标准的PCR反应体系.docx
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标准的PCR反应体系
标准的PCR反应体系
PCR反应体系与反应条件
--------------------------------------------------------------------------------
标准的PCR反应体系:
10×扩增缓冲液 10ul
4种dNTP混合物 各200umolL
引物 各10~100mol
模板DNA 01~2ug
TqDNA聚合酶 25u
g2+ 15mmolL
加双或三蒸水至 100ul
PCR反应五要素:
参加PCR反应的物质主要有五种即引物、酶、dNTP、模板和g2+
引物:
引物是PCR特异性反应的关键,PCR产物的特异性取决于引物与模板DNA互补的程度。
理论上,只要知道任何一段模板DNA序列,就能按其设计互补的寡核苷酸链做引物,利用PCR就可将模板DNA在体外大量扩增。
设计引物应遵循以下原则:
①引物长度:
15-30b,常用为20b左右。
②引物扩增跨度:
以200-500b为宜,特定条件下可扩增长至10kb的片段。
③引物碱基:
G+C含量以40-60%为宜,G+C太少扩增效果不佳,G+C过多易出现非特异条带。
ATGC最好随机分布,避免5个以上的嘌呤或嘧啶 核苷酸的成串排列。
④避免引物部出现二级结构,避免两条引物间互补,特别是3'端的互补,否则会形成引物二聚体,产生非特异的扩增条带。
⑤引物3'端的碱基,特别是最末及倒数第二个碱基,应严格要求配对,以避免因末端碱基不配对而导致PCR失败。
⑥引物中有或能加上合适的酶切位点,被扩增的靶序列最好有适宜的酶切位点,这对酶切分析或分子克隆很有好处。
⑦引物的特异性:
引物应与核酸序列数据库的其它序列无明显同源性。
引物量:
每条引物的浓度01~1umol或10~100mol,以最低引物 量产生所需要的结果为好,引物浓度偏高会引起错配和非特异性扩增,且可增加引物之间形成二聚体的机会。
酶及其浓度 目前有两种TqDNA聚合酶供应,一种是从栖热水生杆菌中提纯的天然酶,另一种为大肠菌合成的基因工程酶。
催化一典型的PCR反应约需酶量2。
5U(指总反应体积为100ul时),浓度过高可引起非特异性扩增,浓度过低则合成产物量减少。
dNTP的质量与浓度 dNTP的质量与浓度和PCR扩增效率有密切关系,dNTP粉呈颗粒状,如保存不当易变性失去生物学活性。
dNTP溶液呈酸性,使用时应配成高浓度后,以1NH或1Tris。
HCL的缓冲液将其PH调节到70~75,小量分装,-20℃冰冻保存。
多次冻融会使dNTP降解。
在PCR反应中,dNTP应为50~200umolL,尤其是注意4种dNTP的浓度要相等(等摩尔配制),如其中任何一种浓度不同于其它几种时(偏高或偏低),就会引起错配。
浓度过低又会降低PCR产物的产量。
dNTP能与g2+结合,使游离的g2+浓度降低。
模板(靶基因)核酸 模板核酸的量与纯化程度,是PCR成败与否的关键环节之一,传统的DNA纯化方法通常采用SDS和蛋白酶K来消化处理标本。
SDS的主要功能是:
溶解细胞膜上的脂类与蛋白质,因而溶解膜蛋白而破坏细胞膜,并解离细胞中的核蛋白,SDS还能与蛋白质
结合而沉淀;蛋白酶K能水解消化蛋白质,特别是与DNA结合的组蛋白,再用有机溶剂酚与氯仿抽提掉蛋白质和其它细胞组份,用乙醇或异丙醇沉淀核酸。
提取的核酸即可作为模板用于PCR反应。
一般临床检测标本,可采用快速简便的方法溶解细胞,裂解病原体,消化除去染色体的蛋白质使靶基因游离,直接用于PCR扩增。
RNA模板提取一般采用异硫氰酸胍或蛋白酶K法,
要防止RNse降解RNA。
g2+浓度 g2+对PCR扩增的特异性和产量有显著的影响,在一般的PCR反应中,各种dNTP浓度为200umolL时,g2+浓度为15~20mmolL为宜。
