抑制破骨细胞生成及拮抗小鼠卵巢切除诱导骨量丢失 1.docx

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抑制破骨细胞生成及拮抗小鼠卵巢切除诱导骨量丢失1

1引言

骨稳态环境的动态平衡是破骨细胞的再吸收和成骨细胞的不断生成共同维系的结果（1,2），过度的破骨细胞活动会导致骨质疏松等骨代谢疾病

（2）。

骨质疏松症被认为是一种以骨量减少、骨组织构造异样、骨脆性及骨折增多为特性的慢性病症，现已变成世界性的公共卫生难题（3）。

当前世界有10.2亿左右的人口罹患上骨质疏松病症，预计到2030年，人数将增加至13.6亿（4）。

OPG/NF-κB激活RANK/RANKL复合物应是一个在骨新陈代谢中起极其重要调节作用的子系统，调控成骨细胞介导的骨基质制备以及破骨细胞介导的骨吸收进展的动态平衡（5）。

RANKL是一种与骨代谢有着密切联系的细胞因子，积极参加到破骨细胞的动态形成过程中，推动破骨细胞的成熟与分化（6）。

RANKL-RANKL复合物（RANKL受体）可以引发调节因子（如TRAF6基因）的秩监测分离及其随后的MAPK激活（7,8），从而上调NFATc1和c-Fos的表达水平，诱导破骨细胞的发生（9）。

