实验一压片法观察蚕豆根尖细胞的有丝分裂.docx

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实验一压片法观察蚕豆根尖细胞的有丝分裂

【有丝分裂——背景知识】

孟德尔1865年公开报告其豌豆杂交的实验结果（分离实验和自由组合实验），并于翌年以论文形式发表。

孟德尔逝世16年后的1900年，他通过豌豆杂交实验引出的遗传定律分别被三位科学家证实后才重见天日，从而奠定了经典遗传学的科学基础。

之后，遗传学作为一门学科正式诞生。

遗传学（Genetics），是研究生物的遗传与变异的科学。

从1900年发展至今，已有一个多世纪的历史。

随着研究的深入，遗传学的研究从经典遗传学——基因组学迈进，现代遗传学是研究基因的结构、功能及其变异、传递和表达规律的学科。

遗传学的研究范围包括遗传物质的本质、遗传物质的传递和遗传信息的实现三个方面。

遗传物质是什么？

DNA是主要的遗传物质。

（说明：

DNA是一种遗传物质，并且占有重要地位；同时，除了DNA，还有RNA等）。

染色体是细胞DNA的主要载体。

——从染色体水平认识遗传物质

【遗传】：

就是子代在这个连续系统中重复亲代的特性和特征（性状）的现象，其实质则是由于亲代所产生的配子，带给子代按亲代性状进行发育的遗传物质──基因。

细胞分裂是生物实现生长与繁殖的必要方式。

在细胞分裂过程中，作为遗传物质主要载体的染色体通过一系列有规律的变化使自己得到合理分配，保证遗传物质能从母细胞精确地传递给子细胞，从而保证生物的正常生长、发育和物种的连续性和稳定性。

染色体在细胞分裂过程中承担着关乎生物遗传与变异的主要角色．因此染色体在细胞分裂过程中的形态与行为、数量与质量等变化特点及其所带来的结果是本节关注的核心内容，这也是理解掌握遗传学基

细胞分裂的方式包括有无丝分裂（amitosis）和有丝分裂（mitosis）。

减数分裂（meiosis）是特殊的有丝分裂。

种组织中也自。

发现。

如植物的薄壁组织细胞、木质部细胞、绒毡层细胞、愈伤组织以及小麦的分蘖节、胚乳细胞等都发现过无丝分裂；动物的胎膜、填充组织和肌肉组织以及一些肿瘤和愈伤细胞等也经常可以观察到无丝分裂的发生。

无丝分裂不像有丝分裂那样经过染色体有规律、准确的分裂过程，因此，无丝分裂的结果可能会使遗传物质不能平均分配．从而导致细胞间的稳定性较差。

无丝分裂又称为直接分裂（directdivision）。

当细胞生长到一定程度后，细胞核开始拉长．渐渐缢裂成两部分．接着细胞质也分裂，从而成为2个子细胞（图1-12）。

因为在整个分裂过程中看不到纺锤丝，所以被称为无丝分裂。

高等生物的细胞增殖和个体生长是通过细胞的多次有丝分裂完成的。

【减数分裂是一种特殊的有丝分裂】

【有丝分裂的过程】

从细胞上一次分裂结束到下一次分裂完成的整个过程称为细胞周期（cellcycle）。

细胞周期是一个连续的动态变化过程，但为了便于描述，可以人为地将其划分为一个分裂间期（interphase）和一个分裂期（mltosis，M）。

有丝分裂是一个连续过程，可分为前期、中期、后期和末期。

有丝分裂在整个细胞周期中约占5-10%的时间，而其余大部分时间是处于细胞连续两次分裂之间的间期。

——有丝分裂间期：

生物体细胞有90%-95%的细胞都处在分裂间期。

分为G1（DNA合成前期）、S（DNA合成期）、G2（DNA合成后期）三个阶段，其中G1期与G2期进行RNA（即核糖核酸）的复制与有关蛋白质的合成，S期进行DNA的复制；其中，G1期主要是染色体蛋白质和DNA解旋酶的合成，G2期主要是细胞分裂期有关酶与纺锤丝蛋白质的合成。