g2+浓度过高,反应特异性降低,出现非特异扩增,浓度过低会降低TqDNA聚合酶的活性,使反应产物减少。
PCR反应条件的选择
PCR反应条件为温度、时间和循环次数。
温度与时间的设置:
基于PCR原理三步骤而设置变性-退火-延伸三个温度点。
在标准反应中采用三温度点法,双链DNA在90~95℃变性,再迅速冷却至40~60℃,引物退火并结合到靶序列上,然后快速升温至70~75℃,在TqDNA聚合酶的作用下,使引物链沿模板延
伸。
对于较短靶基因(长度为100~300b时)可采用二温度点法,除变性温度外、退火与延伸温度可合二为一,一般采用94℃变性,65℃左右退火与延伸(此温度TqDNA酶仍有较高的催化活性)。
①变性温度与时间:
变性温度低,解链不完全是导致PCR失败的最主要原因。
一般情况下,93℃~94℃lmin足以使模板DNA变性,若低于93℃则需延长时间,但温度不能过高,因为高温环境对酶的活性有影响。
此步若不能使靶基因模板或PCR产物完全变性,就会导致PCR失
败。
②退火(复性)温度与时间:
退火温度是影响PCR特异性的较重要因素。
变性后温度快速冷却至40℃~60℃,可使引物和模板发生结合。
由于模板DNA比引物复杂得多,引物和模板之间的碰撞结合机会远远高于模板互补链之间的碰撞。
退火温度与时间,取决于引物的长度
、碱基组成及其浓度,还有靶基序列的长度。
对于20个核苷酸,G+C含量约50%的引物,55℃为选择最适退火温度的起点较为理想。
引物的复性温度可通过以下公式帮助选择合适的温度:
Tm值(解链温度)=4(G+C)+2(A+T)
复性温度=Tm值-(5~10℃)
在Tm值允许围,选择较高的复性温度可大大减少引物和模板间的非特异性结合,提高PCR反应的特异性。
复性时间一般为30~60se,足以使引物与模板之间完全结合。
③延伸温度与时间:
TqDNA聚合酶的生物学活性:
70~80℃150核苷酸S酶分子
70℃60核苷酸S酶分子
55℃24核苷酸S酶分子
高于90℃时,DNA合成几乎不能进行。
PCR反应的延伸温度一般选择在70~75℃之间,常用温度为72℃,过高的延伸温度不利于引物和模板的结合。
PCR延伸反应的时间,可根据待扩增片段的长度而定,一般1Kb以的DNA片段,延伸时间1min是足够的。
3~4kb的靶序列需3~4min;扩增10Kb需延伸至15min。
延伸进间过长会导致非特异性扩增带的出现。
对低浓度模板的扩增,延伸时间要稍长些。
循环次数 循环次数决定PCR扩增程度。
PCR循环次数主要取决于模板DNA的浓度。
一般的循环次数选在30~40次之间,循环次数越多,非特异性产物的量亦随之增多。
PCR技术概论
聚合酶链反应(PolymerseCinReion,PCR)是80年代中期发展起来的体外核酸扩增技术。
它具有特异、敏感、产率高、快速、简便、重复性好、易自动化等突出优点;能在一个试管将所要研究的目的基因或某一DNA片段于数小时扩增至十万乃至百万倍,使肉眼能直接观察和判断;可从一根毛发、一滴血、甚至一个细胞中扩增出足量的DNA供分析研究和检测鉴定。
过去几天几星期才能做到的事情,用PCR几小时便可完成。
PCR技术是生物医学领域中的一项革命性创举和里程碑。
PCR技术简史
PCR的最早设想核酸研究已有100多年的历史,本世纪60年代末、70年代初人们致力于研究基因的体外分离技术,Korn于1971年最早提出核酸体外扩增的设想:
“经过DNA变性,与合适的引物杂交,用DNA聚合酶延伸引物,并不断重复该过程便可克隆RNA基因”。
PCR的实现1985年美国PE-Ceus公司人类遗传研究室的ullis等发明了具有划时代意义的聚合酶链反应。