OPG应是由成骨细胞分泌的可溶性蛋白质，借助和RANKL竞争结合的手段而进一步提高骨密度，达到抑制骨吸取的最终目标（10）。

RANKL/OPG的值能视为骨量与骨质安全的极其重要指标（11）。

因而，由RANKL管理控制的信号源通路可以成为骨细胞的生物降解等病症的药理靶点（12）。

抗过氧化物酶体增殖物激活受体γ（PPAR-γ）的药物因其阻碍多种癌细胞生长的巨大潜力而成为众多课题研究的对象。

PPAR-γ不仅介入到成骨细胞的生成过程中（13），同时其在破骨细胞中的表达水平也可以被彻底上调（14,15）。

PPAR-γ被公认为外源性药物的药理靶点（16），因为PPAR-γ特异性抑制剂导致骨吸收，从而导致骨吸收的增加（17,18）。

虽然在目前的一些研究工作中报道，PPAR-γ在破骨细胞诱导骨病变病理生理中的作用尚不清楚，尚待进一步阐明。

T0070907（T007；PubCheM数据库SID：

53790303）已被发现并证明是PPAR-γ的有效和高特异性的竞争对手（19）。

以往的体外研究表明T007对PPAR-γ有抑制作用（20）。

此外，T007还具有抑癌特性（21,22）。

例如，先前有研究显示T007调节PPAR-γ的表达以阻碍乳腺恶性肿瘤的发育和活力（21）。

并且，T007以PPAR途径（23）作为细胞粘附和侵袭的抑制剂，在特定肝癌细胞系中诱导失巢凋亡。

鉴于上述PPAR信号通路的调节特性，我们推测该基因可能代表了克服骨代谢疾病的新方法。

因此，我们的目的是探讨T007对破骨细胞的作用特性，尽可能破译T007介导的破骨细胞发生机制，并用小鼠卵巢切除模型检测T007对骨质疏松症骨丢失的治疗作用。

2材料与方法

2.1实验材料

2.1.1主要实验试剂与材料

试剂

生产厂家

α-MEM

R&D

重组小鼠RANKL、MCSF

R&D

FBS

美国Gibco-BRL

CCK-8

日本DojindoMolecular

T0070907

SelleckChemicals

抗体（PPAR-γ、β-tubulin）

Abcam公司

抗体（NFATc1、c-Fos、RANKL、OPG、GAPDH、β-actin）

CST

ChIP试剂盒

CST

DNA质粒

Genechem公司

小干扰RNA

Genechem公司

RNA提取试剂盒

Genechem公司

荧光定量PCR试剂盒

Genechem公司

PCR引物

Genechem公司

无水乙醇、氯仿、异丙醇、BCIP/NBT、RIPA缓冲液、Trizol

康为世纪

Lipofectamine3000

Invitrogen

PVDF膜

杭州弗德

ECL化学发光试剂

杭州弗德

TRAP、茜素红染色试剂盒

Sigma

维生素C

Sigma

β-glycerophosphate

Sigma

2.1.2主要仪器设备

仪器

生产厂家

-80℃超低温冰箱

Thermo

细胞培养箱

Thermo

细胞培养用超净台

Thermo

NanoDrop2000分光光度计

Thermo

7500定量实时PCR扩增仪

ABI

台式离心机

Heraeus

高分辨Micro-CT机

瑞士ScancoMedical

2.2实验方法

2.2.1原代细胞的分离提取与培养

1.骨髓巨噬细胞（BMMs）：

把6周龄左右大小的雌性C57BL/6小鼠,将其处死，在将整个小鼠置于75%乙醇中浸泡5分钟后取出，放在培养皿（10cm）中。

用已经完成灭菌的医用剪刀等器械将小鼠股骨和胫骨取下并尽量剔除附着的肌肉组织。

用1xPBS溶液清洗后，一手持眼科镊夹持股骨或胫骨，另一只手用医用眼科剪刀剪断股骨或者胫骨的两端，然后吸取1mlα-MEM完全培养基（10%血清+1%青霉素/链霉素+30ng/mLM-CSF），将骨髓血冲出到10cm培养皿中反复吹打混匀，48小时后放置在37°C、5%CO2的培养箱中培育。

2.骨髓间充质干细胞（BMSCs）：

取雌性C57BL/6小鼠（约2-4周龄）颈椎脱臼处死，将整个小鼠置于75%乙醇溶液中，需全覆盖于其中浸泡5min，浸泡结束后取出，使用无菌器具在无菌条件下操作，沿小鼠后肢踝关节剪开皮肤，并向髋部方向分离直至骶尾椎，取小鼠两侧股骨以及胫腓骨，将多余组织剔除，用1ml无菌注射器，反复抽取含有10%胎牛血清、1%青霉素/链霉素的DMEM培养基轻柔冲洗髓腔至少五次，并用1ml移液器反复吹打混匀骨髓血，将其吹打散开混匀再接种至25cm2培养瓶中，48小时后放置在37°C、5%CO2的培养箱中培育。

3.原代成骨细胞（OB）：

取一周龄新生C57BL/6小鼠的颅盖骨，以事先预冷的PBS溶液将其浸泡，而后将颅盖骨上附着的肌肉以及其他多与组织剔除干净，再用PBS对其冲洗3次，将其置入盛有10%血清、1%青霉素/链霉素DMEM培养基的培养皿中，剪成约0.8mm×0.8mm大小的碎块，加入0.25%胰蛋白酶10ml培育30分钟，之后再加入1.0g/LⅠ型胶原酶15ml培育1小时，取上清以1000rpm/分钟离心15分钟，使细胞沉淀，收集消化所得细胞，PBS洗三次，重悬细胞，均匀接种至25cm2培养瓶，放置于37°C，5%CO2的培养箱中，48小时后更换上述条件培养基并继续培育。

2.2.2CCK-8测定药物毒性范围

1.检测T007对BMMs的细胞毒性：

当提取的细胞达到80-90%的融合度时，吸弃上层培养液，用1xPBS缓冲液对其清洗3次，而后使用胰蛋白酶进行消化。

加入胰蛋白酶后，将培养皿放置在倒置显微镜下进行观察，当观察细胞出现变圆的倾向后，加入含10%血清培养基终止消化，随后将消化后的细胞刮下并转至一无菌15ml离心管中，而后800r/min室温离心5min。

离心结束后，使用移液器吸取上清液并丢弃，而后加入完全培养基，轻轻吹打细胞使细胞重悬，而后对细胞进行计数，以每孔2×104个细胞数接种于96孔板，并设置三个重复。

24小时后换液：

T007（0、0.0375、0.075、0.15、0.3、0.6、1.2、2.4、4.8、9.6μM）+30ng/mLM-CSF的培养基，继续培养48和96小时。

