荧光习题知识讲座.docx

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荧光习题知识讲座

荧光分析法

●习题精选

一、选择题〔其中1~6题为单项选择，7~10题为多项选择〕

1．以下化合物中荧光最强、发射波长最长的化合物是（）。

A.

B.

C.

D.

2．所谓荧光，即指某些物质经入射光照射后，吸收了入射光的能量，从而辐射出比入射光（）。

A.波长长的光线；B.波长短的光线；

C.能量大的光线；D.频率高的光线

3．单光束荧光分光光度计的光路图是（）。

A.

B.

C.

D.

4．萘及其衍生物在以下溶剂中能产生最大荧光的溶剂是（）。

A.1-氯丙烷；B.1-溴丙烷；

C.1-碘丙烷；D.1,2-二碘丙烷

5．以下化合物荧光最强的是（）；磷光最强的是（）。

6．以下化合物荧光量子产率最大的是（）

7．以下说法正确的选项是（）

A荧光发射波长永远大于激发波长

B荧光发射波长永远小于激发波长

C荧光光谱形状与激发波长无关

D荧光光谱形状与激发波长有关

8．荧光物质的荧光强度与该物质的浓度成线性关系的条件是（）

A.单色光；B.ECl≤0.05；

C.入射光强度I0一定；D.样品池厚度一定

9．以下化合物中可产生荧光的化合物是（）

10．在相同条件下，荧光、延时荧光、磷光三者波长之间的关系为（）

A.荧光波长与延时荧光波长相等；

B.磷光波长比荧光波长、延时荧光波长长；

C.磷光波长与延时荧光波长相等；

D.磷光波长比荧光波长、延时荧光波长短

二、填空题

1．荧光寿命与延时荧光寿命相比，寿命短；荧光寿命与磷光寿命相比，寿命长；磷光寿命与延时荧光寿命相比，二者。

2．荧光光谱的形状与激发光谱的形状，常形成。

3．一般情况下，溶液的温度，溶液中荧光物质的荧光强度或荧光量子产率越高。

4．激发光谱的形状与光谱形状极为相似，所不同的只是。

5．荧光分光光度计中光源与检测器呈角度。

这是因为。

6．紫外分光光度计与荧光分光光度计的主要区别是〔1〕。

〔2〕。

7．荧光分光光度计中，第一个单色器的作用是，第二个单色器的作用是。

8．荧光量子产率，荧光强度越大。

具有分子结构的物质有较高的荧光量子产率。

9．处于激发态的分子不稳定，回到基态时常有、去活化过程。

10．选择适当的可以消除或减少散射光对荧光测定的干扰。

三、判断题

1．荧光光谱是荧光物质的特性，所以同一荧光物质在不同的溶剂中具有相同的荧光光谱。

2．荧光光谱的形状与激发光谱的形状常形成镜像对称。

3．溶剂的拉曼光波长与被测溶质荧光的激发光波长无关。

4．在一定条件下，物质的荧光强度与该物质的任何浓度成线性关系。

即：

。

5．荧光光谱的形状与激发波长有关。

选择最大激发波长，可以得到最正确荧光光谱。

6．荧光分光光度计中光源发出光到检测器检测荧光，其光路为一条直线。

7．发荧光时，电子能量的转移没有电子自旋的改变；发磷光时，电子能量的转移伴随电子自旋的改变。

8．紫外分光光度法和荧光分光光度法都属于分子光谱法范畴，所以两种方法具有相同的灵敏度。

9．荧光量子产率φF＜1。

10．具有π→π*跃迁共轭的化合物，易产生更强的荧光；具有n→π*跃迁共轭的化合物，易产生更强的磷光。

四、名词解释

1．单重态或单线态

2．三重态或三线态

3．振动弛豫

4．内部能量转换

5．荧光

6．外部能量转换

7．体系间跨越

8．磷光

9．延时荧光

10．激发光谱

11．荧光光谱

12．荧光寿命

13．荧光效率

五、计算题

1．用荧光法测定复方炔诺酮片中炔雌醇的含量时，取供试品20片〔每片含炔诺酮应为0.54~0.66mg，含炔雌醇应为31.5~38.5μg〕，研细，用无水乙醇溶解，转移至250mL容量瓶中，用无水乙醇稀释至刻度，滤过，弃去初滤液，取续滤液5.00mL，稀释至10mL，在λex285nm和λem307nm处测定荧光强度。