其原理类似于DNA的体复制,只是在试管中给DNA的体外合成提供以致一种合适的条件---摸板DNA,寡核苷酸引物,DNA聚合酶,合适的缓冲体系,DNA变性、复性及延伸的温度与时间。
PCR的改进与完善 ullis最初使用的DNA聚合酶是大肠杆菌DNA聚合酶的Kleno片段,其缺点是:
①Kleno酶不耐高温,90℃会变性失活,每次循环都要重新加。
②引物链延伸反应在37℃下进行,容易发生模板和引物之间的碱基错配,其PCR产物特异性较差,合成的DNA片段不均一。
此种以Kleno酶催化的PCR技术虽较传统的基因扩增具备许多突出的优点,但由于Kleno酶不耐热,在DNA模板进行热变性时,会导致此酶钝化,每加入一次酶只能完成一个扩增反应周期,给PCR技术操作程序添了不少困难。
这使得PCR技术在一段时间没能引起生物医学界的足够重视。
1988年初,Keonog改用T4DNA聚合酶进行PCR,其扩增的DNA片段很均一,真实性也较高,只有所期望的一种DNA片段。
但每循环一次,仍需加入新酶。
1988年Siki等从温泉中分离的一株水生嗜热杆菌(ermusquius)中提取到一种耐热DNA聚合酶。
此酶具有以下特点:
①耐高温,在70℃下反应2后其残留活性大于原来的90%,在93℃下反应2后其残留活性是原来的60%,在95℃下反应2后其残留活性是原来的40%。
②在热变性时不会被钝化,不必在每次扩增反应后再加新酶。
③大大提高了扩增片段特异性和扩增效率,增加了扩增长度(20Kb)。
由于提高了扩增的特异性和效率,因而其灵敏性也大大提高。
为与大肠杆菌多聚酶Kleno片段区别,将此酶命名为TqDNA多聚酶(TqDNAPolymerse)。
此酶的发现使PCR广泛的被应用。
PCR技术基本原理
PCR技术的基本原理 类似于DNA的天然复制过程,其特异性依赖于与靶序列两端互补的寡核苷酸引物。
PCR由变性--退火--延伸三个基本反应步骤构成:
①模板DNA的变性:
模板DNA经加热至93℃左右一定时间后,使模板DNA双链或经PCR扩增形成的双链DNA解离,使之成为单链,以便它与引物结合,为下轮反应作准备;②模板DNA与引物的退火(复性):
模板DNA经加热变性成单链后,温度降至55℃左右,引物与模板DNA单链的互补序列配对结合;③引物的延伸:
DNA模板--引物结合物在TqDNA聚合酶的作用下,以dNTP为反应原料,靶序列为模板,按碱基配对与半保留复制原理,合成一条新的与模板DNA链互补的半保留复制链重复循环变性--退火--延伸三过程,就可获得更多的“半保留复制链”,而且这种新链又可成为下次循环的模板。
每完成一个循环需2~4分钟,2~3小时就能将待扩目的基因扩增放大几百万倍。
到达平台期(Pleu)所需循环次数取决于样品中模板的拷贝。
PCR的反应动力学 PCR的三个反应步骤反复进行,使DNA扩增量呈指数上升。
反应最终的DNA扩增量可用Y=(1+X)n计算。
Y代表DNA片段扩增后的拷贝数,X表示平(Y)均每次的扩增效率,n代表循环次数。
平均扩增效率的理论值为100%,但在实际反应中平均效率达不到理论值。
反应初期,靶序列DNA片段的增加呈指数形式,随着PCR产物的逐渐积累,被扩增的DNA片段不再呈指数增加,而进入线性增长期或静止期,即出现“停滞效应”,这种效应称平台期数、PCR扩增效率及DNA聚合酶PCR的种类和活性及非特异性产物的竟争等因素。
大多数情况下,平台期的到来是不可避免的。
PCR扩增产物 可分为长产物片段和短产物片段两部分。
短产物片段的长度严格地限定在两个引物链5’端之间,是需要扩增的特定片段。
短产物片段和长产物片段是由于引物所结合的模板不一样而形成的,以一个原始模板为例,在第一个反应周期中,以两条互补的DNA为模板,引物是从3’端开始延伸,其5’端是固定的,3’端则没有固定的止点,长短不一,这就是“长产物片段”。
进入第二周期后,引物除与原始模板结合外,还要同新合成的链(即“长产物片段”)结合。