培养结束后在每孔中加入10μLCCK-8液体，放入摇床上混匀而后在37℃恒温箱中孵育2小时，孵育结束后，使用酶标仪检测450nm波长的OD值，并记录于册。

2.检测T007对BMSCs和OB的细胞毒性：

当提取的细胞达到80-90%的融合度时，吸弃上层培养基，加入适当胰蛋白酶消化。

加入胰蛋白酶后，将培养皿放置在倒置显微镜下进行观察，当观察细胞出现变圆的倾向后，加入混有10%血清的培养基停止消化，随后将消化后的细胞刮下并转至一无菌15ml离心管中，而后800r/min室温离心5min。

离心结束后，使用移液器吸取上清液并丢弃，而后加入完全培养基，轻轻吹打细胞使细胞重悬，而后对细胞进行计数，以每孔1.5×104个细胞数接种于96孔板，同时设置三个重复。

24小时后换液：

T007（0、0.078125、0.15625、0.3125、0.625、1.25、2.5、5、10、20μM）的新鲜培养基，加入培养基后继续在5%CO2恒温箱中培养48和96小时。

培养结束后在每孔中加入10μLCCK-8液体，放入摇床上混匀而后在37℃恒温箱中孵育2小时，孵育结束后，使用酶标仪检测450nm波长的OD值，并记录于册。

2.2.3细胞转染

2.2.3.1PPAR-γ过表达实验：

BMMs、OB和BMSCs细胞铺床以后密集程度高达80%-90%，使用Lipofectamine3000进行转染空白对照质粒和PPAR-γ质粒。

接着展开相应细胞的分化诱导实验。

主要操作如下：

1.转染前日，将细胞铺板于6/24/96孔板中，培育细胞至汇合度达90%左右；在新的1.5ml的EP管中将10/2.0/0.5μlLipo3000与250/50/25μlOpti-MEM培养基充分混匀成A管，室温静置5分钟；将250/50/25μlOpti-MEM和4.0/0.8/0.2μgPPAR-γ/空白对照质粒混匀于另一灭菌1.5mlEP管中（B管）。

将A、B两管混合，室温孵育15-20分钟；

2.再将以上混合溶液分别置于6/24/96孔板中，并分别向其中添加足量培养基，总容量分别为2000μl、500μl以及100μl；于转染24-72小时后进行细胞分化实验。

同时提取RNA，使用荧光定量PCR验证过表达效率；提取蛋白质，通过免疫印迹检测过表达效率。

2.2.3.2PPAR-γ沉默实验：

BMMs、OB和BMSCs细胞铺床以后密集程度高达30%，用Lipofectamine3000进行转染对照siRNA和PPAR-γsiRNA。

主要操作如下：

1.转染前日，将细胞种植于6/24/96孔板中，培育细胞至汇合度达30-50%；在一新的1.5mlEP管中将5.0/1.0/1.2/0.25μlLipo3000与250/50/25μlOpti-MEM培养基充分混匀；在另一1.5mlEP管中将250/50/25μlOpti-MEM和100/20/5pmolsiRNA/NegativeControl放在摇床上摇晃，使其成分充分混匀。

将稀释后的siRNA/NegativeControl添加到已稀释的Lipo3000试剂中，而后放置在室温条件下进行孵育，时间为15-20分钟。

2.孵育结束后，将所得混合溶液充分混匀后添加至6孔板、24孔板以及96孔板中，并分别向其中添加足量培养基，总容量分别为2000μl、500μl以及100μl；于转染24-72小时后进行细胞分化实验。

同时提取组织RNA，使用荧光定量PCR对沉默进行验证；提取蛋白质，通过免疫印迹检测沉默效率。

2.2.4体外破骨细胞分化实验

将BMMs以8×103个细胞每孔的密度种入96孔板，并设置三个重复。

次日使用移液器弃去上清液，将30ng/mL新鲜的完全培养基（成分为：

M-CSF+50ng/mLRANKL+T007（0、0.15、0.3、0.6μM）加入其中，隔日更换培养基，培养至破骨细胞形成，使用移液器转移上清液，在使用PBS缓冲液将细胞冲洗3遍，动作需轻柔，然后将4%多聚甲醛加入其中对其进行固定，固定时间为20分钟。

