中药活性指标成分阿克苷制备及鉴定.docx

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中药活性指标成分阿克苷制备及鉴定

附件1

中药活性指标成分阿克苷（Acteoside）的制备与鉴定

何江1，胡小鹏2，邱榕珠3,马文杰3，李涛2

1.深圳大学医学院

2.深圳大学生命科学学院

3.深圳大学化学与化工学院

摘要：

本实验以苦丁茶木犀科植物紫茎女贞（Ligustrumpurpurascens）叶为原料，通过高效快速的分离纯化方法，制备得到目标化合物。

目标化合物经结构鉴定为阿克苷（acteoside）。

关键词：

阿克苷紫茎女贞制备鉴定

概述

阿克苷（Acteoside），又名洋丁香酚苷（《中华本草》）、洋丁香苷（《中药辞海》）、毛蕊花苷、马鞭草苷、麦角甾苷等。

1963年罗马大学，M.L.Scarpati首先报道从植物Verbascumsinuatum中分离到阿克苷（acteoside）[1]。

根据现有的文献查询分析，阿克苷广泛分布于双子叶植物中，含阿克苷的植物包括：

唇

阿克苷（acteoside）分子结构

形科（Labiatae）15属41种，紫薇科（Bignoniaceae）4属5种，木犀科（Oleaceae）7属12种，列当科（Orobanchaceae）5属10种，玄参科（Scrophulariaceae）21属34种，马钱科（Loganiaceae）2属7种，马鞭草科（Verbenaceae）12属31种，车前科（Plantaginaceae）2属7种，爵床科（Acanthaceae）2属3种，木兰科（Magnoliaceae）1属2种，苦槛蓝科（Myoporaceae）1属1种，蓼科（Polygonaceae）1属1属，菊科（Compositae）1属1种，胡麻科（Pedaliaceae）1属1种，桔梗科（Campanulaceae）1属1种，胡椒科（Piperaceae）1属1种，苦苣苔科（Gesneriaceae）1属1种，蔷薇科（Rosaceae）1属1种，共计79属160种植物。

现代药理研究表明阿克苷具有多种生理活性：

抗氧化，抗病毒，保肝，抗肿瘤转移，抗炎，降血脂，抗菌，神经保护，降血压和心血管保护等[2]。

由于阿克苷具有多种生理活性，且分布广泛，资源丰富，因此对其药用价值的研究已成为天然药物研发的新热点。

阿克苷属新一类天然活性结构分子，随着药理研究的不断深入，必将为其带来广泛的临床应用前景。

阿克苷为苯丙素苷类成分，可溶于醇类有机溶剂，溶于水，极性大，阿克苷分子结构对热和光不稳定，分离纯化难度大。

探索高效快速制备和鉴定的方法，有益于阿克苷的药物研究和开发。

实验部分

一、实验仪器及试剂

比旋度J―20C旋光光谱仪测定，紫外光谱用UV―210A型紫外光谱仪测定，红外光谱用IR―450型红外光谱仪测定，核磁共振谱用WH―400型核磁共振仪测定，FAB―MS用JAB―HS测定。

层析柱材料用硅胶，D101大孔吸附树脂，SephadexLH-20。

薄层层析用高效硅胶G板（HPTLC,silicagel,Merck）,展开剂为CHCl3―MeOH―H2O（7:

3:

。

有机溶剂用甲醇，乙醇和氯仿等。

二、提取及分离

称量g干燥的苦丁茶紫茎女贞（Ligustrumpurpurascens）叶，剪碎，放入10L加热回流提取磨口器皿中，加入5LMeOH，加热回流2小时后，静置放凉，然后过滤，得提取液H1；随后，再重复操作一次，得提取液H2（提取流程见图1）。

