分子实验室细胞实验室常用配方.docx

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分子实验室细胞实验室常用配方

（一）WB相关试剂及常用缓冲液

●RIPA（100mI）（最后要调pH为7.4）

终浓度

分子量

称取

Tris-HCI（pH7.4）

50mM

121.14

605.7mg

NaCI

150mM

58.44

876.6mg

TritonX-100

1%

1mI

脱氧胆酸钠

1%

1g

EDTA

1mM

292.248

29.2248mg

SDS

0.1%

0.1g

PMSF（100mM）

使用时每1ml加10ul

●10%过硫酸铵溶液AP（分装保存于-20度）

AP粉末1g

ddH2010ml

●10％SDS（十二烷基硫酸钠）：

SDS粉末10g

ddH20定容到100ml

注意：

用磁力搅拌器搅拌不会容易起泡泡

●6X蛋白质samplebuffer

Tris-HCl（1M,pH6.8）30mL

SDS10g

甘油30mL

DTT（154.25）9.3g

溴酚蓝0.06g

ddH20定容至100mL

●10XPBS缓冲液的配制：

NaCl80g

KCl2g

Na2HPO414.4g（十二水合36g）

KH2PO402.4g

加800mLddH2O,根据开始的pH用NaOH或HCL调pH到7.4，调好pH再定容到1升。

配好后用高压蒸气灭菌后常温保存最好是在4度

●PBST（1X）

PBS（1X）500ml

Tween20500μl

●50×Tris-乙酸（TAE）缓冲液配制1L溶液各成分的用量

●Tris粉末242g

冰醋酸57.1ml

Na2EDTA·2H2O37.2g

ddH20定容到1L

●封闭液

脱脂奶粉5g

叠氮钠0.02g（现配现用时可不加）

PBS定容到100mL

●染色液（室温）

1L

500ml

200ml

100ml

甲醇

500mL

250

100

50

乙酸

100mL

50

20

10

R250考马斯亮蓝

0.5g

0.25g

0.1g

0.05g

H20

400mL

200

80

40

●脱色液：

（室温）

甲醇165mL

乙酸50mL

H20785mL

●8.8Buffer:

（调pH至8.8,4度保存）

100ml

200ml

Tris

18.17g

36.34g

10%SDS

4mL

8ml

ddH20

定容至100mL

200ml

●6.8Buffer:

（调pH至6.8,4度保存）

100ml

200ml

Tris

6．06g

12.12g

10%SDS

4mL

8ml

ddH20

定容至100mL

200ml

●转移缓冲液（10×transbuffer）：

（常温保存）

1L

2L

甘氨酸

144g

288g

Tris粉末

30.3g

60.6

ddH20

定容至1L

定容至2L

使用时甲醇200mL

转移缓冲液（10×）100mL

ddH20700mL

●电泳缓冲液（10×）（runningbuffer）：

（常温保存）

1L

2L

甘氨酸

144g

288g

Tris粉末

30.3g

60.6

SDS

10g

20g

ddH20

定容至1L

定容至2L

●10Х）TBS:

