西华基因工程原理与技术复习题.docx

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西华基因工程原理与技术复习题

基因工程原理与技术

一．名词解释

（1）顺反子（cistron）：

基因所对应的一段核苷酸序列被称为顺反子（cistron），一个顺反子编码一种完整的多肽链。

它是遗传的功能单位。

（2）顺式作用元件（cis-actingelements），指那些与结构基因表达调控相关、能够被基因调控蛋白特异性识别和结合的DNA序列。

包括启动子、上游启动子元件、增强子、加尾信号和一些反应元件等。

（3）反式作用因子（trans-actingelements），可结合顺式作用元件而调节基因转录活性的蛋白质因子称为反式作用因子（trans-actingelements）。

（4）锌指（zincfingers）结构，由约30个氨基酸残基组成的一段多肽序列，其中4个氨基酸残基（两个是半脱氨酸两个是组氨酸，或4个都是半脱氨酸）以配位键与Zn2+相互结合，形成指状结构，常存在于真核转录因子的DNA结合结构域中。

（5）亮氨酸拉链（leucinezippers），是指在一段肽链中每隔7个氨基酸残基就有一个亮氨酸残基，这段肽链所形成的α-螺旋就会出现一个由亮氨酸残基组成的疏水面，而另一面则是由亲水性氨基酸残基所构成的亲水面。

由亮氨酸残基组成的疏水面即为亮氨酸拉链条，两个具有亮氨酸拉链条的反式作用因子，能借疏水作用形成二聚体。

（6）反向PCR:

用于扩增位于靶DNA区段之外的两侧的未知DNA序列。

（7）不对称PCR：

可用于制备单链模板DNA。

这种方法除了使用的两种引物浓度相差100倍之外，其它方面与标准的PCR并没有本质的区别。

（8）多重PCR技术：

即在同一试管中加入多对引物，扩增同一模板的几个区域。

二．简答题

1.简述乳糖操纵子中CAP的正性调节作用机制。

降解物基因活化蛋白（catabolitegeneactivationprotein，CAP）是一种同二聚体，其分子内有DNA结合区和cAMP结合位点。

CAP与cAMP结合形成复合物才能刺激操纵子结构基因的转录。

当葡萄糖浓度低时，会使cAMP浓度升高，形成cAMP-CAP复合物，并与启动子上游的CAP位点结合，刺激RNA聚合酶的转录作用，使转录效率提高50倍，然而这种作用的前提条件是无阻遏效应存在。

当葡萄糖浓度较高时，cAMP浓度降低，cAMP与CAP结合受阻，转录效率下降，由此可见，乳糖操纵子结构基因的高表达既需要有诱导剂的存在（消除阻遏效应），又要求无葡萄糖或低浓度葡萄糖的条件（促进cAMP-CAP复合物的形成，刺激转录）。