已知炔雌醇对照品乙醇溶液的浓度为1.4μg/mL，在同样测定条件下，测得荧光强度为65，则合格片的荧光读数应在什么范围内？

2．用酸处理1.00g谷物制品试样，别离出核黄素及少量无关杂质，加入少量KMnO4，将核黄素氧化，过量的KMnO4用H2O2除去。

将此溶液移入50mL容量瓶中，稀释至刻度。

吸取25mL放入样品池中以测定荧光强度〔核黄素中常含有发生荧光的杂质叫光化黄〕。

事先将荧光计用硫酸奎宁调至刻度100。

测得氧化液的读数为6.0格。

加入少量连二亚硫酸钠〔Na2S2O4〕，使氧化态核黄素〔无荧光〕重新转化为核黄素，这时荧光计读数为55格。

在另一样品池中重新加入24mL被氧化的核黄素溶液，以及1mL核黄素标准溶液〔0.5μg/mL〕，这一溶液的读数为92格，计算试样中核黄素的质量分数〔μg/g〕。

3．今有化合物SPQ，其分子结构式如以下列图所示。

该分子可作为选择性的细胞内Cl-离子荧光探针，因为Cl-可碰撞淬灭SPQ荧光。

已知没有淬灭剂存在下ns。

现有实验数据测定如下：

[Cl-]/mmol/L

0

5

15

50

发光强度F

①根据Stern－Volmer方程，利用表中的数据确定Cl-的淬灭常数。

②假设血清中细胞内的Cl-平均浓度为103mmol/L，则该血清中SPQ的荧光寿命和荧光相对强度各是多少？

③如果Cl-浓度降低到75mmol/L，SPQ的荧光寿命和荧光相对强度又是多少？

●习题答案与解析

一、选择题〔其中1~6题为单项选择，7~10题为多项选择〕

1．D。

因为共轭体系越长、刚性或共平面性越好、离域电子数越多，荧光强度〔荧光效率〕越大，荧光波长红移程度越大。

所以荧光最强、发射波长最长的化合物是D。

2．A。

由于荧光发射是要经过振动弛豫、内转换损失了部分能量，荧光能量小于激发光能量，故荧光波长总比激发光波长要长。

3．B。

因为〔1〕荧光分光光度计由光源、单色器、样品池、检测器和显示器组成。

〔2〕荧光分光光度计光源必须与检测器垂直。

〔3〕荧光分光光度计在样品池前后各一个单色器。

单色器1是将光源发出的复光变成单色光；单色器2是将发出的荧光与杂散光别离，防止杂散光对荧光测定的干扰。

4．A。

在含有重原子的溶剂中，由于重原子效应〔重原子效应是指在含有卤素取代基化合物存在时，随着卤素原子序数的增加，荧光化合物荧光强度降低的现象。

〕，增加了体系间跨越，使荧光强度减弱。

原子序数越大，重原子效应越严重。

所以，萘及其衍生物在1-氯丙烷中能产生最大荧光。

5．D,C。

由于重原子效应，A、B、C化合物不易产生荧光，易产生磷光。

卤素原子序数最大，重原子效应越严重，荧光熄灭越严重，磷光产生的几率越大。

D没有重原子取代，易产生荧光。

所以，以下化合物荧光最强的是D；磷光最强的是C。

6．B。

因为共平面性越好、离域电子数越多，荧光量子产率越大。

A和C共平面性差，几乎没有荧光，B、D由于苯环之间有氧桥键连接，很好的共平面，所以B、D都有较大的荧光量子产率，但由于B的-OH和-COOH发生电离，形成-O-和-COO-负离子，离域电子数增加。