合并两次提取液H1和H2,并减压浓缩，得甲醇提取物g。

在甲醇提取物g中加入4L纯净水，充分搅拌混匀，然后静置一小时，滤出上清液，如此反复操作三次，将所得的上清液合并，并直接上D101树脂（1500g）层析柱分离。

D101树脂层析柱分别用纯净水、50%甲醇和甲醇洗脱，得到三组馏分：

Ag），Bg）和Cg）。

所得A、B、C三部分，经TLC检测[硅胶G，展开系统CHCl3―MeOH―H2O（7:

3:

],B部分含有阿克苷。

B部分（g）经硅胶层析，干柱切割法，得到三部分：

Eg）、F和G（g）。

将含有阿克苷的F部分进行硅胶柱层析，以CHCl3―MeOH―H2O溶剂系统洗脱得到7组馏分（如图1所示）。

其中F3部分（g）再进行一次硅胶柱层析分离，得到粗品Mg。

粗品M再经SephadexLH-20柱层析纯化得到Mg。

图1阿克苷提取及分离纯化

三、纯度检测

经色谱层析纯化得到的Mg），其纯度进行高效液相（HPLC）检测。

检测条件为：

1.仪器：

安捷伦1200（Agilent1200）高效液相仪

2.检测波长：

227nm

3.分析柱：

C-18column（HypersilODS,250⨯MM）

4.柱温：

4℃

5.流速：

1ml/min

6.样品浓度：

1mg/ml

7.进样量：

5μl

8.洗脱条件：

起始洗脱比例为H2O―acetonitrile（80:

20,v/v）;时间程序为0―25min,洗脱比例由0―100%acetonitrile

通过高效液相色谱检测，从苦丁茶紫茎女贞叶中分离纯化得到的M其纯度为%。

四、结构鉴定

1．显色反应[3]

1）FeCl3显色：

将少许M试样溶于10ml适量的甲醇中，用毛细管取样，并在硅胶TLC板上点样，用风筒将斑点吹干，然后用10%FeCl3水溶液在TLC上喷雾，此时观察到斑点呈墨兰色。

2）KOH水溶液显色：

取少许M试样放入一小试管中，用甲醇溶解，然后滴加10%KOH水溶液二至三滴，溶液呈深黄色。

2．比旋度测定:

[α]D24―（c,MeOH）

3．紫外光谱λmax（EtOH）nm，（logε）（如图3所示）

在210―240nm区间，出现225和248（）吸收，表明化合物M结构中含有α、β不饱和酰基和苯环官能团。

288（）为苯环的弱吸收甙，而335（）吸收为结构中的π→π*电子跃迁的吸收带峰。

4．红外光谱IRνmaxKBr,cm―1（如图4所示）

3450吸收宽峰表明M分子中存在多―OH基团，1690与1660为共轭α、β不饱和酰基的特征吸收峰，1510和1440为双键和苯环骨架振动吸收。

5.1H―NMR核磁共振谱

如图5所示，化合物M的1H―NMR谱图在―ppm低磁场共振范围内出现6个苯环质子信号，属于两个ABX自旋系统。

δ和的两组二重峰，J=Hz，为咖啡酰基的反式双键质子信号；而δ（2H,J=Hz）、（1H,t,J=Hz）和（1H,m）分别为苯乙醇基质子信号。

在1H―NMR谱中可观察到β-D-葡萄吡南糖基和α-L-鼠李吡喃糖基的端基质子信号。

化合物M的1H―NMR化学位移信号归属如下：

Aglycone（3,4-dihydroxyphenylethyl）:

（1H,d,J=Hz,H-2）,（1H,d,J=Hz,H-5）,（1H,dd,J=,Hz,H-6）,（2H,t,J=Hz,H2-7）,（1H,t,J=Hz,H-a）,（1H,m,H-8b）

Glucosyl:

（1H,d,J=Hz,H-1'）,―（m,2',3'and5'）,（1H,t,J=Hz,H-4'）,（1H,dd,J=12,Hz,H-6'）,（1H,dd,J=12,Hz,H-6'）

Rhamnosyl:

（1H,d,J=Hz,H-1"）,―（m,2"and3"）,（1H,t,J=Hz,H-4"）,（m,H-5"）,（3H,d,J=Hz,H3-6"）

Caffeoyl:

（1H,d,J=Hz,H-2"'）,（1H,dd,J=Hz,H-5"'）,（1H,dd,J=,Hz,H-6"'）,（1H,d,J=Hz,H-7"'）,（1H,dd,J=,Hz,H-8"'）

图5化合物M的1HNMR图谱

6.13C―NMR核磁共振谱

化合物M的13CNMR图谱（见图6）显示29个碳信号，与文献报道数据比较[4]，其碳化学位移信号得到归属：

Aglycone（3,4-dihydroxyphenylethyl）:

（C-1）,（C-2）,（C-3）,（C-4）,（C-5）,121（C-6）,（C-7）,（C-8）

Glucosyl:

（gluC-1'）,（gluC-2'）,（gluC-3'）,（gluC-4'）,（gluC-5'）,（gluC-6'）,

Rhamnosyl:

（rhaC-1"）,（rhaC-2"）,（rhaC-3"）,（rhaC-4"）,（rhaC-5"）,（rhaC-6"）

Caffeoyl:

（C-1"'）,（C-2"'）,（C-3"'）,（C-4"'）,（C-5"'）,（C-6"'）,（C-7"'）,（C-8"'）

图6化合物M的13CNMR图谱

7.FAB-MS谱图

化合物M的FAB-MS图谱显示，亚分子离子峰[M+H]+为625，分子式可推定为C29H36O15。

图7化合物M的FAB-MS图谱

8.结果

以苦丁茶紫茎女贞为原料，经提取纯化，得到化合物g,经HPLC测定，其纯度为%。

通过以上物理化学性质和波谱学的数据进行结构推定，化合物M的分子结构应为：

2―（3,4―二羟基苯）乙基―[3―O―α―L-鼠李吡喃糖基][4―O―反式咖啡酰基]―O―β―D―葡萄吡喃糖苷，即该化合物M与已知成分阿克苷（acteoside）一致[5]。

讨论

按照课题立项的要求，现已如期完成。

从苦丁茶紫茎女贞叶中分离得到目标化合物阿克苷g，纯度为%，所分离纯化得到的阿克苷结构经波谱学和化学方法得到鉴定。

阿克苷为天然多酚类成分，极性大，分子结构对热和光敏感，不稳定，分离纯化难度大。

针对阿克苷分子极性大，不稳定，分离难度大的具体问题，我们应用新方法，大大提高了阿克苷的分离纯化速度和效率。

所采用的新方法有：

1）在本实验中采用浸膏水萃取法，克服以往混悬水相亲脂溶剂梯度萃取法时间长、易乳化、成分交叉等问题；2）将浸膏水萃取的上清液，直接加样进行大孔吸附树脂柱层析分离，省去了萃取相水液的浓缩步骤，本方法不仅节省了人力物力，更避免了阿克苷分子在浓缩过程中的分解，此属本实验室开发创立的新方法；3）在硅胶层析分离时，采用干柱切割法，将原本需要进行2个多月层析的实验，缩短为一周时间，大大提高了柱层析分离的效率。

通过本次实验，建立了阿克苷的高效快速分离法，为阿克苷资源开发以及产业化奠定了良好的提取纯化工艺。

参考文献

1．ScarpatiML,DelleMonacheF

IsolationfromVerbascumsinuatumoftwonewglucosides,verbascosideandisoverbascoside.

AnnalidiChimica（Rome,Italy）1963;53:

356―67

2.HeJ,HuXP,ZengY,LiY,QiuRZ,MaWJ,LiT,LiCY,HeZD

AdvancedResearchofActeosideforChemistryandBioactivities.

NatProdResDev2010（submitted）

3．贺震旦，杨崇仁

植物中苯丙素甙成分研究进展

天然生物研究与开发1989；1

（2）：

29―40

4.贺震旦，刘玉清，杨崇仁

云南植物研究1992；14（3）：

328―336

5.贺震旦，王德祖，杨崇仁

云南植物研究1990；12（4）：

439―446