2.简述真核表达调控的主要环节和调控方式。

（一）DNA水平的调控：

（1）染色质结构对基因表达的调控作用，

（2）基因修饰，（3）基因重排，（4）基因扩增。

（二）转录水平的调控（转录起始的调控）

（1）反式作用因子的活性调节；

（2）反式作用因子与顺式元件的结合；（3）反式作用因子的组合式调控作用

（三）转录后水平调控

（1）“加帽”和“加尾”的调控；

（2）mRNA选择性剪接对表达的调控；（3）RNA编辑的调控；（4）mRNA转运调节

（四）翻译水平的调控

（1）翻译起始调控；

（2）mRNA稳定性对翻译的影响

（五）翻译后水平的调控

（1）信号肽的切除；

（2）新生肽链的修饰；（3）肽链的剪接与正确折叠

3.核酸分离纯化应注意哪些事项？

一般的分离纯化分为哪些步骤？

各步的要点是什么？

分离纯化核酸应注意：

①应保证核酸一级结构的完整性，防止降解；②排除其它分子的污染。

为了保证核酸结构与功能的研究，完整的一级结构是最基本的要求，因为遗传信息全部贮存在一级结构之内。

保持核酸的完整性，即保持其天然状态。

细胞内的核酸酶活力很高，在制取过程中必须防止核酸酶对核酸的降解。

③防止化学因素（酸碱等）和物理因素（高温或机械剪切等）引起核酸变性或破坏。

制备RNA要特别注意防止核酸酶的作用，因为RNase分布很广，活力很高；而对DNA更重要的是防止张力剪切作用，因为DNA分子特别长，容易断裂。

核酸的纯化：

①首先是去除蛋白质。

要点：

从细胞裂解液等复杂的分子混合物中纯化核酸，要先用某些蛋白水解酶消化大部分蛋白质后，再用有机溶剂抽提。

从核酸溶液中去除蛋白质常用酚/氯仿抽提法，在氯仿中加入少许异戊醇的目的在于减少蛋白质变性操作过程中产生的气泡。

②用氯仿抽提处理，去除核酸溶液中的痕量酚。

要点：

如果下一步骤中酶反应的条件要求严格，最可靠的方法是再用水饱和的乙醚抽提一次，以彻底去除核酸样品中的痕量酚与氯仿，然后在68℃水浴中放置10分钟使痕量乙醚蒸发掉。

4.哪些因素会影响RNA的提取简述与DNA提取的不同之处

影响因素：

样品细胞或组织的有效破碎有效地使核蛋白复合体变性解离对RNA酶的有效抑制有效地将RNA从DNA和蛋白质混合物中分离对于多糖含量高的样品还要采取措施有效去除多糖杂质抑制RNA酶活性不同之处：

RNA分子量小，集中于细胞质中，易分解。

DNA分子量较大，集中于细胞核中，化学性质稳定。

在提取RNA过程中必须放置RNA的降解。

而DNA比较“皮实”而且得破核

5.影响PCR效率的因素有哪些，试分析单次PCR是否可以实现DNA量的无限扩增？

引物：

引物是PCR特异性反应的关键，PCR产物的特异性取决于引物与摸板DNA互补的程度酶及其浓度：

目前有两种TaqDNA聚合酶供应，一种是从栖热水生杆菌中提纯的天然酶，一种是大肠杆菌合成的基因工程酶，催化一典型的PCR反应约需酶量2.5U（指总反应体积为100ul时），浓度过高可引起非特异性扩增，浓度过低则合成产物量减少。

dNTP的质量与浓度：

dNTP的质量与浓度和PCR扩增效率有密切关系，在PCR反应中，dNTP应为50～200umol/L，尤其是注意4种dNTP的浓度要相等（等摩尔配制），如其中任何一种浓度不同于其它几种时（偏高或偏低），就会引起错配。

浓度过低又会降低PCR产物的产量。

dNTP能与Mg2+结合，使游离的Mg2+浓度降低。

模板（靶基因）核酸模板核酸的量与纯化程度，是PCR成败与否的关键环节之一，RNA模板提取一般采用异硫氰酸胍或蛋白酶K法，要防止RNase降解RNA。

Mg2+浓度Mg2+对PCR扩增的特异性和产量有显著的影响，在一般的PCR反应中，各种dNTP浓度为200umol/L时，Mg2+浓度为1.5～2.0mmol/L为宜温度与时间的设置：

基于PCR原理三步骤而设置变性-退火-延伸三个温度点。

循环次数循环次数决定PCR扩增程度。

不能实现，PCR要经过多次重复循环，才能实现DNA量的无限扩增

6.PCR反应的基本原理是什么？

每个循环包括哪些步骤？

有何应用价值？

PCR反应的基本原理：

首先是双链DNA分子在临近沸点的温度下加热时便会分离成两条单链的DNA分子，然后DNA聚合酶以单链DNA为模板并利用反应混合物中的四种脱氧核苷三磷酸（dNTPs）合成新生的DNA互补链。