而D没有电离，离域电子数相对较少。

所以以下化合物荧光量子产率最大的是B。

7．AC。

由激发光谱和发射光谱特征可知：

在溶液中，分子荧光波长总是大于激发光波长。

荧光光谱的形状与激发波长无关。

所以正确说法是AC。

8．ABCD。

荧光强度与荧光物质浓度的关系为F=Kc。

满足F=Kc公式的条件：

〔1〕入射光为单色光；〔2〕Ecl≤0.05；〔3〕入射光的强度I0一定；〔4〕样品池厚度一定。

9．BD。

因为共平面性好的刚性分子才能产生荧光。

A和C共平面性差，不产生荧光，B、D由于苯环之间成环，可以很好的平面，刚性增强。

所以B、D可以产生荧光

10．AB。

由荧光、延时荧光、磷光的产生机理可知：

荧光波长与延时荧光波长相等；磷光波长比荧光波长、延时荧光波长长。

二、填空题

1．荧光；磷光；相等

2．镜像对称

3．越低

4．吸收；激发光谱的纵坐标为荧光强度，而吸收光谱的纵坐标为吸光强度

5．90°；如果光源与检测器在同一直线上，透射光将干扰荧光的检测。

6．〔1〕紫外分光光度计的光源与检测器在一条直线上，荧光分光光度计的光源与检测器呈90°角。

〔2〕紫外分光光度计有一个单色器；荧光分光光度计在样品池前后各有一个单色器。

7．扫描激发光谱〔将光源发出的复光变成单色光〕；扫描发射光谱〔将发出的荧光与杂散光别离，防止杂散光对荧光测定的干扰〕

8．越大；刚性、共平面共轭体系

9．辐射跃迁〔荧光和磷光〕；非辐射跃迁〔振动弛豫、内转换、系间跨越等〕

10．激发波长

三、判断对错

1．×。

由于溶剂极性对荧光化合物π→π*跃迁能级差的影响，同一物质在不同溶剂中的荧光光谱形状和强度都有差异。

溶剂极性的越大，π→π*跃迁能级差越小，荧光波长红移，且强度增强。

2．√。

由荧光激发光谱和发射光谱的产生机理可以看出，〔1〕激发光谱和发射光谱互为逆过程，并相差固定的能级差。

〔2〕激发波长跃迁几率大的能级，便是其荧光发射几率大的能级。

所以，荧光光谱与激发光谱之间存在呈“镜像对称”关系。

3．×。

同一溶剂在不同的激发光波长照射下，其拉曼光的波长不同，即溶剂拉曼光频率随激发光频率的变化而变化，当拉曼光处在被测溶质荧光波长附近时，则对荧光溶质的测定产生干扰。

消除的方法有：

〔1〕选用高分辨率的仪器；〔2〕对所选溶剂的拉曼光谱进行测定，然后对被测化合物荧光光谱进行校正或重新选择被测化合物的激发波长。

由此可见，溶剂的拉曼光波长与被测溶质荧光的激发光波长有关。

4．×。

在一定条件下，物质的荧光强度与该物质在低浓度时呈线性关系。

因为公式

成立的条件之一是：

Ecl≤0.05。

5．×。

无论荧光化合物被激发到电子的哪个激发态，荧光光谱总是由电子的第一激发态的最低振动能级回到基态的各个振动能级扫描得到荧光光谱。

由此可见，荧光光谱的形状与激发波长无关。

6．×。

为了消除透射光对荧光测定的干扰，荧光分光光度计的光源必须与检测器垂直。

7．√。

分子受激发后，分子外层电子由能级的基态单重态〔S〕跃迁到激发单重态〔S*〕的各个振动能级。

然后通过振动弛豫、内转换回到第一激发单重态的最低振动能级，以辐射形式回到基态的各个振动能级，这时发射的光称为荧光；分子受激发后，由能级的基态单重态〔S〕跃迁到激发单重态〔S*〕，通过内转换、振动弛豫和体系间跨越，回到三重态〔T*〕的最低振动能级，然后以辐射形式回到基态的各个振动能级，这时发射的光称为磷光。

S→S*没有电子自旋的改变；S→T*伴随电子自旋的改变。

所以，发荧光时，电子能量的转移没有电子自旋的改变；发磷光时，电子能量的转移伴随电子自旋的改变。

8．×。

荧光分析法中与浓度相关的参数是荧光强度，测量荧光强度的方式是在入射光的直角方向，即在黑暗背景下检测所发射光的强度信号，因此可采用增加入射光强度或增大检测信号的放大倍数来提高灵敏度。

在分光光度法中与浓度相关的参数是吸光度，而吸光度A=lgI0/I，如果增大入射光强度，当吸收光强度一定时，相应也增大了透射光强度，所以其比值不会变化，如果增大检测器的放大倍数，检测到的入射光强度和透射光强度也同时增大，同样不能提高其比值，也就不能到达提高灵敏度的目的。

所以，荧光分析法的灵敏度比紫外分光光度法高，一般要高2~3个数量级。

9．√。

荧光量子产率又称荧光效率，它是指激发态分子发射荧光的光子数与基态分子吸收激发光的光子数之比，常用

表示。

其数学表达式为：

式中kf为荧光发射的速率常数，

为所有辐射失活和非辐射失活的速率常数之和。

由此可见，荧光量子产率

＜1。

10．√。

因为π→π*跃迁的摩尔吸收系数〔约104~105〕大于n→π*跃迁摩尔吸收系数〔约100〕，而π→π*跃迁的寿命〔约10-7~10-9s〕小于n→π*跃迁的寿命〔约10-5~10-7s〕。

因此，具有π→π*跃迁的化合物，易产生更强的荧光。

虽然具有n→π*跃迁的化合物，也可产生弱的荧光，但n→π*跃迁的寿命长，化合物有足够的时间产生体系间跨越，跃迁到激发三重态，另外，含n轨道的杂原子在跃迁过程中易产生顺磁性，使n→π*跃迁过程可能伴随电子自旋的改变，到达三重态。

