赤芍总苷提取纯化与质量检查设计方案.docx

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赤芍总苷提取纯化与质量检查设计方案

赤芍总苷的提取纯化与质量检查设计方案

文献背景

赤芍为毛茛科植物芍药.或川赤芍的干燥根，具有清热凉血、散瘀止痛的功效，其主要有效成分为芍药苷、芍药内酯苷、氧化芍药苷、苯甲酰芍药苷、芍药花苷等单萜苷类化合物，总称赤芍总苷，可改善机体微循环，抑制血小板凝聚，抗血栓形成，具有广泛的药理活性[]，是一种可用于保健食品的中药。

1.1赤芍总苷背景意义

在药理学上，赤芍总苷对血液具有抗凝血、抗血栓以及抗内毒素和改善微循环的作用。

并且赤芍总苷对缺血性损伤如心肌缺血同样具有保护作用[]，正是这样的良好使用疗效，我们需要对赤芍总苷进行更多的研究，来保证临床的使用疗效。

提取研究现状

目前报道的赤芍总苷提取工艺文献中，多采用正交试验设计法[]。

即分别称取赤芍药材若干（通常），以不同的提取液（水、乙醇）分别按正交试验设计表试验，滤过，合并滤液，量取体积，即得正交试验各试验的提取液。

纯化研究现状

目前报道的赤芍总苷纯化工艺文献中，多采用正丁醇萃取法和大孔树脂吸附法[]。

即将提取过程中，包括糖类、脂类等许多杂质在内的浸膏提取液，补充蒸馏水至药材的倍量，作为待纯化样品溶液。

纯化方法（正丁醇萃取法）：

取上述待纯化样品溶液，取等量石油醚萃取次，除去石油醚层，然后用水饱和后的正丁醇萃取次，收集正丁醇层，再用蒸馏水洗次，弃去水层，减压回收正丁醇，所得浸膏于真空干燥器中干燥。

纯化方法（大孔树脂吸附法）：

大孔吸附树脂，经乙醇浸泡，充分溶胀后装柱，蒸馏水洗至无醇味，备用。

上述待纯化样品溶液取，上树脂柱，倍量蒸馏水洗，再用倍量的乙醇洗脱，收集洗脱组分，减压回收乙醇，剩余浸膏于真空干燥器中干燥。

质量控制

赤芍中赤芍总苷质量控制包括性状鉴别（颜色、气味）、薄层鉴别（蓝紫色斑点）、以及对其进行高效液相色谱的含量测定（检测波长为，理论板数按芍药苷峰计算应不低于）以及水分、炽灼残渣，重金属等检测。

赤芍饮片的质量检查

性状:

本品应呈圆柱形，稍弯。

表面棕褐色，粗糙，有纵沟和皱纹，并有须根痕和横长的皮乳样突起，有的外皮易脱落。

质硬而脆，易折断，断面粉白色或粉红色，有的有裂隙。

气微香，味微苦、酸涩。

鉴别:

取本品粉末，加乙醇，振摇分钟，滤过，滤液蒸干，残渣加乙醇使溶解，作为供试品溶液。

另取芍药苷对照品，加乙醇制成每含的溶液，作为对照品溶液。

照薄层色谱法（附录Ⅵ）试验，吸取上述两种溶液各μ，分别点于同一硅胶薄层板上，以三氯甲烷乙酸乙酯甲醇甲酸（：

：

：

）为展开剂，展开，取出，晾干，喷以香草醛硫酸溶液，加热至斑点显色清晰。

供试品色谱中，在与对照品色谱相应的位置上，显相同的蓝紫色斑点。

含量测定：

照高效液相色谱法（通则）测定。

色谱条件与系统适用性试验

以十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂；以甲醇磷酸二氢钾溶液（：

）为流动相；检测波长为。

理论板数按芍药苷峰计算应不低于。

对照品溶液的制备

取经五氧化二磷减压干燥器中干燥小时的芍药苷对照品适量，精密称定，加甲醇制成每含的溶液，即得。

供试品溶液的制备

取本品粗粉约，精密称定，置具塞锥形瓶中，精密加入甲醇，称定重量，浸泡小时，超声处理分钟，放冷，再称定重量，用甲醇补足减失的重量，摇匀，滤过，取续滤液，即得。

测定法

分别精密吸取对照品溶液与供试品溶液各μ，注入液相色谱仪，测定，即得。

本品含芍药苷（）不得少于。

参考文献：

版《中国药典》

赤芍总苷的提取工艺

指标成分的选择及含量测定

赤芍中所含丰富的苷类成分总称赤芍总苷，为赤芍的主要活性部位，其中以芍药苷的含量最高，选择芍药苷作为含量测定的指标成分。

色谱条件的优化选择

色谱柱的选择：

考察（*μ）和（*μ）

流动相选择：

流动相考察甲醇水系统、甲醇磷酸溶液系统、乙腈水及乙腈磷酸溶液系统。

流速选择：

流速考察、、

对照品溶液的制备

精密称取芍药苷对照品，置量瓶中，加甲醇溶解并稀释至刻度，摇匀，即得对照品贮备液（每含芍药苷对照品μ）。

标准曲线的制备

分别精密量取对照品贮备液溶液（μ）、、、、、置容量瓶中，加甲醇稀释至刻度，摇匀。

精密量取上述不同浓度对照品溶液各μ注入液相色谱仪，按前述色谱条件分别测定其峰面积。

以对照品浓度为横坐标，峰面积积分值为纵坐标，绘制标准曲线。

供试品溶液的制备及测定

取提取液，稀释至一定体积，滤过，即得供试品溶液。

分别精密吸取对照品溶液与供试品溶液各μ，注入液相色谱仪，测定，由外标一点法计算即得芍药苷含量。

提取溶媒的筛选：

赤芍中所含苷类成分极性较大，在水、乙醇等亲水性溶剂中溶解度较好。

本实验以芍药苷的含量为评价指标，考察水和不同浓度的乙醇对芍药苷的提取效率，筛选赤芍药材的最佳提取溶媒。

见表：

表不同提取溶媒芍药苷含量

提取溶媒

水

乙醇

乙醇

溶媒用量（倍）

提取次数（次）

提取时间（）

芍药苷含量（）

正交试验设计优化提取工艺

因素水平设置

溶剂法提取中影响提取效率的因素主要有溶媒用量、提取时间及提取次数等。

根据实际情况，设置醇用量、提取时间及提取次数为个考察因素，因素水平设置见表。

表因素水平表

因素水平

提取溶媒

（倍）

提取时间

（）

提取次数

（次）

实验安排及结果

考察影响提取效能的主要因素乙醇用量、提取时间、提取次数及相应水平，选取正交表（）作正交试验，所选因素一水平见表。

称取川赤芍药材约，按（）正交试验表按排试验，以芍药苷含量（芍药苷含量提取液中芍药苷质量称取的药材量*）为评价指标。

试验方案见表

表（）正交试验表

表头芍药苷含量

（）

列号

验证试验

以优化工艺条件重复试验次，验证试验结果见表

表验证试验结果

试验试验号投料量固形物固形物芍药苷芍药苷

方案（）得率平均得率含量平均含量

（）（）（）（）（）（）

赤芍总苷（）的纯化工艺的优化

上样液预处理　

赤芍醇提液减压浓缩至无醇味，加水适量分散溶解、过滤定容，制成每毫升含生药（·）的溶液，备用。

大孔吸附树脂型号筛选　

取型和型大孔吸附树脂各，装于树脂柱中（径高比为），取样液上样。

先用蒸馏水，再用乙醇洗脱，合并乙醇洗脱液，测定，结果见表。

从芍药苷吸附解析率和残液中芍药苷含量综合考虑，选择树脂种类。

表树脂动态吸附实验结果

树脂型号

上样液含量

（）

吸附解吸率

（）

残液中含量

（）

上样浓度考察

取型大孔吸附树脂份，每份，装柱（径高比为），分别取含生药浓度为·、·、·样品液上样，吸附流速为·。