（常温保存）

NaCl80.0g

Tris粉末24.2g

ddH20定容至1L

●TBST（1X）

TBS（1X）500ml

Tween20500μl

●Strippingbuffer（可反复利用）温老师组配方

10%SDS10ml

Β-巯基乙醇350μl

Tris-HCI（pH6.8）6.25ml（6.06加到50mL水）

加入ddH2O至50mL

●Strippingbuffer（可反复利用）郭老师给配方

甘氨酸15g

SDS1g

Tween201ml

ddddH2O1L

作这个buffer洗20min，然后用PBST洗3次，再重新封闭孵抗体。

（二）细胞和细菌培养基、抗生素

●LB培养基（当天灭菌后放4度存放）

1000ml

500ml

300ml

250ml

200ml

氯化钠

10g

5g

3g

2.5g

2g

蛋白胨

10g

5g

3g

2.5g

2g

酵母提取物

5g

2.5g

1.5g

1.25g

1g

ddH20

定容至1000ml

定容至500ml

定容至300ml

定容至250ml

定容至200ml

●LB平板：

（当天灭菌后倒平板，放4度存放）

1000ml

500ml

300ml

250ml

200ml

氯化钠

10g

5g

3g

2.5g

2g

蛋白胨

10g

5g

3g

2.5g

2g

酵母提取物

5g

2.5g

1.5g

1.25g

1g

琼脂

15g

7.5g

4.5g

3.725g

3g

ddH20

定容至1000ml

定容至500ml

定容至300ml

定容至250ml

定容至200ml

●SOB培养基

将下列组分溶解在0.9L水中：

蛋白胨20g

酵母提取物5g

氯化钠0.5g

1mol/L氯化钾2.5ml

用水补足体积到1L。

分成100ml的小份，高压灭菌。

培养基冷却到室温后，再在每100ml的小份中加1ml灭过菌的1mol/L氯化镁

●1MIPTG（异丙基硫代-β-D-半乳糖苷（分子量为238.3））溶液

IPTG粉末2.383g

ddH20定容到10ml

用0.22μm滤器过滤除菌，分装成1ml小份贮存于-20℃。

●Amp+（50mg/ml）

Amp+粉末50mg

ddH201ml

注意：

分装保存于-20度，使用时按1000：

1的比例用

●Kana+（50mg/ml）

Kana+粉末50mg

ddH201ml

注意：

分装保存于-20度，使用时按1000：

1的比例用

●胰酶：

抽滤，长期保存可放负20度

粉末0.25g

EDTA0.02-0.03g

1XPBS100ml

●高糖DMEM培养基：

抽滤保存在4度

粉末全部

碳酸氢钠3.7g

ddH20定容到1L（用盐酸调pH值到：

7.2-7.4）

●G418母液（100mg/ml）用0.22μM滤菌，分装存于-20度

粉末1g

PBS10ml

●zeocin母液（100mg/ml）用0.22μM滤菌，分装存于-20度

粉末1g

ddH2O10ml

●Blasticidin（100mg/ml）用0.22μM滤菌，分装存于-20度

粉末0.3g

PBS10ml

（三）利用His-tag从细菌中纯化蛋白配方

透析液配方

终浓度

母液浓度

量取体积

Tris-HCl（pH:

8.0）

20mM

1M

20ml

NaCl

20mM

4M

5ml

MgCl2

2mM

1M

2ml

DTT

1mM

1M

1ml

甘油

50%

500ml

ddH2O

472ml

●超声裂解液（lysisbuffer）：

2011年做蛋白纯化时用

Na3PO4（164）8.2g（50mM）

NaCl（58.5）17.55g（300mM）

加800mLddH2O溶解，用2MNaOH或者2MHCL调pH到8.0，再定容到1升。

配好后用高压蒸气灭菌后常温保存。

●洗涤液（washbuffer）：

2011年做蛋白纯化时用

Na3PO48.2g（50mM）

NaCl17.55g（300mM）

咪唑0.681g（10mM）

加800mLddH2O溶解,根据开始的pH用2MNaOH或者2MHCL调pH到8.0，调好pH再定容到1升

●洗脱液（elutionbuffer）：

2011年做蛋白纯化时用

Na3PO48.2g（50mM）

NaCl17.55g（300mM）

咪唑17.025g（250mM）

加800mLddH2O溶解,根据开始的pH用2MNaOH或者2MHCL调pH到8.0，调好pH再定容到1升）

PrepEase®Histidine-TaggedProteinPurificationKits-HighSpecificity

●8XLEWBuffer（Lysis-Equilibrium-WashBuffer）：

（室温保存）pH：

8.0

NaH2PO4.2H2O6.2404g（400mM）

NaCl14.0256g（2.4M）

dH20定容到100mL（调节pH：

8.0）

●4XElutionBuffer：

（室温保存）pH：

8.0

NaH2PO4.2H2O3.1202g（200mM）

NaCl7.0128g（1.2M）

咪唑6.81g（1M）

dH20定容到100mL（调节pH：

8.0）

●EDTA:

（100mM）

EDTA2.923g

dH20定容到100mL

●NiSO4:

NiSO4.6H2O2.6285g（100mM）

dH20定容到100mL

●溶菌酶：

（使用时1ml溶液加入20ul）

粉末50mg

ddH201mL

（四）利用His-tag从细胞中富集蛋白配方

●磷酸钠缓冲液

按图示比例混合0.2MNa2HPO4溶液和0.2MNaH2PO4溶液，得到两种缓冲液，pH分别调节成为8.0和6.3.

pH

0.2MNa2HPO4体积/mL

0.2MNaH2PO4体积/mL

6.3

11.25

38.75

8.0

47.35

2.65

●细胞裂解液（最好新鲜配制，当天使用）

Celllysisbuffer

终浓度

配10ml

配15ml

配20ml

配40ml

配30ml

盐酸胍（g）

6M

5.7318

8.5977

11.4636

22.9272

17.1954

Tris（g）

10mM

0.012114

0.018171

0.024228

0.048456

0.036342

pH8.0buffer（ml）

100mM

5

7.5

10

20

15

（注意胍盐是有害试剂注意这里用的磷酸钠缓冲液pH必须8.0!

）

（注意二价阳离子螯合剂，还原剂，会导致镍从树脂上的洗脱）

本实验的所有试剂中EDTA浓度不得超过1mM,DTT浓度不超过5mM，巯基乙醇浓度不超过20mM。

●pH8.0的洗脱溶液（最好新鲜配制，当天使用）

pH8.0的washbuffer

终浓度

配100ml

配50ml

配20ml

配40ml

配30ml

Urea尿素（g）

8M

48.048

24.024

9.6096

19.2192

14.4144

Tris（g）

10mM

0.12114

0.06057

0.024228

0.048456

0.036342

pH8.0Na3PO4buffer（ml）

100mM

50

25

10

20

15

TritonX-100（ul）

0.1%（vol/vol）

100

50

20

40

30

b-mercaptoethanol.巯基乙醇（ul）

5mM

35

17.5

7

14

10.5

●pH6.3washbuffer（现配现用）

pH6.3的washbuffer

终浓度

100ml

配50ml

配30ml

pH6.3的washbuffer

Urea尿素（g）

8M

48.048

24.024

14.4144

Urea尿素（g）

Tris（g）

10mM

0.12114

0.06057

0.036342

Tris（g）

pH6.3Na3PO4buffer（ml）

100mM

50

25

15

pH6.3Na3PO4buffer（ml）

TritonX-100（ul）

0.1%（vol/vol）

100

50

30

TritonX-100（ul）

注意使用pH为6.3的磷酸缓冲液，而且pH不得低于6，pH要精确配制，非常重要！

Histidine的质子化，会导致镍树脂上的解离，所以要精确测定pH，并且以pH试纸校对，而不是仅仅依靠pH仪器。

●洗脱溶液

200mMImidazole咪唑，

5%（wt/vol）SDS，

150mMTris-HCl（pH6.7）

30%（vol/vol）丙三醇

720mM巯基乙醇

0.0025%（wt/vol）溴酚蓝

注意wt/vol是质量/体积之比例，而vol/vol是体积：

体积的比例。

（五）双向电泳溶液配制

●水化上样缓冲液（I）：

尿素（8M）4.805g

CHAPS（4%）0.4g

DTT（65mM）0.098g（现加）

Bio-Lyte0.2%（w/v）50μI（40%现加）

溴酚蓝0.001%10μI（1%溴酚蓝）

MilliQ水定容到10mI,分装成10小管，-20度冰箱保存

●上样缓冲液（II）：

尿素（7M）4.2g

硫脲（2M）1.52g