引物在与新链结合时,由于新链模板的5’端序列是固定的,这就等于这次延伸的片段3’端被固定了止点,保证了新片段的起点和止点都限定于引物扩增序列以、形成长短一致的“短产物片段”。
不难看出“短产物片段”是按指数倍数增加,而“长产物片段”则以算术倍数增加,几乎可以忽略不计,这使得PCR的反应产物不需要再纯化,就能保证足够纯DNA片段供分析与检测用。
PCR反应体系与反应条件
标准的PCR反应体系:
10×扩增缓冲液 10ul
4种dNTP混合物 各200umolL
引物 各10~100mol
模板DNA 01~2ug
TqDNA聚合酶 25u
g2+ 15mmolL
加双或三蒸水至 100ul
PCR反应五要素:
参加PCR反应的物质主要有五种即引物、酶、dNTP、模板和g2+
引物:
引物是PCR特异性反应的关键,PCR产物的特异性取决于引物与模板DNA互补的程度。
理论上,只要知道任何一段模板DNA序列,就能按其设计互补的寡核苷酸链做引物,利用PCR就可将模板DNA在体外大量扩增。
设计引物应遵循以下原则:
①引物长度:
15-30b,常用为20b左右。
②引物扩增跨度:
以200-500b为宜,特定条件下可扩增长至10kb的片段。
③引物碱基:
G+C含量以40-60%为宜,G+C太少扩增效果不佳,G+C过多易出现非特异条带。
ATGC最好随机分布,避免5个以上的嘌呤或嘧啶核苷酸的成串排列。
④避免引物部出现二级结构,避免两条引物间互补,特别是3’端的互补,否则会形成引物二聚体,产生非特异的扩增条带。
⑤引物3’端的碱基,特别是最末及倒数第二个碱基,应严格要求配对,以避免因末端碱基不配对而导致PCR失败。
⑥引物中有或能加上合适的酶切位点,被扩增的靶序列最好有适宜的酶切位点,这对酶切分析或分子克隆很有好处。
⑦引物的特异性:
引物应与核酸序列数据库的其它序列无明显同源性。
引物量:
每条引物的浓度01~1umol或10~100mol,以最低引物量产生所需要的结果为好,引物浓度偏高会引起错配和非特异性扩增,且可增加引物之间形成二聚体的机会。
酶及其浓度 目前有两种TqDNA聚合酶供应,一种是从栖热水生杆菌中提纯的天然酶,另一种为大肠菌合成的基因工程酶。
催化一典型的PCR反应约需酶量25U(指总反应体积为100ul时),浓度过高可引起非特异性扩增,浓度过低则合成产物量减少。
dNTP的质量与浓度 dNTP的质量与浓度和PCR扩增效率有密切关系,dNTP粉呈颗粒状,如保存不当易变性失去生物学活性。
dNTP溶液呈酸性,使用时应配成高浓度后,以1NH或1Tris。
HCL的缓冲液将其PH调节到70~75,小量分装,-20℃冰冻保存。
多次冻融会使dNTP降解。
在PCR反应中,dNTP应为50~200umolL,尤其是注意4种dNTP的浓度要相等(等摩尔配制),如其中任何一种浓度不同于其它几种时(偏高或偏低),就会引起错配。
浓度过低又会降低PCR产物的产量。
dNTP能与g2+结合,使游离的g2+浓度降低。
模板(靶基因)核酸 模板核酸的量与纯化程度,是PCR成败与否的关键环节之一,传统的DNA纯化方法通常采用SDS和蛋白酶K来消化处理标本。
SDS的主要功能是:
溶解细胞膜上的脂类与蛋白质,因而溶解膜蛋白而破坏细胞膜,并解离细胞中的核蛋白,SDS还能与蛋白质结合而沉淀;蛋白酶K能水解消化蛋白质,特别是与DNA结合的组蛋白,再用有机溶剂酚与氯仿抽提掉蛋白质和其它细胞组份,用乙醇或异丙醇沉淀核酸。
提取的核酸即可作为模板用于PCR反应。
一般临床检测标本,可采用快速简便的方法溶解细胞,裂解病原体,消化除去染色体的蛋白质使靶基因游离,直接用于PCR扩增。
RNA模板提取一般采用异硫氰酸胍或蛋白酶K法,要防止RNse降解RNA。