此外，DNA聚合酶同样需要有一小段单链DNA来启动（“引导”）新链的合成。

每一个温度循环周期均是由高温变性、低温退火及适温延伸等三个步骤组成。

应用价值：

PCR技术不仅可以用来扩增与分离目的基因，而且在临床医疗诊断、胎儿性别鉴定、癌症治疗的监控、基因突变与检测、分子进化研究，以及法医学等诸多领域都有着重要的应用。

7.PCR的引物设计应遵守哪些原则？

如何对体系反应条件按优化？

原则：

①PCR引物合成的DNA片段通常长15~25碱基，其中G＋C约占50%。

②在设计时必须特别注意引物之间不能互配形成双链结构，引物内部也不能形成发夹结构。

③引物的3’末端必须与目的片段完全相配。

④引物的5’末端可以不与目的片段互补，可以包含内切酶位点或启动子序列，但在下一轮反应中，这些序列会被同样合成。

有时在扩增仅知其表达产物的目的片段时，可以在引物中设计成简并密码子。

体系反应条件按优化：

①首先是使模板DNA解离成为单链，这个过程可以通过加热完成，在90~95℃条件下，根据模板DNA复杂程度，调整变性温度和时间。

一般情况下选择94℃，30秒可使各种复杂的DNA分子完全变性。

过高温度或高温持续时间过长，会对TaqDNA聚合酶活性和dNTP分子造成损害。

②变性后的DNA迅速冷却至40~60℃，可使引物和模板DNA发生结合。

③复性温度的选择，可以根据引物的长度及其G＋C含量确定。

长度在15~25bp之间时，引物的退火温度可通过Tm=4（G＋C）＋2（A＋T）计算得到。

④PCR反应的延伸温度建议选择的70~75℃之间，此时，TaqDNA聚合酶具有最高活性。

当引物在16个核苷酸以下时，过高的延伸温度不利于引物和模板的结合。

此时，可采用使反应温度缓慢升高到70~75℃的方法。

⑤PCR延伸反应的时间，可根据待扩增片段的长度而定，一般1kb以内的片段，延伸时间1分钟即可；扩增片段在1kb以上则需加长延伸时间。

⑥其他参数选定后，PCR循环次数主要取决于模板DNA的浓度。

理论上20~25次循环之后，PCR产物的积累即可达到最大值，实际操作中因此不管模板浓度是多少，20~30次是比较合理的循环次数。

8.简述核酸杂交的基本过程，核酸印迹转膜有哪些方法?

核酸杂交的基本过程：

将核酸从细胞中分离纯化后，在体外与探针杂交，或直接在细胞内进行杂交的过程。

核酸印迹转膜有：

Southern印迹杂交、Northern印迹杂交、斑点杂交及狭缝印迹杂交。

9、利用逆转录酶和mRNA模板合成cDNA的主要步骤是什么？

答：

（１）以具有poly（A）结构的mRNA做模板，并以12—18个碱基长的多聚胸腺嘧啶寡核苷酸oligo（dT）片段作引物，在逆转录酶的5′-3′聚合酶活性催化下，合成出与模版mRNA的单链互补的cDNA单链。

具有poly（A）结构的mRNA是采用一定的抽提方法从生物体内分离纯化而来，在mRNA单链的3′端是由一连串碱基A组成的多腺嘌呤尾巴。

胸腺嘧啶可以与腺嘌呤配对互补，所以采用oligo（dT）做引物，与mRNA3′端的poly（A）尾巴结合。

（2）碱水解法除去mRNA模板之后，单链cDNA能够自我折叠形成发夹环结构，折叠的短链即成为第二条cDNA链合成的引物，反转录酶或Klenow酶就可催化第二条链cDNA合成。