所以具有n→π*跃迁共轭的化合物易产生更强的磷光。

四、有关概念及名词解释

1．单重态或单线态〔singlestate〕：

在给定轨道中的两个电子，必定以相反方向自旋，自旋量子数分别为1/2和-1/2，其总自旋量子数s=0。

电子能级的多重性用M=2s+1=1，即自旋方向相反的电子能级多重性为1。

此时分子所处的电子能态称为单重态或单线态，用S表示。

2．三重态或三线态〔tripletstate〕：

当两个电子自旋方向相同时，自旋量子数都为1/2，其总自旋量子数s=1。

电子能级的多重性用M=2s+1=3，即自旋方向相同的电子能级多重性为3，此时分子所处的电子能态称为三重态或三线态，用T表示。

3．振动弛豫〔vibrationrelaxation〕：

处于激发态最高振动能级的外层电子回到同一电子激发态的最低振动能级以非辐射的形式将能量释放的过程。

4．内部能量转换〔internalconversion〕：

简称内转换。

由高一级电子激发态以无辐射方式跃迁至低一级电子能级的过程。

5．荧光〔fluorescence〕：

分子受到激发后，无论处于哪一个激发单重态，都可通过振动弛豫及内转换，回到第一激发单重态的最低振动能级，然后以辐射形式回到基态的各个振动能级发射的光。

6．外部能量转换〔externalconversion〕：

简称外转换。

受激后的电子由第一激发单重态或激发三重态的最低振动能级以无辐射形式回到基态的各个振动能级的过程。

7．体系间跨越〔intersystemcrossing〕：

处于激发态分子的电子发生自旋反转而使分子的多重性发生变化的过程。

即分子由激发单重态以无辐射形式跨越到激发三重态的过程。

8．磷光〔phosphorescence〕：

分子受到激发后，无论处于哪一个激发单重态，都可通过内转换、振动弛豫和体系间跨越，回到第一激发三重态的最低振动能级，然后以辐射形式回到基态的各个振动能级发射的光。

9．延时荧光〔delayedfluorescence〕分子受到激发后，处于激发单重态，通过内转换、振动弛豫和体系间跨越，跃迁到第一激发三重态的最低振动能级，如果分子再次受激发，又回到一激发单重态，然后以辐射形式回到基态的各个振动能级发射的光。

10．激发光谱〔excitationspectrum〕：

在一定条件下，固定发射波长〔λem〕，扫描激发波长〔λex〕，记录荧光强度〔F〕，以荧光强度F对激发波长λex作图得到的曲线为激发光谱。

激发光谱说明不同激发波长的辐射引起物质发射某一波长荧光的相对效率。

激发光谱形状与吸收光谱相似。

11．荧光光谱〔fluorescencespectrum〕：

也称发射光谱〔emissionspectrum〕。

在一定条件下，固定激发波长〔λex〕，扫描发射波长〔λem〕，记录荧光强度〔F〕，以荧光强度F对发射波长λem作图得到的曲线为荧光光谱。

荧光光谱说明不同发射波长下，荧光物质发荧光的相对强度。

12．荧光寿命：

指除去激发光源后，分子的荧光强度降低到最大荧光强度的1/e所需的时间，常用τf表示。

荧光寿命是荧光物质的特性参数，利用荧光寿命可对荧光物质进行定性分析。

利用混合物中各荧光物寿命的差异，对荧光混合物进行不经别离同时测定。

13．荧光效率：

又称荧光量子产率。

是激发态分子发射荧光的光子数与基态分子吸收激发光的光子数之比，常用

表示。

五、计算题

1．解：

20片复方炔诺酮片中含炔雌醇应为31.5~38.5μg，

根据题意炔雌醇的低浓度为：

（μg/ml）

炔雌醇的高浓度为：

（μg/ml）

已知：

csμg/mL，Fs=65

由

合格片的荧光读数应在什么范围内58.5~71.5之间。

2．解：

25mL氧化液的读数为6.0格，即F0=6.0，作为空白。

25mL加入少量Na2S2O4转化为核黄素F=55，

扣除空白，试液读数：

Fx=F-F0=55-6.0=49

24mL氧化液+1mL标准溶液F=92，扣除空白，标液读数：

Fs=F-F0=92-6.0=86

已知：

标准溶液浓度cs=0.5（μg/mL）

根据

，

（μg/ml）

每克谷物中核黄素的质量分数为：

（μg/g）

3．解：

①利用表中的数据计算F0/F

Stem-Volmer方程为：

由F0/F对[Cl-]进行线性回归，得Stem-Volmer方程：

淬灭常数：

（L/mmol）=112（L/mol）

②淬灭剂存在下荧光分子的平均寿命

和没有淬灭剂存在下荧光分子的平均寿命

不同，

＜

。

所以，经过推导Stem-Volmer方程又可表示为：

当淬灭剂[Cl-]=103mmol/L，SPQ在血清中的寿命：

由上推导可以得出：

荧光相对强度：

③如果[Cl-]=75mmol/L

SPQ在血清中的寿命：

荧光相对强度：