g2+浓度 g2+对PCR扩增的特异性和产量有显著的影响,在一般的PCR反应中,各种dNTP浓度为200umolL时,g2+浓度为15~20mmolL为宜。
g2+浓度过高,反应特异性降低,出现非特异扩增,浓度过低会降低TqDNA聚合酶的活性,使反应产物减少。
PCR反应条件的选择
PCR反应条件为温度、时间和循环次数。
温度与时间的设置:
基于PCR原理三步骤而设置变性-退火-延伸三个温度点。
在标准反应中采用三温度点法,双链DNA在90~95℃变性,再迅速冷却至40~60℃,引物退火并结合到靶序列上,然后快速升温至70~75℃,在TqDNA聚合酶的作用下,使引物链沿模板延伸。
对于较短靶基因(长度为100~300b时)可采用二温度点法,除变性温度外、退火与延伸温度可合二为一,一般采用94℃变性,65℃左右退火与延伸(此温度TqDNA酶仍有较高的催化活性)。
①变性温度与时间:
变性温度低,解链不完全是导致PCR失败的最主要原因。
一般情况下,93℃~94℃lmin足以使模板DNA变性,若低于93℃则需延长时间,但温度不能过高,因为高温环境对酶的活性有影响。
此步若不能使靶基因模板或PCR产物完全变性,就会导致PCR失败。
②退火(复性)温度与时间:
退火温度是影响PCR特异性的较重要因素。
变性后温度快速冷却至40℃~60℃,可使引物和模板发生结合。
由于模板DNA比引物复杂得多,引物和模板之间的碰撞结合机会远远高于模板互补链之间的碰撞。
退火温度与时间,取决于引物的长度、碱基组成及其浓度,还有靶基序列的长度。
对于20个核苷酸,G+C含量约50%的引物,55℃为选择最适退火温度的起点较为理想。
引物的复性温度可通过以下公式帮助选择合适的温度:
Tm值(解链温度)=4(G+C)+2(A+T)
复性温度=Tm值-(5~10℃)
在Tm值允许围,选择较高的复性温度可大大减少引物和模板间的非特异性结合,提高PCR反应的特异性。
复性时间一般为30~60se,足以使引物与模板之间完全结合。
③延伸温度与时间:
TqDNA聚合酶的生物学活性:
70~80℃150核苷酸S酶分子
70℃60核苷酸S酶分子
55℃24核苷酸S酶分子
高于90℃时,DNA合成几乎不能进行。
PCR反应的延伸温度一般选择在70~75℃之间,常用温度为72℃,过高的延伸温度不利于引物和模板的结合。
PCR延伸反应的时间,可根据待扩增片段的长度而定,一般1Kb以的DNA片段,延伸时间1min是足够的。
3~4kb的靶序列需3~4min;扩增10Kb需延伸至15min。
延伸进间过长会导致非特异性扩增带的出现。
对低浓度模板的扩增,延伸时间要稍长些。
循环次数 循环次数决定PCR扩增程度。
PCR循环次数主要取决于模板DNA的浓度。
一般的循环次数选在30~40次之间,循环次数越多,非特异性产物的量亦随之增多。
PCR反应特点
特异性强PCR反应的特异性决定因素为:
①引物与模板DNA特异正确的结合;
②碱基配对原则;
③TqDNA聚合酶合成反应的忠实性;
④靶基因的特异性与保守性。
其中引物与模板的正确结合是关键。
引物与模板的结合及引物链的延伸是遵循碱基配对原则的。
聚合酶合成反应的忠实性及TqDNA聚合酶耐高温性,使反应中模板与引物的结合(复性)可以在较高的温度下进行,结合的特异性大大增加,被扩增的靶基因片段也就能保持很高的正确度。
再通过选择特异性和保守性高的靶基因区,其特异性程度就更高。
灵敏度高PCR产物的生成量是以指数方式增加的,能将皮克(g=10-12g)量级的起始待测模板扩增到微克(ug=10-6g)水平。
能从100万个细胞中检出一个靶细胞;在病毒的检测中,PCR的灵敏度可达3个RFU(空斑形成单位);在细菌学中最小检出率为3个细菌。
简便、快速PCR反应用耐高温的TqDNA聚合酶,一次性地将反应液加好后,即在DNA扩增液和水浴锅上进行变性-退火-延伸反应,一般在2~4小时完成扩增反应。