CHAPS（4%）0.4g

DTT（65mM）0.098g（现加）

Bio-Lyte0.2%（w/v）50μI（40%现加）

溴酚蓝0.001%10μI（1%溴酚蓝）

MilliQ水定容到10mI,分装成10小管，-20度冰箱保存

●上样缓冲液（III）

尿素（5M）3g

硫脲（2M）1.52g

CHAPS（2%）0.2g

SB3-10（2%）0.2g

DTT（65mM）0.098g（现加）

Bio-Lyte0.2%（w/v）50μI（40%现加）

溴酚蓝0.001%10μI（1%溴酚蓝）

MilliQ水定容到10mI,分装成10小管，-20度冰箱保存

●平衡缓冲液母液

尿素（6M）36g

SDS（2%）2g

Tris-HCI（pH8.8）0.375M25mI（1.5M）

甘油（20%）20mI

MilliQ水定容到100mI，分装10管，-20度保存

●胶条平衡缓冲液I（充分混匀，用时现配）

胶条平衡缓冲液母液10mI

DTT0.2g

●胶条平衡缓冲液II（充分混匀，用时现配）

胶条平衡缓冲母液10mI

碘乙酰胺0.25g

●低熔点琼脂糖封闭液

低熔点琼脂糖0.5%0.5g

Tris（25mM）0.303g

甘氨酸（192mM）1.44g

SDS（0.1%）1mI（10%SDS）

溴酚蓝（0.001%）100μI（1%溴酚蓝）

MilliQ水定容到100mI,加热溶解至澄清，室温保存

（六）同位素实验相关试剂

●BERreactionbuffer（10ml,分装于-20度）

分子量

配10ml母液

称取

终浓度

Hepes-KOH（pH7.8）

238.31

1M称2.3831g

0.4mI

40mM

KCI

74.55

1.4M称1.0437g

0.5mI

70mM

DTT

154.25

1M称1.5425g

10μI

1mM

EDTA·2Na

372.23

1M称3.7223g

5μI

0.5mM

MgCI2·6H2O

203.30

1.4M称2.8462g

50μI

7mM

ATP

100mM

0.2mI

2mM

ddH2O

8.835mI

●2XligaseIactivitybuffer

终浓度

母液

配10ml取

Hepes（pH7.5）

60mM

1M

0.6ml

KCl

60mM

1M

0.6ml

MgCI2·6H2O

16mM

1M

0.16ml

DTT

2mM

1M

0.02ml

BSA

200μg/ml

2mg

ddH2O

至10ml

●2XAnnealingbuffer

Tris-HCI（pH7.5-8.0）20mM

NaCI100mM

EDTA2mM

●2X同位素反应buffer（polymerasebeta聚合反应）

终浓度

母液

10ml

Tris-HCl

100mM（pH8.0）

1M

1ml

MgCI2·6H2O

20mM

1M

0.2ml

DTT

4mM

1M

0.04ml

NaCl

40mM

4M

0.4ml

甘油

20%

2ml

ddH2O

至10ml

●2XAPE1活力鉴定buffer

终浓度

母液

配10ml

Trls-HCL（pH8.0）

100mM

1M

1ml

KCl

60mM

1M

0.6ml

MgCl2·6H2O

10mM

1M

0.1ml

甘油

20%

2ml

ddH2O

至10ml

●同位素电泳上样buffer（2X）（100ml）

终浓度

取

甲酰胺染料

90%

90ml

EDTA·Na2

30mM

111.669gX10-2

溴酚蓝（17kd）

0.02%

0.02g

二甲苯蓝

0.02%

0.02g

●10XTBEbuffer

Tris0.89M26.945g

硼酸（pH8.3）0.89M13.757g

Na2EDTA20mM1.86115g

●15%DenaturedDNAPAGEgel（100ml）

10XTBE15ml

40%,19:

1gelstock37.5ml

ddH2O16ml

Urea48g

存放在4度，使用前加200μl10%AP和20μlTEMED

●20%DenaturedDNAPAGEgel

10XTBE15ml

40%,19:

1gelstock50ml

ddH2O3.5ml

Urea（尿素）48g

存放于4度，使用前取35ml混合液加140μl10%AP和140μlTEMED

●硼氢化钠（1M）37.83

粉末0.7566g

ddH2O10ml

●2XdRPbuffer（分装保存于负20度）

分子量

母液

终浓度

配10ml

Hepes（pH7.5）

238.31

1M

100mM

1ml

MgCl2·6H2O

203.30

1M

20mM

0.2ml

KCl

74.55

1M

40mM

0.4ml

DTT

154.25

1M

4mM

0.04ml

ddH2O

8.36ml

●DNAbindingbuffer

终浓度

母液

分子量

配250ml

Tris-HCI（pH8.0）

50mM

1M

12.5

NaCl

100mM

58.3

1.4625g

MgCl2·6H2O

10mM

203.3

0.51g

Glycerol

10%

25ml

NP-40

0.1%

0.25ml

（七）酶切打质谱相关配方

NH4HCO3（79.06）100mM

粉末0.7906g

ddH2O定容到100ml,pH7.8-8.0

DTT（154.25g）100mM

粉末0.01542g

ddH2O1ml

IAA（碘乙酰胺，184.96）200mM

粉末0.036992g

ddH2O1ml

（八）其他配方

●2XHEPES-缓冲液（潘老师给的配方做细胞转染，需要调pH为7.05，用0.22μM滤菌，分装存于-20度）。

分子量

终浓度

称取

NaCI

58.5

280mM

1.6g

KCI

74.55

10mM

0.074g

Na2HPO4

141.96

1.5mM

0.021g

葡萄糖

180.06

12mM

0.21g

HEPES

238.31

50mM

1.19g

ddH20

定容到80ml

●CaCI2·2H2O（2M）147.02潘老师给的配方做细胞转染

粉末5.88g

ddH2O20ml

0.22μm滤菌，分装存于-20度

●5XTBS（1L体系）（在利用flagtag带磁珠的抗体富集蛋白时用）

Tris-HCI（250mM）30.275g

NaCI（750mM）43.875g

ddH20定容至1L（调节pH为7.4）

●MMS甲磺酸甲酯（Sigma密度为1.3g/mI,M=110.13）

1M体系：

液体85μIddH2O915μI

●Hochest

母液：

1mg/ml,避光存于-20度

工作液：

母液按1:

1000稀释

●TritonX-100（0.2%）

TritonX-1002μl

ddH2O1ml

●2XHDMbuffe（II）曾用于LSD1去甲基化

终浓度

母液

配10ml取

Tris（pH8.5）

100mM

1M

1ml

KCl

100mM

1M

1ml

MgCI2·6H2O

10mM

1M

0.1ml

BSA

1%

0.1g

甘油

5%

1ml

ddH2O

6.9ml

100mmol/LPMSF（苯甲基磺酰氟）：

分成贮存于-20℃。

PMSF粉末1.742g

异丙醇/甲醇定容到10ml

【注意】PMSF严重损害呼吸道粘膜、眼睛及皮肤，吸入、吞进或通过皮肤吸收后有致命危险。

一旦眼睛或皮肤接触了PMSF，应立即用大量水冲洗之。

凡被PMSF污染的衣物应予丢弃。

●5mol/L氯化钠（NaCl）：

氯化钠29.2g

ddH20定容到100ml

●2.5％X－gal（5-溴-4-氯-3-吲哚－β-半乳糖苷）：

X-gal25mg

二甲基甲酰胺（DMF）1ml

注意：

用铝箔包裹装液管，贮存-20℃。

●DEPC（焦碳酸二乙酯）处理水

●加100ulDEPC于100ml水中，使D