固定结束后，再次吸取4%多聚甲醛固定液并弃去，使用PBS缓冲液冲洗3次，动作轻柔，实验开始前需配制TRAP溶液，待固定以及清洗结束后将TRAP染液加入其中，而后将细胞放到37℃恒温箱中孵育染色。

待染色结束，弃去TRAP染色液，并用PBS缓冲液轻轻的洗一遍。

置于光学显微镜下进行观察并拍照并进行数据分析。

2.2.5骨吸收实验

BMMs细胞计数后以8×103/孔提前接种于96孔板中的牛骨片→24小时后更换为含有30ng/mLM-CSF、50ng/mlRANKL和T007（0、0.15、0.3、0.6μM）的培养基分别进行分化诱导→隔日更换上述条件培养基→弃掉培养基，用1XPBS缓冲液洗涤三次→取出牛骨片，而后使用软毛刷擦拭牛骨片，动作需轻柔，而后使用PBS缓冲液冲洗牛骨片3次→待牛骨片表面干燥后，用显微镜或扫描仪对牛骨片表面已着色矿化结节进行观察或扫描→使用ImageJ分析软件（NationalInstitutesofHealth，NIH）分析牛骨片表面矿化结节面积大小。

2.2.6体外骨髓间充质细胞与原代成骨细胞分化实验

BMSCs/OB细胞接种于12孔板，24小时后换液：

（10%血清+50μg/mL抗坏血酸+10mMβ-甘油磷酸钠+不同浓度T007（0、0.075、0.15、0.5μM）的DMEM培养基），隔日更换培养基。

培养第7天，使用移液器去除旧培养基，再次使用PBS缓冲液对其进行清洗3次，然后将4%多聚甲醛添加于其中，对其进行固定，室温固定30分钟，再次弃上清，用PBS缓冲液清洗三次，之后使用BCIP/NBT试剂盒对成骨细胞活性指标碱性磷酸酶（ALP）活性进行检测；培养第21天弃上清，用PBS缓冲液洗三遍，然后用4%多聚甲醛溶液室温浸泡30分钟固定细胞。

弃上清，用PBS缓冲液对其清洗三遍，而后使用1.5%茜素红（ARS）染色（PH4.2）对成骨细胞矿化沉积能力进行评估。

2.2.7RNA提取与实时荧光定量PCR实验

2.2.7.1RNA提取：

提取总RNA

RNeasyMini试剂盒

逆转录

PrimeScriptRTMasterMix试剂盒

荧光定量PCR

SYBRGreenQPCRMasterMix试剂盒

1.细胞按照相应处理方式培养结束后，弃掉上清，用预冷PBS缓冲液冲洗3次，动作需轻柔。

按照每10cm2面积想其中加入1mlTRIzonReagent，使用移液器对其进行反复吹打使其均匀并且样本可充分裂解，再室温静置3分钟；

2.按照TRIzonReagent：

氯仿=1：

200的比例混合试剂，将混合试剂放置于涡旋震荡仪剧烈震荡，充分混匀后再室温放置3分钟；而后将所有试剂放置于4℃、12000r/min离心机中离心10min，而后吸取上层水相病将其放置于新的无菌无酶离心管中；

3.向新的RNase-Free离心管中加入同等体积的70%乙醇（RNase-FreeWater配制），充分颠倒混匀。

之后转移到装有吸附柱的采集管里（吸附柱上含有Resin合成树脂，具有吸附DNA的功能），在4℃，12000r/min离心机中离心15s，而后将采集管中液体倒出，吸附柱保留，并再次装入至采集管中；

4.继续加入700μl的缓冲液RW1，4°离心12,000rpm15秒，弃废液，把吸附柱重新放于原采集管中。

然后加入缓冲液RW2500μl，4℃，12000r/min离心15s，将采集管中液体倒掉，保留吸附柱，并放入采集管中。

而后再次重复步骤1次，再次以4℃，12000r/min离心机离心3min，再次倒出废液并丢弃，将吸附柱室温静置5分钟；

5.把吸附柱放置在另一无酶无菌的离心管中，并将40μl无酶水放入吸附柱中间部位，而后将吸附柱室温放置2分钟，以4℃，12000r/min离心机离心1min，离心结束后，将RNA溶液收集，使用酶标仪测定RNA标本OD值并记录。