在有丝分裂间期，染色质没有高度螺旋化形成染色体，而是以染色质的形式进行DNA（即脱氧核糖核酸）单链复制。

有丝分裂间期是有丝分裂全部过程重要准备过程，是一个重要的基础工作。

——有丝分裂期：

【前期：

膜仁失，两体现；

中期：

体列中，数清晰；

后期：

点裂增，体均分；

末期：

前期反，中现板】

前期：

自分裂期开始到核膜解体为止的时期。

核内染色质逐渐浓缩为细长而卷曲的染色体，每一染色体含有两个染色单体，它们具有一个共同的着丝点；核仁和核膜逐渐模糊不明显。

（植物细胞出现纺锤丝；动物细胞靠近核膜出现两个中心体）

中期：

形成纺锤体，纺锤丝与染色体的着丝点相连，各染色体排列在赤道板上，chr分散，鉴定形态、数目（根据生物种类而存在差异，具有种类特异性）。

后期：

各chr着丝点分裂为二，其子染色体相应地分开，并随着纺锤丝的收缩而移向两极，每极有一组chr，数目和原来的相同，子染色体到达两极标志后期结束，末期开始。

末期：

到达两极的子染色体，开始解螺旋、疏松细长，核膜核仁逐渐重现，一个母细胞有两个子核，各自组成新的细胞核，细胞质分裂，细胞中间形成细胞板阻断纺锤丝（植物细胞在细胞质中央赤道板处形成新的细胞壁），使细胞分裂为二，形成二个子细胞。

这时细胞进入分裂间期。

【有丝分裂的时长】因物种和环境而存在差异；一般，前期1-2h;其他5-30min.

【有丝分裂发生的部位】：

高等植物有丝分裂主要发生在根尖、茎生长点、幼叶等部位的分生组织。

根尖取材容易，操作和鉴定方便，故一般采用根尖作为观察有丝分裂的材料。

【有丝分裂的意义】

有丝分裂中，染色体复制一次，细胞分裂一次，染色体精准的分配到两个子细胞中去，使得子细胞与母细胞具有同样数量与质量的遗传信息，既维持生物个体的正常生长和发育（组织及细胞间遗传组成的一致性）；又保证物种的连续性和稳定性（单细胞生物及无性繁殖生物个体间及世代间的遗传组成的一致性）。

实验一压片法观察蚕豆根尖细胞的有丝分裂

【教学目的】

1、使学生明确有丝分裂在生物体遗传和发育过程中的重要作用。

2、让学生掌握植物根尖细胞有丝分裂各时期染色体的变化及特征。

3、掌握植物压片的制作方法。

【教学重难点】

植物压片的制作方法和根尖细胞有丝分裂各时期染色体的辨别。

【教学过程】

——明确实验目的

——提问：

有丝分裂的意义及实验原理

——实验过程与步骤

——指导学生实验、观察

——提问、总结有丝分裂各时期染色体变化及特征

——学生完成实验报告，总结

一、实验目的

1、观察植物根尖的细胞有丝分裂各个时期染色体的变化及特征；

2、掌握植物压片方法。

二、实验原理

【前述】

三、实验材料：

蚕豆根尖（2n=12）

四、实验器材：

培养皿、培养箱、纱布、指形管（青霉素小瓶）、冰瓶、载玻片、盖玻片、镊子、酒精灯、解剖针、吸水滤纸、显微镜、等等。

五、实验试剂：

酒精、0.01-0.2%秋水仙素溶液/对二氯苯饱和水溶液/100ml对二氯苯饱和水溶液加1-2滴α-溴萘/0.002M8-羟基喹啉、卡诺氏液（冰乙酸：

无水乙醇=1：

3或冰乙酸：

氯仿：

无水乙醇=1；3：

6）、1mol/L盐酸、1%醋酸洋红或1%龙胆紫、等等。

六、实验步骤：

1、取材：

先将蚕豆种子浸泡1天，待吸水膨胀后移到铺有几层吸水纸的培养皿内，上面盖两层湿纱布加不少许，置于25℃（黑暗）培养40-50小时。

待根长至1-2cm时，于上午10时左右或下午4时左右剪取。

2、预处理：

目的：

使获得中期分裂相较多的细胞，使染色体缩短，分散，便于压片观察。

预处理机理：

阻止或破坏纺纺锤体微管的形成，使有丝分裂过程被抑制在分裂中期阶段，以便累积较多的处于分裂中期的分裂相；导致chr高度浓缩、变短，利于chr的分散。

方法1:

冷冻处理：

根尖放入盛蒸馏水的指形管中，置于冰水共存的冰瓶中，然后把冰瓶放到0—3℃的冰箱中处理24小时。

染色体数较多的实验材料可适延长时间（20—40小时），但需注意勿使材料结冰。

方法2:

药剂处理：

a.0.01-0.2%秋水仙素溶液处理2-4h

b.对二氯苯饱和水溶液处理3-4h

c.100ml对二氯苯饱和水溶液加1-2滴α-溴萘处理3-4h

d.0.002M8-羟基喹啉处理3-4h

药剂处理时温度不能过高,以10-15℃为宜。

3、固定：

目的：

借助于物理方法或化学药剂的作用，迅速透入组织和细胞将之杀死，并且使其结构和内含物如：

蛋白质，脂肪，糖类以及核物质与细胞器等，在形态结构上尽可能保持生活时的完整和真实状态，同时更易于染色，可以较清楚的显现细胞在生活时不易看清的结构。

操作：

净处理的材料卡诺氏液（冰乙酸：

无水乙醇=1：

3或冰乙酸：

氯仿：

无水乙醇=1；3：

6）固定24h可立即使用；若不立即使用，可置于95%酒精30min后置入80%酒精中30min再置入70%酒精。

4℃下保存，若保存时间较长需要重新固定后再用。

（以上三步实验员已做，我们从第4步开始做。

）

4、解离：

目的：

去除未固定的蛋白质,同时使胞间层的果胶类物质解体，细胞分散而易于观察。

操作：

1）从培养皿里取出1条根置于表面皿中，用蒸馏水冲洗3-4次（废水入塑料杯）。

2）根洗净后，加入数滴1N盐酸于表面皿中，以浸泡住根为准。

3）用镊子夹住表面皿边缘在酒精灯上间歇式加热2-4分钟（发现盐酸溶液有气泡冒出时，立即远离火焰），用镊子尖夹根是否已经变软，若变软，则说明已解离好，否则继续解离。

（乳白色，经解离，变化为透明状）。

5、染色及压片：

原理：

染色体容易被碱性燃料染成深色。

蛋白质分子中氨基呈碱性，易与碱性染料结合。

龙胆紫或醋酸洋红溶液呈酸性，但其却是碱性染料，因为酸碱性染色剂的界定并非由染料溶液的pH值决定，而是根据染料物质中助色基团电离后所带的电荷来决定，带正电荷，即阳离子，则为碱性；带负电荷，即阴离子，则为酸性。

既然染色液的pH小于7，则只能与碱性的相结合，在染色体中为碱性的是蛋白质分子中的氨基，而非DNA分子。

染色体染色剂配方：

1、醋酸-洋红染液：

取45毫升冰醋酸，加蒸馏水55毫升，煮沸后徐徐加入洋红1克，搅拌均匀后加入1颗铁锈钉，煮沸10分钟，冷却后过滤，贮存在棕色瓶内。

2、醋酸-地衣红染液：

取45毫升醋酸，跟55毫升蒸馏水相混，加热，徐徐加入地衣红粉末1～2克，搅拌溶解后，缓缓煮沸2小时。

冷却后过滤，贮存在棕色瓶里。

3、醋酸—龙胆紫溶液：

将0.5克龙胆紫溶解在100毫升2%醋酸溶液中配制成0.5%龙胆紫溶液。

用99.5%醋酸（密度为1.049g/ml）,配1000ml2%的醋酸,则用99.5%醋酸体积为（1000*2%）/1.049=19.1ml.

4、甲苯胺蓝染液取0.5克甲苯胺蓝，溶解在100毫升蒸馏水中，即成0.5%甲苯胺蓝水溶液。

5、龙胆紫染液取1克龙胆紫，用少量蒸馏水（乙醇）溶解后，加蒸馏水（乙醇），稀释到100毫升，保存在棕色瓶内。

操作：

1）将解离好的根用蒸馏水冲洗干净后，加几滴醋酸洋红于表面皿内，在灯上加热，注意来回快速往返或加热的同时，不要加热到沸腾状态，若沸腾马上停止加热。

（增加根染色程度）

2）取一根已染过色的根放在载玻片上，用镊子夹取根尖1.5mm长度处，加一滴醋酸洋红染料，在火焰上来回烤几下。

3）再加一滴1%的醋酸洋红溶液，盖上盖玻片用解剖针的反头垂直轻敲盖玻片，使根尖压成一薄层。

（多余的染料用纸吸干）。

压片时注意不要再移盖片，否则会造成更多细胞生重叠。

反复加醋酸洋红染料->加热-敲片，最后形成薄雾状。

6、镜检：

先在10X，找到分裂相后再换40倍X观察，并绘图。

（清洗液：

乙醚：

无水乙醇＝7：

3）

七、分析结果：

1、制出几张好片子，当堂验收，观察到明显的中期等分裂相。

进行绘图，加以文字说明。

2、对实验过程中出现的各种问题进行分析和讨论。

（1）1mol/L盐酸;卡诺氏液（冰乙酸：

无水乙醇=1：

3）,1%龙胆紫溶液

（2）根尖预处理、固定的目的是什么，是否还有其他的操作方法？

附：

蚕豆根尖细胞有丝分裂各时期图