扩增产物一般用电泳分析,不一定要用同位素,无放射性污染、易推广。
对标本的纯度要求低不需要分离病毒或细菌及培养细胞,DNA粗制品及总RNA均可作为扩增模板。
可直接用临床标本如血液、体腔液、洗嗽液、毛发、细胞、活组织等粗制的DNA扩增检测。
PCR扩增产物分析
PCR产物是否为特异性扩增,其结果是否准确可靠,必须对其进行严格的分析与鉴定,才能得出正确的结论。
PCR产物的分析,可依据研究对象和目的不同而采用不同的分析方法。
凝胶电泳分析:
PCR产物电泳,EB溴乙锭染色紫外仪下观察,初步判断产物的特异性。
PCR产物片段的大小应与预计的一致,特别是多重PCR,应用多对引物,其产物片断都应符合预讦的大小,这是起码条件。
琼脂糖凝胶电泳:
通常应用1~2%的琼脂糖凝胶,供检测用。
聚丙烯酰胺凝胶电泳:
6~10%聚丙烯酰胺凝胶电泳分离效果比琼脂糖好,条带比较集中,可用于科研及检测分析。
酶切分析:
根据PCR产物中限制性切酶的位点,用相应的酶切、电泳分离后,获得符合理论的片段,此法既能进行产物的鉴定,又能对靶基因分型,还能进行变异性研究。
分子杂交:
分子杂交是检测PCR产物特异性的有力证据,也是检测PCR产物碱基突变的有效方法。
Souern印迹杂交:
在两引物之间另合成一条寡核苷酸链(部寡核苷酸)标记后做探针,与PCR产物杂交。
此法既可作特异性鉴定,又可以提高检测PCR产物的灵敏度,还可知其分子量及条带形状,主要用于科研。
斑点杂交:
将PCR产物点在硝酸纤维素膜或尼膜薄膜上,再用部寡核苷酸探针杂交,观察有无着色斑点,主要用于PCR产物特异性鉴定及变异分析。
核酸序列分析:
是检测PCR产物特异性的最可靠方法。
PCR常见题总结
PCR产物的电泳检测时间一般为48以,有些最好于当日电泳检测,大于48后带型不规则甚致消失。
假阴性,不出现扩增条带
PCR反应的关键环节有①模板核酸的制备,②引物的质量与特异性,③酶的质量及活性④PCR循环条件。
寻找原因亦应针对上述环节进行分析研究。
模板:
①模板中含有杂蛋白质,②模板中含有Tq酶抑制剂,③模板中蛋白质没有消化除净,特别是染色体中的组蛋白,④在提取制备模板时丢失过多,或吸入酚。
⑤模板核酸变性不彻底。
在酶和引物质量好时,不出现扩增带,极有可能是标本的消化处理,模板核酸提取过程出了毛病,因而要配制有效而稳定的消化处理液,其程序亦应固定不宜随意更改。
酶失活:
需更换新酶,或新旧两种酶同时使用,以分析是否因酶的活性丧失或不够而导致假阴性。
需注意的是有时忘加Tq酶或溴乙锭。
引物:
引物质量、引物的浓度、两条引物的浓度是否对称,是PCR失败或扩增条带不理想、容易弥散的常见原因。
有些批号的引物合成质量有题,两条引物一条浓度高,一条浓度低,造成低效率的不对称扩增,对策为:
①选定一个好的引物合成单位。
②引物的浓度不仅要看D值,更要注重引物原液做琼脂糖凝胶电泳,一定要有引物条带出现,而且两引物带的亮度应大体一致,如一条引物有条带,一条引物无条带,此时做PCR有可能失败,应和引物合成单位协商解决。
如一条引物亮度高,一条亮度低,在稀释引物时要平衡其浓度。
③引物应高浓度小量分装保存,防止多次冻融或长期放冰箱冷藏部分,导致引物变质降解失效。
④引物设计不合理,如引物长度不够,引物之间形成二聚体等。
g2+浓度:
g2+离子浓度对PCR扩增效率影响很大,浓度过高可降低PCR扩增的特异性,浓度过低则影响PCR扩增产量甚至使PCR扩增失败而不出扩增条带。
反应体积的改变:
通常进行PCR扩增采用的体积为20ul、30ul、50ul。
或100ul,应用多大体积进行PCR扩增,是根据科研和临床检测不同目的而设定,在做小体积如20ul后,再做大体积时,一定要模索条件,否则容易失败。
物理原因:
变性对PCR扩增来说相当重要,如变性温度低,变性时间短,极有可能出现假阴性;退