然后用水洗脱，再以乙醇洗脱，按色谱条件进行测定醇洗脱液中芍药苷含量，结果见表。

表　上样浓度考察结果

上样浓度（·）

芍药苷洗脱量（）

洗脱率（）

泄漏曲线考察　

取型大孔吸附树脂，装于树脂柱中（径高比），取样品液上样，吸附流速为·。

收集流出液，每为一流分。

按如下色谱条件测定，绘制泄漏曲线，确定最大上样量。

色谱条件：

色谱柱（×μ）；乙腈为流动相，水为流动相，按表进行梯度洗脱；流速·；柱温℃；检测波长。

表流动相梯度洗脱时间表

时间

流动相

流动相

吸附流速的考察　

取型大孔吸附树脂份，每份，装柱（径高比为），取样液上样，吸附流速分别为·、·、·。

进行动态吸附后，先用水洗脱，再用乙醇洗脱，按色谱条件进行测定，结果见表

表吸附流速考察结果

吸附流速（·）

芍药苷洗脱量（）

洗脱率（）

树脂径高比考察　

取直径依次为、、的树脂柱根，分别加入型大孔吸附树脂各，装柱（径高比为、、），取样液上样，吸附流速为·。

然后用水洗脱，再以乙醇洗脱，收集乙醇洗脱液，按色谱条件进行测定，结果见表。

表树脂径高比考察结果

树脂径高比

芍药苷洗脱量（）

洗脱率（）

水洗除杂体积考察　

取型大孔吸附树脂四份，每份，装柱（径高比），取样品液上样，吸附流速分别为·，进行动态吸附后，分别用、、和水洗，测定水洗脱液中芍药苷的含量，计算损失率，结果见表。

表　水洗除杂体积考察结果

·

水洗脱体积（）

水洗液中芍药苷累积含量（）

芍药苷累积损失率（）

洗脱溶剂考察　

取型大孔吸附树脂份，每份，装于树脂柱中（径高比为∶），样品液上样，吸附流速分别为·。

然后先以水洗脱，再分别用、、和乙醇洗脱，按色谱条件进行测定醇洗脱液中芍药苷含量，结果见表。

表　洗脱溶剂考察结果

洗脱剂乙醇（）

芍药苷洗脱量（）

洗脱率（）

洗脱曲线　

取型大孔吸附树脂，装于树脂柱中（径高比为），样品液上样，吸附流速分别为·。

然后先以水洗脱，再用乙醇洗脱，每收集一份，洗脱液减压至干，以甲醇复溶，按色谱条件进行测定醇洗脱液中芍药苷含量，绘制洗脱曲线，确定洗脱剂用量。

赤芍中赤芍苷提取物的质量控制

性状：

棕褐色粉末，气微香，味微苦、酸涩。

鉴别：

取本品粉末，加乙醇，振摇分钟，滤过，滤液蒸干，残渣加乙醇使溶解，作为供试品溶液。

另取芍药苷对照品，加乙醇制成每含的溶液，作为对照品溶液。

照薄层色谱法（通则）试验，吸取上述两种溶液各μ，分别点于同一硅胶薄层板上，以三氯甲烷乙酸乙酯甲醇甲酸（：

：

：

）为展开剂，展开，取出，晾干，喷以香草醛硫酸溶液，加热至斑点显色清晰。

供试品色谱中，在与对照品色谱相应的位置上，显相同的蓝紫色斑点。

含量测定：

照高效液相色谱法（通则）测定。

色谱条件

以十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂；以甲醇磷酸二氢钾溶液（）为流动相；检测波长为。

理论板数按芍药苷峰计算应不低于。

对照品溶液的制备

取经五氧化二磷减压干燥器中干燥小时的芍药苷对照品适量，精密称定，加甲醇制成每含的溶液，即得。

供试品溶液的制备

取本品粉末约，精密称定，置具塞锥形瓶中，精密加入甲醇，称定重量，浸泡小时，超声处理分钟，放冷，再称定重量，用甲醇补足减失的重量，摇匀，滤过，取续滤液，即得。

测定法

分别精密吸取对照品溶液与供试品溶液各μ，注入液相色谱仪，测定，即得。

将提取物中芍药苷含量换算成药材中芍药苷含量，对比药典，检查提取纯化工艺是否合适。

版《中国药典》中规定赤芍药材中含芍药苷（）不得少于。

系统适用性试验

线性关系考察吸取上述对照品溶液、、、、，分别置量瓶内，加甲醇稀释至刻度，摇匀，分别精密吸取μ注入液相色谱仪分析。

以进样量（μ）为横坐标，峰面积为纵坐标，绘制标准曲线并进行线性回归，结果见表：

表线性关系考察结果

芍药苷对照品（）

峰面积

精密度试验精密量取已知浓度的芍药苷对照品溶液μ，按液相色谱条件，进样测定次，结果见表：

表精密度试验结果

峰面积值

平均值

（）

稳定性试验取本品，制备供试品溶液，测定芍药苷于、、、、、小时内峰面积，结果见表：

表稳定性试验结果

时间（小时）

峰面积值

平均峰面积值

（）