将RNA样本继续逆转录为cDNA为后续实验准备或者放于-80℃长期保存。

2.2.7.2RNA逆转录：

采用20μl反应体系，根据试剂盒说明书在冰上配制；反应条件设置为：

42℃，15分钟孵育；85℃，5分钟孵育。

逆转录结束后，取出产物并进行后续的荧光定量PCR实验。

表2.1逆转录体系

试剂

20μl反应体系

dNTPMix,2.5mMEach

4μl

PrimerMix

2μl

RNATemplate

Xμl

5×RTBuffer

4μl

DTT,0.1M

2μl

HiFiScript,200U/μl

1μl

RNase-FreeWater

使总容积达到20μl

2.2.7.3实时荧光定量PCR：

根据表2.2配置相应的q-PCR反应体系，各种引物序列见表2.3。

反应结束后制作标准曲线，并用2−ΔΔCT法计算相对表达量等。

表2.2实时荧光定量PCR配置体系

试剂

10μl反应体系

2×UltraSYBRMixture

5μl

ForwardPrimer,10μM

2μl

ReversePrimer,10μM

2μl

TemplateDNA

2μl

ddH2O

总容积达到10μl

表2.3实时荧光定量PCR引物序列

Genes

Forwardstream（5′-3′）

Reversestream（5′-3′）

GAPDH

ACCCAGAAGACTGTGGATGG

CACATTGGGGGTAGGAACAC

CTSK

CTTCCAATACGTGCAGCAGA

TCTTCAGGGCTTTCTCGTTC

c-Fos

CCAGTCAAGAGCATCAGCAA

AAGTAGTGCAGCCCGGAGTA

NFATc1

CCGTTGCTTCCAAAAATAACA

TGTGGGATGTGAACTCGGAA

Atp6v0d2

GACCCTGTGGCACTTTTTGTATTC

GCTTGCATTTGGGGAATCTATC

Dc-stamp

AAAACCCTTGGGCTGTTCTT

AATCATGGACGACTCCTTGG

ALP

CCAACTCTTTTGTGCCAGAGA

GGCTACATTGGTGTTGAGCTTTT

OCN

GAGGGCAATAAGGTAGTGAACAG

AAGCCATACTGGTTTGATAGCTCG

Runx2

TTCTCCAACCCACGAATGCAC

CAGGTACGTGTGGTAGTGAGT

Acp5

TCCGTGCTCGGCGATGGACCAGA

CTGGAGTGCACGATGCCAGCGAC

OSX

GCTGCAAGCTCTCCATAACC

GCCAGAAGCTGTGAAACCTC

Col1a

TCAGACCACGGACGCCATCT

CGGCAACGATGGTGCTAAGG

OPG

TGGAGAGGTAGAAAAGGCACA

CAAACACACTCTTGGCACCAC

RANKL

GCCAGTGGGAGATGTTAG

TTAGCTGCAAGTTTTCCC

2.2.8免疫印迹实验

1.提取细胞总蛋白：

收集待检测的细胞，弃去培养基，用预冷PBS缓冲液清洗三遍后，加入混有PMSF和磷酸酶抑制剂的RIPA裂解液，于冰上裂解30分钟。

将得到的裂解液体全部移至1.5ml离心管中，4℃12000rpm，离心15分钟，再装到新的1.5ml离心管中。

之后取上清液，按照表2.4完成蛋白浓度的测定：

表2.4BCA测蛋白浓度加样表

ABCD

EFGH

标准PBS

20191816

12840

曲线BSA

0124

8121620

BCA

200200200200

200200200200

样品PBS

19191919

19191919

样品

1111

1111

BCA

200200200200

200200200200

备注：

BSA：

