DNA）。12000rpm 4 离心15min,弃上清，加70%乙醇洗沉淀物，再离心，去上清，倒置干燥，加 5l

14、TE溶液溶解。(替代方案：剩余酶解液65 ,保温15min)（5）将酶切后的2个DNA片段混合于一管中，加T4 DNA连接酶缓冲液1l， T4DNA连接酶1l，14 保温14h。（6）制备感受态细胞（Top10）。（7）同时制备含100 g/ml氨苄青霉素的固体LB培养基，待培养基冷却，培养基（90mm）中央滴加 40l 2%X-gal和7l 20%IPTG(Top10不加)，用无菌涂棒 使之均匀涂布于培养基表面，然后37 温浴直至液体全部消失。（8）转化 第一组：5l(50ng)重组子+ 200l感受态细胞，此管为转化实验组。 第二组：5l无菌水+ 200l感受态细胞悬液。（9）实验组、对照

15、组分别取80l悬液均匀涂布在含 X-gal、Amp的固体LB培养基和含Amp的固体LB培养基上；再取40l悬液均匀涂布普通固体LB培养基上，37 过夜培养5、实验结果含X-gal、Amp的固体LB培养基 白色菌落（重组子）和兰色菌落（pUC18）成功 兰色菌落（pUC18）或无菌落 成功含Amp的固体LB培养基 有菌落 成功无菌落 失败普通固体LB培养基 有菌落 成功 无菌落 失败实验 六、动物基因组DNA的提取和检测1、实验目的学习掌握从动物组织提取基因组DNA的原理和方法，以及相对分子质量较大的DNA的琼脂糖凝胶电泳技术。2、相关知识及原理 在EDTA和SDS等去污剂存在下，用蛋白酶K消化

16、细胞，随后用酚抽提，可以得 到哺乳动物基因组DNA，用此方法得到的DNA长度为100150kb，适用于噬菌体构建基因组文库和Southern分析。3、仪器、材料和试剂仪器 台式离心机 玻璃匀浆器 高压灭菌锅 恒温水浴器材料 兔肝试剂 蛋白酶K 组织匀浆液 酶解液 RNA酶 TE溶液4、操作步骤1、取0.4g兔肝，用冰冷的生理盐水洗3次，然后置于4ml匀浆液中，用玻璃匀浆器匀浆至无明显组织块存在（冰浴操作）。2、将组织细胞移至10ml离心管中,4 4000rpm离心1.5min,弃上清。3、沉淀加1ml无菌水迅速吹散，再加1ml酶解液，翻转混匀（动作一定要轻）55水浴处理1218h。4、加RNa

17、se至终浓度100g/m（222l）,37水浴2h。5、加入等体积酚(约2ml)抽提一次，（慢慢旋转混匀，水平摇床摇10min），4 8000 rpm离心10min。6、用扩口吸头移出含DNA的 水相（注意勿吸出双相界面蛋白层），加等体积(约2ml)氯仿：异戊醇（24：1）4 10min,8000 rpm离心10min。（有时如果DNA含量过高，水相在下层，实验时注意观察）7、用扩口吸头小心吸出上层含DNA的水相，移入10ml离心管，加入250l 5mol/l NaCI(终浓度0.1-0.25mol/l),小心混匀（要充分），在向每管中加入2.5倍体积(约6ml)的无水乙醇-20 2h。8、1

18、2000rpm离心15min，弃上清，70%冷乙醇洗涤一次， 12000rpm离心15min，室温干燥，加入100l TE缓冲液，轻摇混匀，存放4 过夜（或2h）。9、电泳鉴定（0.7%的琼脂糖凝胶）。5、实验结果提取的DNA应为靠近点样孔的一条带，实验 七、植物基因组DNA的提取和检测1、实验目的学习掌握从植物组织中提取DNA的方法学习掌握液氮的使用2、相关知识及原理 利用液氮对植物组织进行研磨破碎细胞。细胞提取液中含有的SDS溶解膜蛋白而破坏细胞膜，使蛋白变性而沉淀下来。EDTA抑制DNA酶的活性。再用酚、氯仿提取的方法去除蛋白，得到的DNA溶液经乙醇沉淀。3、仪器、材料和试剂仪器 低温离

19、心机 恒温水浴器 台式离心机 琼脂糖凝胶系统材料 植物基因组DNA试剂 CTAB提取缓冲液 TE4、实验步骤CTAB提取法：（1）称取0.5克植物材料放入预冷至-20的研钵中（提前灭菌），加入少量石英沙，再倒入液氮(分批加入)，研成粉末状，置于灭菌的10ml离心管 中。（2）加入2ml 65预热的CTAB提取缓冲液充分混匀后在65保温90min;CTAB提取缓冲液: 2%（w/v）十六烷基三甲基溴化铵（CTAB）: 1.4M NaCl； 20mM EDTApH8.0； 100Mm Tris- HCl pH8.0 ； 2%(w/v)聚乙烯吡咯烷酮（PVP）； 5%（v/v）巯基乙醇（使用前加入）

20、（3）加入等体积氯仿：异戊醇（24 ：1）充分摇匀后，4 6000r/min离心15 min。（4）用扩口吸头取上清液移入另一10ml离心管中，加入2/3体积-20预冷的异丙醇，轻轻颠倒摇匀后，-20放置20min , 在冷冻离心机上于4 5000r/min离心10 min ,缓慢倾倒出上清液。（5）在沉淀中加入1ml65预热的CTAB提取缓冲液，温浴1h,待沉淀充分溶解后，加入等体积氯仿：异戊醇，充分混匀，4 6000r/min离心10 min 。（6）重复第4步；（7）用70 %乙醇洗沉淀两次，在室温晾干，加入200l TE缓冲液溶解 DNA 2h。（8）配制0.7%的琼脂糖凝胶电泳分析，

21、取5l的样品电泳。实验八、聚合酶链式反应实验 随机扩增多态性DNA分析1、实验目的学习掌握PCR反应的基本原理与实验技术学习掌握PCR仪的使用方法2、相关知识及原理 聚合酶链式反应（polymerase chain reaction,PCR）的原理类似于DNA的天然复制过程。在待扩增的DNA片段两侧和与两侧互补的两个寡核苷酸引物，经变性、退火 和延伸若干个循环后，DNA扩增2n倍。3、仪器、材料和试剂仪器：PCR仪 琼脂糖凝胶电泳系统材料：兔基因组DNA 随机引物 试剂：PCR缓冲（10） dNTP Taq酶 矿物油4、操作步骤1、在0.2m L Eppendorf管内配置20L反应体系： 反应物 体积/ L ddH2O 1 2 10 PCR缓冲 2.0 2.5 mmol/L dNTP 2.0 随机引物 1.0 模版DNA 2.0 Taq酶 1.0 （1U） 点动混匀，加10 L矿物油。2、按下述程序进行扩增反应条件：（1）94C 预变性 4min；（2）94C 变性 30sec；（3）36C 退火 40sec；（4）72C 延伸 100s ；（5）重复步骤（2）（4） 35次；（6）72C 延伸 7min。3、琼脂糖凝胶电泳分析PCR结果配置1.4%琼 脂糖凝胶，取10 L扩增产物电泳。