（3）采用SI核酸酶消化法，除去单链区的发夹环结构，就可将获得完整的DNA分子。

10.BR322为例，论述质粒载体必须具备哪些条件？

（1）具有复制起点，在宿主细胞中能自主复制。

（2）带有尽可能多的单一限制性酶切位点，以供外源DNA片段定点插入。

（3）具有合适的选择标记基因，为宿主细胞提供易于检测的表型特征。

（4）具有较小的分子量和较高的拷贝数。

11.简述表达载体需要哪些基本元件？

各有什么作用？

在克隆载体的基础上，表达载体的构成特别强调与表达强弱相关的构成元件如启动子、终止子、核糖体结合位点等。

（1）启动子：

启动子位于转录起始点上游，是DNA链上一段能与RNA聚合酶结合并能起始mRNA合成的序列，是启动基因转录所必需的一段DNA顺式调控元件。

没有启动子，基因就不能转录。

（2）终止子：

在一个基因的3′端或是一个操纵子的3′端往往还有一特定的核苷酸序列，它有终止转录的功能，这一DNA序列称为转录终止子（terminator）。

在构建表达载体时，为了防止由于克隆的外源基因的表达干扰了载体系统的稳定性，一般都在多克隆位点的下游插入一段很强的核糖体RNA的转录终止子。

（3）核糖体结合位点：

核糖体（rRNA）是蛋白质合成的场所，mRNA有效地翻译依赖于mRNA的稳定性及其与核糖体结合的能力。

1.分离纯化基因工程菌的表达产物策略的制定要考虑哪些因素？

①表达系统的影响；②表达产物性质的影响；③初始物料、杂质等因素的影响；④生产工艺、生产条件的影响。

12.什么是RBS？

RBS在基因表达中有何作用？

RBS，即核糖体结合位点，是指紧靠启动子下游的，从转录起始位点开始延伸几十个碱基长度的一段序列，翻译起始密码子AUG通常位于它的中心位置，是核糖体RNA识别与结合的位点。

作用：

SD序列是翻译起始密码子（AUG）上游5-13个核苷酸处的一段富含嘌呤UAAGGAGGU的全部或者其中的一部分序列，在翻译起始阶段与核糖体小亚基16SrRNA的3’端相互作用，以正确定位起始密码子。

13.基因工程菌发酵与传统发酵相比有什么特点

发酵产物生成的代谢途径不同：

普通微生物是自身基因表达的结果，基因工程菌外源基因表达的结果遗传不稳定性：

工业化培养中比实验室培养产物得率低，菌体细胞繁殖过程中表现出性状不稳定其他特点：

生产规模小，设备自动化程度高，产品附加值高，生产利润大

13.外源基因在原核生物中表达时，蛋白质的存在形式有哪些？

各有什么优缺点？

1包涵体表达：

优点：

包涵体的形成有利于防止宿主蛋白酶对表达蛋白的降解。

缺点：

包涵体形成后，表达蛋白不具有生物活性，因此必须溶解包涵体并对表达蛋白进行复性；另外，由于表达产物形成包涵体，负责水解起始密码子编码的甲硫氨酸的水解酶，不能对所有的表达蛋白质都起作用，这样就可能产生N-末端带有甲硫氨酸的目的蛋白质的衍生物，而非生物体内的天然蛋白，这可能会对某些蛋白质的性质产生影响。

②分泌型表达：

优点：

简化了发酵后处理的纯化工艺；减少了外源蛋白在细胞内被蛋白酶降解的几率；通过对分泌表达的设计有利于形成正确的空间构象，获得有较好生物学活性或免疫原性的蛋白质。

③融合型表达：

优点：

能以较高的效率进行，因为受体菌自身蛋白基因的SD序列和碱基组成等有利于基因的表达。

外源蛋白以融合蛋白的方式表达时易于分离分离纯化，可根据受体菌蛋白的结构和功能特点，利用受体菌蛋白的特异性抗体、配体或底物亲和层析等技术分离纯化融合蛋白，然后通过蛋白酶水解或化学法特异性裂解受体菌蛋白与外源蛋白之间的肽键，获得纯化的外源蛋白产物。