0.5mg/ml（取25mg/mlBSA标准品20μl加入980μl稀释液）；

BCA：

（A：

B=50：

1）

2.SDS-PAGE电泳：

取上清加入4×SDS-PAGE上样缓冲液，充分混匀后在95-100℃水浴锅中煮样5-10分钟，-20℃备用。

按照表2.5配制PAGE胶。

然后将上述蛋白样品进行电泳。

上样每孔约10-20μl。

开始电泳时保持浓缩胶的电压为70-90V，当蛋白样品移至分离胶时，电压调校为100-150V。

当电泳染料抵至胶底部时，关闭电源并准备转膜。

表2.510%分离胶和4%浓缩胶

试剂

10%分离胶（10ml）

4%浓缩胶（5ml）

10%SDS

150μl

75μl

10%AP

150μl

75μl

1.5MTris·HCL（pH8.8）

3.8ml

-

1.0MTris·HCL（pH6.8）

-

0.9375ml

30%丙烯酰胺

5ml

1.22ml

TEMED

6μl

7.5μl

DDH2O

5.9ml

5.16ml

3.转膜：

裁剪一块与凝胶大小相似的PVDF膜（一般为6厘米×9厘米大小），使用无水甲醇将PVDF膜精抛1min，激活。

而后将准备好的6层滤纸放入转膜液中浸泡浸润，转膜夹按照阳极至阴极顺序依次安装转膜装置。

转膜夹设置好后将其夹紧，而后放入电泳仪中，并向其中添加入足量转膜缓冲液，盖上电泳仪盖，并在电泳仪外围放入足量的碎冰，防止转膜过程中产生的巨大热量使机器融化。

准备完毕后，打开电源，转膜电流设置为250mA，转膜时间设置为120min。

表2.6电泳以及转膜缓冲液配制

试剂

电泳缓冲液

转膜缓冲液

甘氨酸

18.8g

2.9g

SDS

1g

0.37g

Trisbase

3.02g

5.8g

甲醇

-

200ml

DDH2O

1000ml

800ml

4.封闭：

取出PVDF膜并放入5%脱脂牛奶中（TBS-T配制），室温置于摇床上缓缓摇动，封闭1小时即可。

5.孵育一抗：

封闭结束后，将PVDF膜取出，使用TBS-T缓冲液清洗PVDF膜一遍。

随后将膜取出并进行裁剪。

然后将裁剪后的PVDF膜均匀放入抗体孵育盒中，将使用一抗稀释液稀释的一抗足量放入抗体孵育盒中，而后将抗体孵育盒放在水平摇床上，在4°C冰箱中的摇晃孵育过夜。

6.孵育二抗：

取出在4°C冰箱孵育过夜抗体孵育盒，而后将PVDF膜收集转入新抗体孵育盒中，使用TBST溶液将PVDF膜冲洗，每次冲洗时放置在水平摇床之上摇晃，每次清洗时间为15min。

清洗结束后，将PVDF膜浸入配制好的不同种属的二抗中（与一抗相对应），室温摇床缓慢孵育1小时。

7.显影曝光：

完成二抗孵育，将PVDF膜取出，室温摇床上TBS-T缓冲液洗膜三次，每次15分钟。

随后用ECL发光液检测蛋白条带，使用ImageJ软件定量灰度值。

2.2.9免疫荧光实验

1.细胞爬片制作：

备一六孔板，将细胞爬片专用圆片放于其中，而后将使用胰蛋白酶消化的细胞进行计数，再次放入六孔板中，在培养箱中培养24h；需要对细胞进行处理，并且对其进行适量的刺激；

2.固定与破膜：

培养以及适当的处理结束后，使用移液器将六孔板中旧培养基弃去，使用PBS缓冲液将六孔板清洗3次，清洗结束后将4%多聚甲醛倒入其中对其进行固定，30min后倒出，再次使用PBS缓冲液对其进行清洗3次；破膜：

将0.1%的Triton溶液加入至六孔板中，，室温下轻柔吹打20min，而后将溶液倒出，使用PBS缓冲液清洗3次；

3.封闭：

向六孔板中加入含10%封闭用山羊血清的封闭液（组成：

100μl山羊血清原液+900μlPBS），在室温环境下放置封闭60min。

（注意：

封闭前细胞不可过于干燥，应在弃掉PBS液体后立即加入）；

4.抗体孵育：

一抗：

抗体孵育前，按照一定比例配制一抗。

封闭结束后，将封闭液倒掉。

而后加入足量一抗，将其放入4℃冰箱中摇晃孵育过夜；二抗：

按照一定比例配制二抗。

一抗孵育结束后，转