15.重组质粒发生逃逸的原因有哪些？

1重组质粒在细胞分裂时不均匀分配，造成受体菌种所含的重组质粒拷贝数存在差异；

2来自受体细胞的遗传影响；

3重组质粒所携带的外源基因过度表达，抑制了受体细胞的正常生长，以致原来体系中数目极少的不含重组质粒的菌体经过若干代繁殖后在数量上占据优势；

④重组质粒因种种原因被受体细胞分泌运输至胞外，这种情况多发生在细菌处于高温或含表面活性剂（如SDS）、某些药物（如利福平）以及染料（如吖啶类）的环境中。

16.对作为表达目标蛋白宿主的酵母细胞有什么基本要求？

答：

对作为表达目标蛋白宿主的酵母细胞的基本要求是

①安全无毒，没有致病性。

②遗传背景清楚，容易进行遗传操作。

③外源DNA容易导入宿主细胞，转化效率高。

④培养条件简单，容易进行高密度发酵。

⑤有较强的蛋白质分泌能力。

⑥有类似高等真核生物的蛋白质翻译后的修饰加工能力。

17.提高外源基因在酵母中的表达水平，考虑从哪些方面入手？

答：

为提高外源基因在酵母中的表达水平，可以考虑从以下方面入手：

一、转录水平控制

外源基因在酵母中的表达和基因的转录水平有密切的关系，筛选高效的启动子就显得十分重要，强启动子还可以表达多种基因。

二、表达载体的拷贝数和稳定性

表达载体在细胞中的拷贝数对外源基因在酵母中的表达有明显的影响。

酿酒酵母和其他一些酵母有多拷贝的内源质粒，以这类质粒为基础可以建成高拷贝质粒表达载体。

三、其他因素

还有一些因素应该考虑，其中包括采取提高翻译效率的措施，如：

优化翻译起始区前后mRNA的二级结构，在外源基因中尽量选用酵母偏爱的密码子等；避免表达产物在细胞内的降解；选择或改造宿主，如：

采用二倍体宿主、采用酿酒酵母以外的酵母菌作为宿主；优化工程菌发酵工艺，如：

提高发酵密度、控制发酵阶段和发酵时间等等。

四、酵母表达系统的新的应用方向

近年来，酵母表达系统除了用来高效表达外源基因，获得基因工程产品外，还开辟了一些新的应用方向。

（1）．用于人类基因组研究。

（2）．用于分析蛋白质相互作用。

（3）．用于蛋白质、药物、抗体等的快速筛选。

18.讲述农杆菌介导转基因的主要步骤？

合适外植体的选择及再生系统的建立

抗生素筛选压的确定及农杆菌菌株的选择

叶盘（或其他外植体）预培养（1～5天，非必须）

农杆菌侵染（数秒、分钟）

共培养（2—3天）

推迟筛选或筛选（培养基中加入抑菌抗生素和选择抗生素）

抗性芽的获得

选择抗生素（如Km）中生根

转基因植株的获得

分子生物学检测

19.基因诊断的原理及特点

基本原理检测相关基因的结构及其表达功能特别是RNA产物是否正常，由于DNA的突变，缺失，插入，到位和基因融合等均可造成相关基因结构变异，因此，可以通过各种手段直接从DNA水平上检测上述的变化和利用连锁方法进行分析，这就是DNA诊断

特点以探测基因为目标，属于“病因诊断”，针对性强，特异性高由于检测技术十分敏感，故诊断灵敏度相当高由于基因探针或引物可为任何来源，任何种类，所以适应性强，诊断范围广在感染性疾病的基因诊断中，不仅可检出正在生长的病原体，也能检出潜伏的病原体；既能确定既往感染，也能确定现行感染；既能诊断普通菌株或病毒，又能检出变异株；同时能对那些不能在体外培养的和不能再实验室安全培养的病原体作出诊断，所以大大扩大了诊断范围

20.抑制性差减杂交的优缺点

优点：

假阳性率低高敏感性速度快效率高实验结果复杂程度低

缺点：

每次只能比较两种样品之间基因表达的差异依赖较高的RsaI消化效率和接头连接效率起始材料需要微克极量的mRNA，差减克隆片段较小，获取cDNA全长序列有一定难度所研究的材料差异性不宜太大最好是只有细微差别

21.简述mRNA差异显示技术的基本原理和流程

原理：

以一对细胞或组织的总DNA反转录而成的cDNA为模板，利用PCR的高效扩增，通过5‘端与3’端引物的合理设计和组合，将细胞中表达的约15000种基因片段直接显示在DNA测序胶上，从而找出一对细胞中表达有差异的cDNA片段

流程：

1.总RNA的提取（见Northern杂交）2.第一链合成：

3.dd-PCR4．电泳和放射自显影5．差异条带回收再扩增6．以PCR产物为探针，标记后进行Northern杂交，证实基因的真实性。

7．PCR产物的TA克隆。

8．DNA序列测定。

9．检索分析。